Summary
Bien que le système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes après une blessure, on en sait peu sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. L'utilisation en direct, le poisson-zèbre transgénique et un essai de section du nerf reproductible, nous pouvons étudier les comportements des cellules gliales dynamiques au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération.
Abstract
Le système nerveux est souvent décrite comme une composante câblé du corps, même si elle est un système d'organe considérablement fluide qui réagit à des stimuli externes, d'une manière stéréotypée cohérente, tout en conservant une incroyable souplesse et la plasticité. Contrairement au système nerveux central (SNC), du système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes, mais nous avons à peine commencé à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. En utilisant le poisson zèbre comme un système modèle, nous avons l'occasion sans précédent d'études régénératrices conjoints avec l'imagerie in vivo et les manipulations génétiques. Les nerfs périphériques sont constitués d'axones entourés par des couches de cellules gliales et du tissu conjonctif. Les axones sont ensheathed par myélinisants ou non-myélinisation des cellules de Schwann, qui sont à leur tour enveloppé dans un fascicule d'une gaine cellulaire appelée la perineurium. Suite à une blessure, les nerfs périphériques adultes ont la capacité remarquable à remove endommagé débris axonale et les objectifs re-innervent. Afin d'étudier le rôle des cellules gliales tout périphérique dans PNS régénération, nous décrivons ici un essai de dissection transversale de l'axone qui utilise un laser à colorant pompé l'azote disponible dans le commerce à axotomize nerfs moteurs chez le poisson zèbre transgénique en direct. Nous décrivons plus loin les méthodes de coupler ces expériences à l'imagerie time-lapse de nerfs blessés et de contrôle. Ce paradigme expérimental peut être utilisé non seulement pour évaluer le rôle que jouent les cellules gliales dans la régénération des nerfs, mais peut aussi être la plate-forme pour élucider les mécanismes moléculaires qui régissent la réparation du système nerveux.
Introduction
Le poisson zèbre ont été largement utilisées pour étudier le développement du système nerveux en raison de leur transparence optique et la facilité de la transgénèse, qui, lorsqu'il est couplé, pour permettre l'imagerie spectaculaire des comportements cellulaires dynamiques dans un embryon vivant. En outre, parce que le poisson-zèbre et les mammifères partagent presque tous les gènes nécessaires à la formation du système nerveux, l'information cellulaire et moléculaire collectées dans cet organisme modèle est directement rattachables à d'autres espèces de vertébrés. Même si incroyablement puissant pour les études du développement neural, le poisson zèbre et ses attributs uniques ont le potentiel pour élucider aussi les mécanismes qui maintiennent et reconstruire le système nerveux après une blessure. Les larves de poisson zèbre maintenir leur translucidité dans les stades larvaires fin et la pigmentation peut être effectivement bloqué soit avec l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de la production de mélanine ou des mutants génétiques qui manquent cellules pigmentaires. Ainsi, en utilisant cet organisme modèle pour étudier les blessures et Regeneration chez les animaux âgés est possible et offre l'opportunité unique d'étudier directement les mécanismes cellulaires et moléculaires qui reconstruire le système nerveux. Dans ce manuscrit, nous décrivons comment blesser de manière efficace et reproductible nerfs dans les PNS de larves de poisson zèbre. Ce paradigme de la blessure elle-même prête à étudier non seulement la dégénérescence, mais aussi les réponses de la glie périphérique et les cellules immunitaires ainsi que les interactions entre ces populations au cours de la régénération.
