Summary
Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.
Abstract
Il sistema nervoso è spesso descritto come componente hard-wired del corpo, anche se si tratta di un sistema di organi considerevolmente fluido che reagisce a stimoli esterni in maniera stereotipata coerente, pur mantenendo un'incredibile flessibilità e plasticità. A differenza del sistema nervoso centrale (SNC), il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativa, ma abbiamo appena iniziato a comprendere i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando zebrafish come sistema modello, abbiamo l'opportunità senza precedenti di studi rigenerativi coppia con l'imaging in vivo e di manipolazione genetica. Nervi periferici sono composti di assoni circondati da strati di cellule gliali e tessuto connettivo. Gli assoni sono ensheathed da mielinizzanti o non mielinizzanti cellule di Schwann, che sono a loro volta avvolto in un fascicolo da una guaina cellulare chiamato il perinevrio. A seguito di un infortunio, nervi periferici adulti hanno la straordinaria capacità di remove danneggiato detriti assonale e obiettivi re-innervano. Per studiare i ruoli di tutti glia periferica in PNS rigenerazione, descriviamo qui un saggio transection assone che utilizza un laser a colorante disponibile in commercio azoto pompato a axotomize nervi motori in vivo zebrafish transgenico. Approfondiremo i metodi di accoppiare questi esperimenti di time-lapse imaging di nervi feriti e di controllo. Questo paradigma sperimentale può essere utilizzato non solo per valutare il ruolo che giocano glia in rigenerazione nervosa, ma può anche essere la piattaforma per chiarire i meccanismi molecolari che governano riparazione del sistema nervoso.
Introduction
Zebrafish sono stati ampiamente utilizzati per studiare sviluppo del sistema nervoso a causa della loro trasparenza ottica e facilità di transgenesi, che, se accoppiato, permettere spettacolare imaging comportamenti delle cellule dinamiche in un embrione vivente. Inoltre, poiché zebrafish e mammiferi condividono quasi tutti i geni necessari per la formazione del sistema nervoso, informazione cellulare e molecolare raccolte in questo organismo modello è direttamente riferibile ad altre specie di vertebrati. Anche se incredibilmente potente per gli studi sullo sviluppo neurale, il pesce zebra ed i suoi attributi unici hanno il potenziale per chiarire anche i meccanismi che mantengono e ricostruire il sistema nervoso dopo l'infortunio. Zebrafish larve di mantenere la loro traslucenza in stadio avanzato larvali e la pigmentazione può essere efficacemente bloccato sia con l'uso di inibitori farmacologici della produzione di melanina o mutanti genetici che mancano di cellule del pigmento. Così, con questo organismo modello per studiare lesioni e Rigeneranteione negli animali più vecchi è possibile e offre l'opportunità unica di studiare direttamente i meccanismi cellulari e molecolari che ricostruire il sistema nervoso. In questo manoscritto, si descrive come ferire in modo efficiente e riproducibile nervi delle PNS di larve di zebrafish. Questo paradigma lesioni si presta a studiare non solo degenerazione, ma anche le risposte di cellule gliali periferico e cellule immunitarie nonché le interazioni tra queste popolazioni durante la rigenerazione.
SNP è una rete complessa di nervi motori e sensori che è necessario per passare informazioni tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la cute, organi e muscoli del corpo, permettendo un organismo di interagire con l'ambiente e sopravvivere. Lungo questi nervi, glia periferica, comprese le cellule mielinizzanti e non mielinizzanti Schwann e glia perineurale, così come tessuto connettivo, racchiudono gli assoni e infine formare il nervo maturo. Infortunio di questi nervi avvia un processo di Known come walleriana degenerazione 10. Questo meccanismo di frammentazione assonale, reclutamento immunitario, la clearance detriti e la rigenerazione è molto stereotipata e geneticamente regolato 1. Studi precedenti in sistemi di mammifero hanno descritto i ruoli delle cellule di Schwann durante degenerazione del nervo e rigenerazione 1, 2, 6, 8. In questi studi di tessuto fisso o coltura cellulare, cellule di Schwann reclutati non solo macrofagi al sito di lesione per aiutare nella liquidazione detriti, ma anche aiutati in mielina stessi fagocitosi. Anche se questi studi sono stati incredibilmente informativo, non abbiamo mai visualizzate risposte gliali a danno degli assoni periferici in vivo, in tempo reale, e non altri studi hanno indagato il rapporto tra le diverse classi di cellule gliali periferico durante questi eventi.
