Summary
Embora o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa após a lesão, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando vivo, zebrafish transgênicos e um teste de secção do nervo reprodutível, podemos estudar os comportamentos de células gliais dinâmicas durante a degeneração do nervo e regeneração.
Abstract
O sistema nervoso é frequentemente descrito como um componente de hard-wired do corpo, mesmo que seja um sistema de órgãos consideravelmente fluido que reage a estímulos externos em uma maneira consistente estereotipado, mantendo ao mesmo tempo a flexibilidade e plasticidade incrível. Ao contrário do sistema nervoso central (SNC), o sistema nervoso periférico (SNP) é capaz de reparação significativa, mas apenas começaram a compreender os mecanismos celulares e moleculares que governam este fenómeno. Usando zebrafish como um sistema modelo, temos a oportunidade sem precedentes para estudos regenerativos casal com in vivo de imagens e manipulação genética. Os nervos periféricos são compostos de axónios rodeado por camadas de células gliais e de tecido conjuntivo. Axônios são ensheathed por myelinating ou não células mielinizantes de Schwann, as quais são, por sua vez envolvida num fascículo por uma bainha celular chamado o perineuro. Após uma lesão, nervos periféricos adultos têm a notável capacidade de remove danificado detritos axonal e alvos de re-inervam. Para investigar os papéis de todos os glia periférica na regeneração PNS, descrevemos aqui um ensaio transection axônio que usa um laser de corante disponível comercialmente nitrogênio bombeado para axotomize nervos motores em zebrafish transgênicos ao vivo. Descrevemos ainda mais os métodos para casal estas experiências à imagem time-lapse de nervos lesados e controle. Este paradigma experimental pode ser utilizado não só para avaliar o papel que desempenham na glia regeneração do nervo, mas pode também ser a plataforma para elucidar os mecanismos moleculares que governam a reparação do sistema nervoso.
Introduction
Zebrafish têm sido extensivamente usados para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso devido a sua transparência óptica e facilidade de transgénese, que, quando acoplados, para permitir imagiologia espectacular dos comportamentos dinâmicos das células num embrião vivo. Além disso, por causa do peixe-zebra e mamíferos partes quase todos os genes necessários para a formação do sistema nervoso, a informação celular e molecular recolhidos neste modelo organismo é directamente relacionáveis com outras espécies de vertebrados. Embora extremamente poderosa para o estudo do desenvolvimento neural, o peixe-zebra e os seus atributos únicos têm o potencial de também explicar os mecanismos que mantêm e reconstruir o sistema nervoso após a lesão. Larvas de peixe-zebra manter a sua translucidez em estágios larvais tardias e pigmentação pode ser bloqueado, quer com a utilização de inibidores farmacológicos de produção de melanina ou de mutantes genéticos que carecem de células de pigmento. Assim, usando este organismo modelo para estudar lesões e se regeneraion em animais mais velhos é possível e oferece a oportunidade única de investigar diretamente os mecanismos celulares e moleculares que reconstruir o sistema nervoso. Neste artigo, descrevemos como a ferir de forma eficiente e reproduzível nervos nos PNS de larvas de peixe-zebra. Este paradigma lesão presta-se a estudar não só a degeneração, mas também as respostas das células gliais e células do sistema imunológico periférico, bem como as interacções entre estas populações durante a regeneração.
O SNP é uma rede complexa de nervos motores e sensoriais que é necessário para passar informação entre o sistema nervoso central (CNS) e na pele, músculo e órgãos do corpo, permitindo que um organismo de interagir com o seu ambiente e sobreviver. Ao longo destes nervos, células gliais periférico, incluindo células mielinizantes e não mielinizantes de Schwann e glia perineural, bem como o tecido conjuntivo, encerram os axónios e finalmente formam o nervo madura. Lesão destes nervos inicia um processo de known como degeneração Walleriana 10. Este mecanismo de fragmentação axonal, recrutamento imunológico, liberação de detritos e regeneração é muito estereotipada e geneticamente regulado 1. Estudos anteriores em sistemas de mamíferos têm descrito as funções das células de Schwann, durante a degeneração do nervo e regeneração 1, 2, 6, 8. Nestes estudos de tecido fixo ou de cultura de células, as células de Schwann, não só recrutados macrófagos para o local da lesão para ajudar na depuração de detritos, mas também ajudou na mielina fagocitose si. Embora esses estudos tenham sido incrivelmente informativo, nunca temos antes de respostas gliais visualizadas a lesão axonal periférica in vivo em tempo real, e não outros estudos investigaram a relação entre as diferentes classes de glia periférica durante esses eventos.
Recentemente, vários laboratórios têm investigado a degeneração Walleriana utilizando zebrafish e lesão axonal mediada por laser de semelhante ao que descrevemos aqui
Para fazer isso, nós transecto nervos motores de 6 e 7 dias após a fertilização (dpf) larvas e visualizar as respostas das populações da glia individuais, bem como investigar as interações entre essas populações ao longo dos axônios lesionados. Usando tra duplos e triploslinhas nsgenic que a glia periférica etiqueta, incluindo as células de Schwann e glia perineural, bem como um marcador de axónios, que utilizam um sistema de ablação a laser disponíveis no comércio consistindo de um átomo de azoto-de corante bombeado a laser (comprimento de onda de 435 nm) ligado a um sistema de disco giratório confocal para criar axônio transecções. Este experimental set-up permite visualizar ao vivo, peixe-zebra larval, ferir imagem time-lapse as respostas das populações da glia distintos tratos dos axônios motores periféricos específicos e à lesão axonal e sua relação com o outro. Este protocolo pode ainda ser adaptado para criar lesões nervosas em zebrafish de diferentes idades, com diferentes linhagens transgênicas ou mutantes genéticos para abordar diferentes questões científicas.