Le PNS est un réseau complexe de nerfs moteurs et sensoriels qui est nécessaire pour transmettre des informations entre le système nerveux central (SNC) et la peau, les organes et les muscles du corps, permettant un organisme d'interagir avec son environnement et survivre. Le long de ces nerfs, la glie périphérique, y compris les cellules myélinisation et non myélinisants Schwann et gliales perineurial, ainsi que les tissus conjonctifs, enferment les axones et en définitive constituer le nerf mature. Blessure de ces nerfs initie un processus kurnommée Wallerian dégénérescence 10. Ce mécanisme de fragmentation axonale, le recrutement immunitaire, déblaiement des décombres et la régénération est très stéréotypé et génétiquement réglementé 1. Des études antérieures chez les mammifères ont décrit les rôles des cellules de Schwann au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération 1, 2, 6, 8. Dans ces études de tissu fixe ou culture de cellules, les cellules de Schwann non seulement recrutés macrophages au site de la lésion afin d'aider à déblaiement des décombres, mais aussi aidé à la myéline se phagocytose. Bien que ces études ont été incroyablement instructif, nous n'avons jamais avant réponses gliales visualisés à une lésion axonale périphérique in vivo en temps réel, et pas d'autres études ont examiné la relation entre les différentes classes de la glie périphérique lors de ces événements.
Récemment, plusieurs laboratoires ont étudié la dégénérescence Wallerian utilisant le poisson zèbre et les blessures de l'axone laser à médiation similaire à ce que nous décrivons ici
Pour ce faire, nous transect nerfs moteurs à 6 et après la fécondation de 7 jours (DPF) de larves et de visualiser les réponses des populations gliales individuelles ainsi que d'enquêter sur les interactions entre ces populations le long des axones blessés. Utilisation double et triple tralignes nsgenic que la glie périphérique de l'étiquette, y compris les cellules de Schwann et gliales perineurial, ainsi que d'un marqueur pour les axones, nous utilisons un système d'ablation laser disponibles dans le commerce consistant en un atome d'azote pompé par laser à colorant (longueur d'onde 435 nm) attaché à un système confocal à disque rotatif pour créer transections axone. Cela permet expérimental de visualiser en direct, le poisson-zèbre larvaire, blesser voies axonales moteurs périphériques spécifiques et l'image time-lapse les réponses des populations gliales distinctes d'une blessure axonale et leur relation à l'autre. Ce protocole peut être plus adapté pour créer des blessures nerveuses chez le poisson zèbre d'âges différents, avec différentes lignées transgéniques ou des mutants génétiques pour aborder différentes questions scientifiques.
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Protocol
1. Préparation et montage des embryons de poisson zèbre pour l'ablation et l'imagerie en direct
- Préparer un stock de 0,8% agarose bas point de fusion dans l'eau oeuf. Aliquote en 13X tubes de culture jetables de 100 mm et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
- Poisson zèbre adulte Cross contenant des transgènes intégrés de façon stable à étiqueter fluorescence neurones moteurs et types de cellules gliales d'intérêt. Recueillir embryons de poisson zèbre en eau d'œuf et placer dans un incubateur 28,5 ° C pour la bonne mise en scène plus tard 3.
- A environ 24 fécondation post h (HPF), éliminer l'eau de l'oeuf et ajouter 0,002% 1-phényl 2-thiourée (PTU) dans l'eau de l'œuf. Retour embryons dans l'incubateur.
- Entre 24 et 96 HPF, les embryons doivent être examinés pour détecter la présence de transgènes souhaités sur un microscope à dissection fluorescent. Placez embryons sélectionnés dans l'eau d'œuf PTU frais et revenir à l'incubateur.
- Lorsque les larves ont atteint 6 jours après la fécondation (DPF) (ou l'âge désiré), retirez-les de l'incubateur, Sélectionnez quelques larves pour le montage, et de les transférer dans un plat plus petit.
- Retirer l'eau de la vaisselle et remplacez-les immédiatement avec environ 0,02% Tricane dans l'eau d'œuf PTU. Permettre aux larves de s'asseoir dans anesthésique environ 5 min.
- Placer une aliquote de 0,8% agarose bas point de fusion dans un bécher avec de l'eau du robinet et micro-ondes pendant 30 secondes ou jusqu'à ce que l'agarose est fondu. Laisser le bécher refroidir jusqu'à ce que l'agarose dans le tube de culture se sent tiède au toucher (pas trop chaude).