Recentemente, molti laboratori hanno indagato degenerazione Walleriana utilizzando zebrafish e lesioni assone laser-mediata simile a quello che abbiamo descritto qui
Per fare questo, abbiamo transetto nervi motori a 6 e 7 giorni dopo la fecondazione (DPF) larve e visualizzare le risposte delle singole popolazioni gliali e indagare le interazioni tra queste popolazioni lungo gli assoni danneggiati. Utilizzando doppie e triple TRALinee nsgenic che etichetta glia periferico, comprese le cellule di Schwann e glia perineurale, così come un marcatore per assoni, si usa un sistema di ablazione laser disponibile in commercio costituito da un azoto-pompato dye laser (lunghezza d'onda 435 nm) collegata ad un sistema confocale disco rotante per creare assoni transections. Questo set-up sperimentale ci permette di visualizzare in diretta, zebrafish larvale, ferire specifici tratti di assoni motori periferici e di immagine al rallentatore le risposte delle popolazioni gliali distinte al danno assonale e la loro relazione l'uno all'altro. Questo protocollo può essere ulteriormente adattato per creare lesioni nervose in zebrafish di età diverse, con diverse linee transgeniche o mutanti genetici per affrontare diverse questioni scientifiche.
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Protocol
1. Preparazione e montaggio di embrioni di zebrafish per l'ablazione e vivo Imaging
- Preparare uno stock di 0,8% basso punto di fusione agarosio in acqua uovo. Aliquota in 13X 100 millimetri tubi cultura usa e getta e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Croce zebrafish adulto contenenti transgeni integrati stabilmente per etichettare fluorescenti i neuroni motori e tipi di cellule gliali di interesse. Raccogliere embrioni di zebrafish in acqua uovo e mettere in 28,5 ° C incubatore per la corretta messa in scena più tardi 3.
- A circa 24 ore dopo la fecondazione (HPF), rimuovere l'acqua uovo e aggiungere 0,002% 1-fenil 2-tiourea (PTU) in acqua uovo. Embrioni Rientro in incubatrice.
- Tra 24 e 96 HPF, embrioni devono essere sottoposti a screening per la presenza di transgeni desiderati su un fluorescente ambito dissezione. Mettere gli embrioni selezionati in acqua dolce PTU uovo e tornare alla incubatrice.
- Quando le larve hanno raggiunto i 6 giorni dopo la fecondazione (DPF) (o l'età desiderata), rimuoverli dalla incubatrice, Selezionare un paio di larve per il montaggio, e trasferirli in un piatto più piccolo.
- Rimuovere l'acqua dal piatto e sostituire immediatamente con circa il 0,02% Tricane in acqua uovo PTU. Permettere alle larve di sedersi in anestesia circa 5 min.
- Trasferire un'aliquota del 0,8% a bassa fusione agarosio in un bicchiere con acqua di rubinetto e forno a microonde per 30 secondi, o fino a quando l'agarosio si è sciolto. Lasciare che il bicchiere si raffreddi fino a quando l'agarosio nel tubo cultura sente tiepido al tatto (non bollente).
- Selezionare una larva anestetizzato e trasferirlo da 35 mm piatto fondo singolo o multi-bene vetro. Rimuovere l'acqua che si è trasferito con la larva, quindi coprire immediatamente la larva con abbastanza caldo agarosio per riempire la porzione di fondo di vetro del piatto, ma non creare una grande cupola.
- Come l'agarosio indurisce, utilizzare un ago da dissezione per posizionare la larva sul lato in basso del piatto, quindi inclinare la larva solo leggermente sul dorso. E 'imperativo per lesioni e successive di imaging, chela larva essere montato contatto con la lastra sul fondo del piatto. Utilizzare l'ago di dissezione per mantenere la larva in questa posizione fino a quando l'agarosio si è solidificato e la larva è immobilizzato.
- Una volta che l'agarosio è completamente indurito, pipettare lentamente acqua Tricane abbastanza (questo può essere la stessa Tricane utilizzato per anestesia) nella capsula per coprire completamente l'agarosio e larva.
2. Calibrazione laser e test
- Accendere tutte le strumentazioni microscopio confocale, adeguati laser a diodi per emozionanti transgeni zebrafish, e l'azoto pompato laser a colorante. Assicurarsi che il fascio di "vuoto" splitter è a posto, il laser attenuatore è completamente aperta, e la cella di colorante 435 nm cumarina è a posto. Sul computer, aprire il software di imaging.
- Spostare un obiettivo ad immersione in acqua 1.2NA 63x in posizione e applicare una piccola goccia di mezzo di immersione per gli obiettivi di acqua sulla oggettiva. Un obiettivo 63x consentirà una buona precisione ablazione laser, e acqua immersion consente una maggiore distanza di lavoro, che è necessaria quando si lavora con 6-7 dpf zebrafish larve.
- Ottenere un vetrino con un lato specchiato utilizzare per la calibrazione del laser. Posizionare la diapositiva, lato specchio verso il basso, sul palco microscopio.
- Usando l'oculare sotto illuminazione campo chiaro, trovare e concentrarsi su un graffio o etch nello specchio. La luce brightfield sarà splendente verso il basso sulla lastra di vetro, ma passa solo attraverso l'obiettivo in luoghi dove lo specchio è stato graffiate o incise via, causando lo specchio per guardare nero attraverso l'oculare, e le incisioni a guardare come macchie o linee di luce.
- Visualizza e fuoco le incisioni sullo schermo del computer utilizzando un software di imaging. Aprire la finestra che controlla la calibrazione laser e impostazioni di alimentazione. Impostare il numero di impulsi da "1" e la piastra di attenuazione di trasmissione "3"%. Il numero di impulsi rappresenta il numero di volte che il laser si azionerà all'interno di ciascuna regione di interesse (ROI) e la trasmissione% rappresenta la potenza del laser. Assicurarsi che l'impostazione di calibrazione corretto sia selezionato per l'obiettivo ad immersione dell'acqua 1.2NA 63x.
- Selezionate lo strumento Ellisse dalla barra degli strumenti principale, e clicca l'immagine sullo schermo del computer per creare un unico ROI circolare. Fate questo altre 3 volte fino a quando ci sono 4 ROI circolare distanziati in modo casuale sopra l'immagine.
- Alcuni sistemi possono includere una funzione di sicurezza che non permetterà il laser al fuoco se il percorso della luce per gli oculari è aperto. Se questo è il caso, chiudere manualmente il percorso ottico verso gli oculari in questo momento.
- Sparare il laser. Questo creerà 4 piccole incisioni spot, uno all'interno di ogni ROI circolare. Se il laser non si accende, controllare per essere sicuri che il laser sia acceso e collegato correttamente, e che il percorso della luce per gli oculari è chiuso. Se si aziona il laser, ma senza incisione è visto, controllare per essere sicuri che il "vuoto" beam splitter è a posto. Se tutto è a posto, aumentare la potenza del laser e "FRAP" fino a quando il acqueforti are visibile. Se un'impostazione maggiore di 10 potenza del laser è necessaria per incidere il vetro, questo può indicare la cartuccia plasma laser deve essere sostituita.
- Se le macchie incise appaiono centrati all'interno della ROI selezionata, non è necessaria alcuna calibrazione (procedere a 2.12). Se le macchie non sono centrate, l'impostazione di calibrazione deve essere aggiornato.
- Per calibrare, fare clic sull'aggiornamento l'impostazione di calibrazione. Il laser scatta e l'immagine apparirà contenente un singolo punto acidato. Se il punto non appare, annullare la calibrazione, aumentare la potenza del laser, e riavviare la calibrazione.
- Fare clic al centro della macchia. Il laser sparare di nuovo, e apparirà un altro punto. Fare clic su quel punto, e ripetere questo processo fino a quando la calibrazione è completa e 9 punti di apparire in modo griglia. Ripetere i passaggi 2,6-2,9 per verificare che la calibrazione è stata eseguita correttamente.
- Rimuovere il vetrino dal palco microscopio e pulire l'obiettivo. Aprire il percorso ottico verso il OCULars, e sostituire il "vuoto" divisore di fascio con il "100% ILL" divisore di fascio.
3. Resezione del nervo Utilizzando ablazione laser e time-lapse imaging confocale di comportamenti delle cellule gliali
- Rimuovere il palco utilizzato per contenere il vetrino e sostituire con un palcoscenico adatto per lo svolgimento di 35 millimetri di vetro piatti di fondo. Continuare a utilizzare l'obiettivo ad immersione dell'acqua 1.2NA 63x.
- Applicare una piccola goccia d'acqua mezzo di immersione con l'obiettivo, e posizionare il piatto con larva montato sul palco. Stabilizzare il piatto con clip.
- Usando l'oculare e l'illuminazione widefield, si concentrano la larva e localizzare i nervi motori. Scansione i nervi hemisegments 10-20 e selezionare un nervo motore per la resezione.
- Portare un live-view del nervo sullo schermo del computer utilizzando un software di imaging. Selezionare Z-aerei e di acquisire una immagine degli assoni e cellule gliali del nervo illeso.