- Sélectionnez une larve d'anesthésie et de le transférer à un seul ou à plusieurs puits mm plat à fond de verre 35. Éliminer toute l'eau qui a été transféré à la larve, puis couvrir immédiatement la larve avec suffisamment d'agarose chaude pour remplir la partie à fond de verre du plat mais pas créer un grand dôme.
- Comme durcit le agarose, utilisez une aiguille à dissection pour positionner la larve de son côté au fond du plat, puis inclinez la larve légèrement sur son dos. Il est impératif pour les blessures et l'imagerie ultérieure, quila larve monté être en contact avec le verre sur le fond de la boîte. Utilisez l'aiguille à dissection pour maintenir la larve dans cette position jusqu'à ce que l'agarose est solidifié et la larve est immobilisé.
- Une fois que l'agarose est complètement durci, une pipette lentement l'eau Tricane assez (ce peut être le même Tricane utilisé pour l'anesthésie) dans le plat pour couvrir complètement l'agarose et les larves.
2. Calibration laser et d'essais
- Mettez tous les instruments confocale de microscope, des diodes lasers appropriés pour transgènes de poisson zèbre passionnants, et l'azote pompé par laser à colorant. Assurez-vous que le faisceau "blanc" splitter est en place, l'atténuateur laser est complètement ouvert, et le nm cellule de colorant de coumarine 435 est en place. Sur l'ordinateur, ouvrez le logiciel d'imagerie.
- Déplacer un 1.2NA objectif à immersion dans l'eau 63x en place et appliquer une petite goutte de milieu d'immersion pour objectifs d'eau sur l'objectif. Un objectif 63x permet une bonne précision de l'ablation laser et l'eau iMMERSION permet une plus grande distance de travail, ce qui est nécessaire lorsque l'on travaille avec DPF poisson zèbre larves 6-7.
- Obtenir une lame de verre avec un côté miroir à utiliser pour la calibration du laser. Placer la lame, côté miroir vers le bas, sur la scène du microscope.
- Utilisation de l'oculaire sous fond clair illumination, trouver et mettre l'accent sur une égratignure ou gravure dans le miroir. Le fond clair sera brillait sur la lame de verre, mais seulement passer à travers l'objectif dans des endroits où la glace a été rayés ou gravé loin, provoquant le miroir pour regarder noir à travers l'oculaire, et les gravures pour ressembler à des taches ou des lignes de lumière.
- Voir et concentrer les eaux-fortes sur l'écran de l'ordinateur en utilisant un logiciel d'imagerie. Ouvrez la fenêtre qui contrôle la calibration du laser et les paramètres d'alimentation. Définir le nombre d'impulsions à "1" et la plaque d'atténuation de la transmission "3"%. Le nombre d'impulsions correspond au nombre de fois que le laser se déclenche à l'intérieur de chaque région d'intérêt (ROI) et le% de transmission représente la puissance du laser. Assurez-vous que le paramètre de calibrage correct est sélectionné pour le 1.2NA objectif à immersion dans l'eau 63x.
- Sélectionnez l'outil Ellipse de la barre d'outils principale, puis cliquez sur l'image sur l'écran de l'ordinateur pour créer un seul ROI circulaire. Pour ce faire, 3 fois jusqu'à ce qu'il n'y 4 ROI circulaire espacés de manière aléatoire sur l'image.
- Certains systèmes peuvent comporter un dispositif de sécurité qui ne permettra pas le laser à feu si le trajet de la lumière pour les oculaires est ouvert. Si c'est le cas, fermez manuellement le chemin de lumière pour les oculaires en ce moment.
- Mettez le feu au laser. Cela va créer 4 petites gravures sur place, 1 dans chaque ROI circulaire. Si le laser ne se déclenche pas, vérifiez que le laser est allumé et connecté correctement et que le trajet de la lumière pour les oculaires est fermé. Si les tirs laser, mais pas de gravure est vu, vérifiez que le "blanc" diviseur de faisceau est en place. Si tout est en place, d'augmenter la puissance du laser et «FRAP» jusqu'à ce que l'eau-forte are visible. Si une puissance laser de réglage supérieur à 10 est nécessaire pour graver le verre, ce qui peut indiquer la cartouche plasma laser doit être remplacé.
- Si les taches apparaissent gravés centré dans la ROI sélectionnée, aucun étalonnage n'est nécessaire (passer à 2.12). Si les taches ne sont pas centrés, le paramètre de calibrage doit être mis à jour.
- Pour calibrer, cliquez sur la mise à jour la configuration de calibrage. Le laser se déclenche et une image apparaît contenant un seul point gravé. Si le point n'apparaît pas, annuler le calibrage, augmenter la puissance du laser, et démarrer le calibrage à nouveau.
- Cliquez dans le centre de la tache. Le laser se déclenche à nouveau, et un autre point apparaît. Cliquez sur ce point, et répéter ce processus jusqu'à ce que l'étalonnage est terminé et 9 points apparaissent dans un mode grille. Répétez les étapes 2.6 à 2.9 pour vérifier que l'étalonnage a réussi.
- Retirez la lame de verre de la platine du microscope et nettoyer l'objectif. Ouvrez le trajet de la lumière à l'UCOlars, et remplacer le diviseur de faisceau "blanc" avec le "100% ILL" séparateur de faisceaux.
3. section du nerf par ablation laser et Time-lapse imagerie confocale de comportements de cellules gliales
- Retirez le stade utilisé pour maintenir la lame de verre et de le remplacer par un stade approprié pour la tenue de 35 mm de verre plats fond. Continuer à utiliser le 1.2NA objectif à immersion dans l'eau 63x.
- Appliquez une petite goutte de milieu immersion dans l'eau à l'objectif, et placez le plat avec larve monté sur la scène. Stabiliser le plat avec clips.
- Utilisation de l'oculaire grand champ et illumination, la larve se concentrer et de localiser les nerfs moteurs. Analyser les nerfs hemisegments 10-20 et sélectionnez un nerf moteur pour transsection.
- Mettre en place un live-view du nerf sur l'écran de l'ordinateur en utilisant un logiciel d'imagerie. Sélectionner Z-avions et d'acquérir une image des axones et les cellules gliales du nerf blessé.
- Préparer les paramètres d'imagerie time-lapse dans le logiciel d'imagerie pour capturerZ-projections de tous les types de cellules dans des intervalles de 5-30 min, selon l'expérience. Il est préférable de créer tous les réglages nécessaires pour le time-lapse avant de procéder à l'ablation, donc il n'y a pas de retard dans le démarrage du time-lapse une fois la blessure est terminée.
- Retirez le "100% ILL" diviseur de faisceau et le remplacer par le "vide". Fermer le parcours lumineux vers les oculaires.
- Retour à la vue en direct du nerf. Utilisez le canal fluorescent approprié pour afficher les axones qui sera sectionné.
- Utilisation de l'outil ellipse, créez un mince ROI elliptique dans la région pour subir une ablation, puis créer ROI inférieur à l'intérieur de la région sélectionnée.
- Dans la fenêtre qui contrôle les paramètres du laser, régler le nombre d'impulsions à "2" et la plaque d'atténuation de la transmission "18" de l'%. Mettez le feu au laser à l'intérieur de la ROI sélectionnée. Si les restes de fluorescence dans le ROI, augmentent la puissance du laser, attendez environ 10 secondes, et tirer à nouveau le laser. Continuez jusqu'à ce que vous atteignez une valeur qui provoque fluorescCE à disparaître dans le ROI.