- Preparare le impostazioni di time-lapse imaging nel software di imaging di catturareZ-proiezioni di tutti i tipi cellulari in intervalli di 5-30 min, a seconda dell'esperimento. E 'meglio per creare tutte le impostazioni necessarie per il time-lapse prima di eseguire l'ablazione, per cui non vi è alcun ritardo nella partenza del time-lapse una volta che il danno è completo.
- Togliere il "100% ILL" divisore di fascio e sostituire con il "vuoto". Chiudere il percorso della luce per gli oculari.
- Tornare al live-view del nervo. Utilizzare il canale fluorescente appropriato per visualizzare gli assoni che sarà attraversata.
- Utilizzando lo strumento ellisse, creare una ROI ellittica sottile nella zona da asportare, quindi creare ROIs piccola all'interno della regione selezionata.
- Nella finestra che controlla le impostazioni laser, impostare il numero di impulsi da "2" e la piastra di attenuazione di trasmissione "18"%. Sparare il laser all'interno della ROI selezionata. Se resti fluorescenza all'interno del ROI, aumentare la potenza del laser, attendere circa 10 secondi, e sparare di nuovo il laser. Fate questo fino a raggiungere una posizione che provoca FLUORESCENTEce a scomparire all'interno della ROI.
- Attendere 10 secondi o più e controllare l'area ablated ancora per fluorescenza. Attenzione che un ROI può apparire inizialmente ablated, quando in realtà è fotodecolorate. Se ritorna fluorescenza, aumentare la potenza del laser e sparare di nuovo il laser. Ripetere questa operazione fino fluorescenza scompare all'interno del ROI e non restituisce entro 10 sec. E 'meglio cominciare con un laser di potenza minore e aumentare la potenza necessaria. La potenza del laser necessaria può variare a seconda dei sistemi individuali di microscopia, l'età di colorante cumarina, montaggio del campione, l'età delle larve, e lo spessore del tessuto. Una volta che è stata stabilita una potenza laser ideale, questa impostazione di alimentazione può essere riutilizzato nelle successive nervi lo stesso esperimento.
- Una volta che l'ablazione è completato, inizierà time-lapse imaging.
- Quando il time-lapse è completo, utilizzare il software di imaging per compilare i dati e creare il colore composito Z-proiezioni per ogni punto di tempo. Creare un filmato QuickTime per analizzare il comportamentodi assoni e cellule gliali simultaneamente.
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Representative Results
Il saggio descritto qui può essere utilizzato per valutare la risposta delle cellule gliali e altre popolazioni di cellule nervose associate al danno assonale in vivo. Filmato 1 mostra un esempio di una lesione del nervo creato con questo metodo e la risposta delle cellule gliali circostanti. Questo esperimento è stato eseguito in Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) zebrafish, in cui glia perineurale esprimono una membrana mirata EGFP e motore neuroni esprimono citosolico DsRed. Il danno è stato fatto lungo la proiezione rostrale di un nervo motore del tronco in un 6 dpf zebrafish vivo, e il nervo è stato successivamente time-lapse ripreso sia nel EGFP e canali DsRed. Questa visualizzazione simultanea permesso di assoni e comportamenti delle cellule gliali subito dopo l'infortunio.
La figura 1 mostra le immagini del tempo-punti statiche tratte da film 1 ancora. L'ellisse tratteggiata mostra il ROI che è stato asportato con il laser. Un minutoalberino transection (MPT), l'area ablato mancava fluorescenza e la zona ferita misurava circa 3,5 um da prossimale a distale moncone. Il successo di una resezione può essere confermata da imaging del moncone distale del nervo e alla ricerca di segni di degenerazione walleriana, tra distale frammentazione degli assoni e la rapida clearance. L'assenza di fluorescenza assonale lungo il moncone distale nella figura 1 a 120 MPT indica questi assoni hanno infatti subito una degenerazione Walleriana e la recisione era successo.
Regolazione della potenza del laser ad un ambiente ideale è fondamentale quando si eseguono esperimenti di ablazione laser. Impostazioni di potenza del laser ideale sarà pulito ablazione del nervo solo all'interno del ROI selezionata e le impostazioni di alimentazione del laser che sono o troppo bassa o troppo alta daranno risultati non ottimali. Figura 2a mostra una ferita che è stata eseguita con un laser di potenza che era troppo basso. Fluorescenza rimasto all'interno del ROI dopo aver sparato il laser, Risultante in un incompleto transection. Figura 2b mostra una lesione che è stata eseguita con una potenza laser che era troppo alto, causando una notevole larghezza di ablazione.