- Attendre 10 secondes ou plus et vérifier la zone ayant subi une ablation de nouveau pour la fluorescence. Méfiez-vous qu'un retour sur investissement peut d'abord sembler une ablation, quand il est réellement photobleached. Si les rendements de fluorescence, d'augmenter la puissance du laser et tirer à nouveau le laser. Répétez cette opération jusqu'à ce floraison disparaît dans le ROI et ne revient pas dans les 10 secondes. Il est préférable de commencer avec une puissance laser moindre et augmenter la puissance nécessaire. La puissance du laser nécessaire peut varier selon les différents systèmes de microscopie, à l'âge de colorant de coumarine, spécimen de montage, l'âge des larves, et l'épaisseur du tissu. Une fois une puissance de laser idéal a été établi, ce niveau de puissance peut être utilisée à nouveau sur les nerfs ultérieures dans la même expérience.
- Une fois que l'ablation est terminée, commencer imagerie time-lapse.
- Lorsque le time-lapse est terminée, utilisez un logiciel d'imagerie pour compiler les données et créer une couleur composite Z-projections pour chaque point de temps. Créer un film QuickTime pour analyser le comportementsimultané de axones et les cellules gliales.
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Representative Results
L'essai décrit ici peut être utilisé pour évaluer la réponse des cellules gliales et les autres populations de cellules nerveuses associées à des lésions axonales in vivo. Film 1 montre un exemple d'une lésion du nerf créé en utilisant cette méthode et la réponse des cellules gliales voisines. Cette expérience a été réalisée dans Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) poisson zèbre, dans lequel les cellules gliales perineurial exprimer une membrane cible EGFP et neurones moteurs express cytosolique DsRed. La blessure a été faite le long de la projection rostrale d'un nerf moteur du tronc dans un 6 DPF poisson zèbre en direct, et le nerf était ensuite time-lapse imagée à la fois dans la EGFP et canaux DsRed. Cette visualisation simultanée permis d'axone et les comportements des cellules gliales immédiatement après la blessure.
La figure 1 montre des images fixes du temps des points statiques prises de Film 1. L'ellipse en pointillé montre le retour sur investissement qui a été soumis à une ablation en utilisant le laser. Une minuteaprès résection (MPT), la région ayant subi une ablation manquait fluorescence et la zone de lésion mesurait environ 3,5 um à partir de l'extrémité proximale de moignon distal. Le succès d'une résection peut être confirmé par l'imagerie du moignon du nerf distal et la recherche de signes de dégénérescence Wallerian, y compris la fragmentation de l'axone distal et le dédouanement rapide. L'absence de fluorescence axonale le long du tronçon distal dans la figure 1 à 120 mpt indique que ces axones ont en effet subi une dégénérescence Wallerian et la résection a été un succès.
Réglage de la puissance du laser à un milieu idéal est critique lorsque la réalisation d'expériences d'ablation laser. Les paramètres de puissance laser idéal sera proprement ablation du nerf seulement dans la ROI sélectionnée et les paramètres de puissance laser qui sont soit trop faible ou trop élevée donneront des résultats optimaux. Figure 2a montre une blessure qui a été effectuée avec une puissance laser qui était trop bas. Fluorescence est resté dans le ROI après le tir du laser, Résultant en une résection. Figure 2b incomplète montre une blessure qui a été effectuée avec une puissance laser qui était trop élevé, ce qui entraîne une très grande ablation.
Film 1. Motor section du nerf et imagerie confocale time-lapse du comportement des cellules gliales perineurial. Film montre un tronc nerf moteur avant l'accident, suivie par une image prise 1 mpt, et des images toutes les 10 minutes pour un total de 190 min. Blessure a été réalisée dans un live 6 DPF Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed). Larve de poisson zèbre monté avec antérieure à la gauche et dorsale vers le haut Cliquez ici pour voir le film .
Figure 1. Moteur section du nerf et des images fixesdu comportement des cellules gliales. panneaux sont des images tirées de films 1 encore. La zone elliptique en pointillés représente le retour sur investissement qui a été soumis à une ablation, la création d'une blessure à la résection désigné par la ligne pointillée. Pointes de flèches pointent vers fluorescence axonale qui est présent à 10 mpt, mais pas à 120 mpt, en indiquant les axones distaux dégénéré. Barre d'échelle, 10 um.
Figure 2. Réglages de puissance laser sous-optimaux conduit à des résultats indésirables. (A) Une tentative d'ablation effectuée avec une puissance de laser qui est trop faible. L'ellipse en pointillé indique la ROI sélectionnée. 1 MPT la région a été légèrement décolorées et non sectionné (pointe de flèche). (B) Une ablation effectuée avec une puissance de laser qui est trop élevé. L'ellipse en pointillé noté le retour sur investissement choisi. 1 MPT l'zone ablation est beaucoup plus grand que le ROI sélectionné (pointillés). Toutes les images sont prises à partir de Live 6 DPF Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) larves de poisson zèbre avec antérieure à la gauche et dorsale vers le haut. Barre d'échelle, 10 um.
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Discussion
Les étapes les plus critiques de ce modèle expérimental sont: 1) les larves correctement le montage de blessure et après l'imagerie in vivo et 2) l'étalonnage du laser et de sélectionner les paramètres d'alimentation correctes afin de créer une section du nerf propre qui entraîne des dommages extra-tissulaire minimale . Pour aider à assurer un axotomy succès pour l'imagerie in vivo et l'analyse ultérieure, monter larves multiple soit dans des plats à fond de verre individuels ou dans un plat à fond de verre avec séparateurs. Après l'étalonnage du laser, nous vous recommandons de tester différents réglages de puissance sur une larve de test pour identifier les paramètres optimaux pour section du nerf. Ces paramètres sont généralement assez cohérente entre les expériences, mais peuvent changer si: 1) les larves ne sont pas montés correctement, 2) des larves d'âges différents sont utilisés, 3) le laser n'est pas calibré correctement, 4) le laser a besoin d'entretien ou 5) si les nerfs sont situés dans des positions très différentes antéro-postérieures qui résulteraientà une différence dans l'épaisseur des tissus. Une section du nerf optimal créera une blessure long d'un nerf qui se situe entre 2 et 5 um et ne perturbe pas les tissus voisins.
Lorsque l'on analyse la réponse de n'importe quel type cellulaire à une lésion du système nerveux, nous vous suggérons la réalisation d'au moins 2 types de contrôles. La première consiste à sélectionner une zone de blesser qui est juste à côté du nerf d'intérêt, mais ne touche pas tous les tissus nerveux. Cela vous permettra de déterminer si les réponses cellulaires que vous voyez sont en raison de dommages, en général, ou à des blessures des axones. Le deuxième contrôle est à l'image d'un nerf indemne dans le même poisson que vous avez créé une blessure. Ce type de contrôle élimine larve à la variabilité de la larve en raison de paramètres de mise en scène et de l'imagerie, y compris les temps d'exposition pour l'imagerie confocale, etc
Dans ce protocole, nous décrivons également des scénarios qui créent des blessures qui sont trop petites ou trop grandes pour nos études particulières. DepenDing sur la question expérimentale, ces types de blessures peuvent être utilisés pour l'analyse. Les principales limites à ce type de procédure seraient les objectifs disponibles pour la création de la blessure et de l'imagerie time-lapse ultérieure. Plus la larve que vous utilisez, l'objectif de la plus longue distance de travail nécessaire.
Le protocole que nous décrivons ici permet à l'utilisateur de créer transections nerveuses focales le long des nerfs profonds dans les larves matures. Nous coupler cette technologie in vivo, imagerie time-lapse et d'utiliser un système d'ablation laser disponibles dans le commerce qui crée de manière reproductible lésions axonales focaux. Cette technologie peut être modifié pour utiliser les différentes lignées transgéniques ou des larves mutantes pour tester différentes hypothèses sur les mécanismes visant à reconstruire le système nerveux après une blessure.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire Kucenas pour des discussions utiles et Quorum Technologies, Inc. pour un superbe support technique. Le travail a été financé par le Fonds UVa pour l'excellence en science et technologie (FEST) (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
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