Movie 1. Recisione del nervo motorio e confocale time-lapse imaging di comportamento delle cellule gliali perineurale. Film mostra un tronco nervoso motore pre-infortunio, seguita da un'immagine scattata 1 MPT, e le immagini ogni 10 minuti per un totale di 190 min. Infortunio è stata eseguita in un live 6 dpf Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed). Larva zebrafish montato con anteriore a sinistra e dorsale alla cima Clicca qui per vedere film .
Figura 1. Recisione del nervo motore e le immagini fissedel comportamento delle cellule gliali. pannelli sono immagini prese dal film 1 ancora. L'area tratteggiata rappresenta il ellittica ROI che è stato asportato, creando una lesione transezione indicata con linea tratteggiata. Punte di freccia indicano fluorescenza assonale che è presente alla 10 MPT, ma non a 120 mpt, indicando gli assoni distali degenerate. Barra della scala, 10 micron.
Figura 2. Impostazioni di potenza del laser non ottimali porta a risultati indesiderati. (A) Un tentativo di ablazione eseguita con una potenza laser che è troppo basso. L'ellisse tratteggiata indica il ROI selezionata. 1 MPT l'area è stata leggermente fotodecolorate e non transected (punta di freccia). (B) L'ablazione effettuata con una potenza del laser che è troppo alta. L'ellisse tratteggiata denota il ROI selezionata. 1 MPT ilzona asportata è molto più grande del ROI selezionata (linea tratteggiata). Tutte le immagini sono prese dal vivo 6 dpf Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) larve di zebrafish con anteriore a sinistra e dorsale fino alla cima. Barra della scala, 10 micron.
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Discussion
Le fasi più critiche di questo disegno sperimentale sono: 1) correttamente larve montaggio per lesioni e successive imaging in vivo e 2) calibrare il laser e selezionando le impostazioni di alimentazione corrette per poter creare una transezione del nervo pulita che provoca danni extra-tessuto minimal . Per contribuire a garantire un assotomia successo per l'imaging in vivo e successiva analisi, montare larve multiplo in entrambi i singoli piatti con fondo di vetro o in un piatto fondo di vetro con divisori. Dopo aver calibrato il laser, si consiglia di provare diverse impostazioni di potenza su una larva di test per identificare i parametri ottimali per la resezione del nervo. Queste impostazioni sono di solito abbastanza coerenti tra esperimenti, ma può cambiare se: 1) le larve non sono montati correttamente, 2) larve di età diverse sono usati, 3) il laser non è tarato correttamente, 4) il laser ha bisogno di manutenzione o 5) se i nervi sono situati in differenti posizioni antero-posteriore che deriverebberoin una differenza di spessore del tessuto. Una resezione del nervo ottimale creerà un infortunio lungo un nervo che è tra 2 e 5 micron e non disturba i tessuti vicini.
Quando si analizza la risposta di qualsiasi tipo cellulare a lesioni del sistema nervoso, suggeriamo conducendo almeno due tipi di controlli. La prima è la selezione di una zona a ferire che è immediatamente vicino al nervo di interesse, ma non sia a contatto con il tessuto nervoso. Questo vi permetterà di determinare se le risposte cellulari che vedete sono causa di danni in generale, o per lesioni degli assoni. Il secondo controllo è a immagine di un nervo illeso nello stesso pesce che si è creato un infortunio. Questo tipo di controllo elimina larva larva di variabilità dovuta ai parametri di messa in scena e di imaging, tra cui i tempi di esposizione confocale per l'imaging, ecc
In questo protocollo Abbiamo anche descrivono scenari che creano lesioni che sono troppo piccole o troppo grandi per i nostri studi particolari. Dipendenzading sulla questione sperimentale, questi tipi di lesioni possono essere usati per l'analisi. Le principali limitazioni a questo tipo di procedura sarebbero gli obiettivi disponibili per la creazione della lesione e la successiva time-lapse imaging. I più anziani la larva si usa, l'obiettivo distanza di lavoro è più necessaria.
Il protocollo che descriviamo qui permette all'utente di creare transections nervose focali lungo i nervi profondi larve mature. Abbiamo paio questa tecnologia per in vivo, time-lapse imaging e utilizzare un sistema di ablazione laser disponibili in commercio che crea riproducibile lesioni focali assone. Questa tecnologia può essere modificato per utilizzare diverse linee transgeniche o larve mutanti per testare diverse ipotesi circa i meccanismi che la ricostruzione del sistema nervoso dopo l'infortunio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Lab Kucenas per preziosi discussioni e Quorum Technologies, Inc. per il superbo supporto tecnico. Il lavoro è stato sostenuto dal Fondo UVa per l'eccellenza nella scienza e la tecnologia (FEST) (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
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