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Protocol
1. Preparação e montagem de embriões Zebrafish para ablação e Imagens ao vivo
- Prepare um estoque de 0,8% de baixa fusão agarose em água ovo. Alíquotas 13X em tubos de cultura de 100 mm descartáveis e armazenar a 4 ° C até ser necessário.
- Zebrafish adulto Cruz contendo estavelmente transgenes integrados para rotular fluorescente os neurônios motores e tipos de interesse de células gliais. Coletar embriões zebrafish em água ovo e coloque em 28,5 ° C incubadora para o estadiamento correto mais tarde 3.
- Aproximadamente 24 horas após a fertilização (HPF), remover a água do ovo e adicionar 0,002% de 1-fenil 2-tioureia (PTU) em água ovo. Retorno embriões para a incubadora.
- Entre 24 e 96 hpf, embriões devem ser pesquisados quanto à presença de transgenes desejados sobre um escopo de dissecação fluorescente. Coloque embriões selecionados em água doce ovo PTU e voltar para a incubadora.
- Quando as larvas atingiram seis dias após a fertilização (dpf) (ou idade desejada), removê-los da incubadora, Selecione algumas larvas para a montagem, e transferi-los para um prato menor.
- Remover a água do prato e substituir imediatamente com cerca de 0,02% em Tricane PTU água ovo. Permitir que as larvas se sentar na anestésico cerca de 5 min.
- Colocar uma alíquota de 0,8% de agarose de baixa fusão num copo com água da torneira e micro-ondas durante 30 segundos, ou até a agarose é derretido. Deixe o copo para esfriar até que a agarose no tubo de cultura se sente morna ao toque (não quente).
- Selecione uma larva anestesiados e transferi-lo para um único ou multi-bem 35 milímetros prato fundo de vidro. Retire toda a água que foi transferido com a larva, em seguida, cubra imediatamente a larva com agarose quente o suficiente para preencher a parte de vidro de fundo do prato, mas não criar uma grande cúpula.
- À medida que a agarose endureça, utilizar uma agulha de dissecação para posicionar a larva do seu lado, na parte inferior do prato e incline a larva apenas ligeiramente na sua parte traseira. É imperativo para lesão e imagem subseqüente, quea larva montado estar a tocar o vidro sobre o fundo do prato. Utilize a agulha de dissecação para manter a larva nesta posição até que a agarose é solidificado e a larva é imobilizada.
- Uma vez que a agarose é completamente endurecido, lentamente pipetar Tricane água suficiente (este pode ser o mesmo usado para anestesia Tricane) para o prato de modo a cobrir totalmente a agarose e larva.
2. Calibração e Ensaios Laser
- Ligue todos os instrumentos microscópio confocal, lasers de diodo apropriadas para transgenes zebrafish emocionantes, eo nitrogênio-bombeou o laser de corante. Certifique-se o feixe de "branco" divisor está no lugar, o atenuador laser é totalmente aberto, ea 435 nm célula corante cumarina está no lugar. No computador, abra o software de imagem.
- Mover uma objetiva de imersão em água 1.2NA 63x na posição e aplique uma pequena gota de meio de imersão para os objetivos da água para o objetivo. Um objectivo 63x permitirá boa precisão ablação a laser e água immersion permite uma maior distância de trabalho, o que é necessário quando se trabalha com larvas do peixe dpf 6-7.
- Obter uma lâmina de vidro espelhado com um lado a ser usado para a calibração do laser. Coloque o slide, o lado do espelho para baixo, para o palco microscópio.
- Usando a ocular sob iluminação de campo claro, encontrar e se concentrar em um arranhão ou etch no espelho. A luz brightfield estará brilhando para baixo sobre a lâmina de vidro, mas só passará para o objetivo em locais onde o espelho foi arranhado ou gravado de distância, fazendo com que o espelho para olhar negro através da ocular, e as gravuras para olhar como manchas ou linhas de luz.
- Ver e concentrar as gravuras na tela do computador usando o software de imagem. Abrir a janela que controla a calibração e ajustes de potência de laser. Defina o número de pulsos para "1" ea placa de atenuação para "3" transmissão%. O número de impulsos representa o número de vezes que o laser será disparado dentro de cada região de interesse (ROI) e a transmissão% representa a potência do laser. Certifique-se a configuração de calibragem correta está selecionada para a objectiva de imersão em água 1.2NA 63x.
- Selecione a ferramenta elipse a partir da barra de ferramentas principal e clique na imagem na tela do computador para criar um único ROI circular. Faça isso mais três vezes, até que há quatro ROIs circular espaçados aleatoriamente sobre a imagem.
- Alguns sistemas podem incluir uma característica de segurança que não permitirá que o laser para disparar, se o percurso da luz para as oculares é aberta. Se este for o caso, a fechar manualmente o percurso da luz para as oculares neste momento.
- Disparar o laser. Isto irá criar quatro pequenas gravuras no local, uma em cada ROI circular. Se o laser não dispara, verifique se o laser é ligado e conectado corretamente, e que o caminho da luz para as oculares é fechado. Se os fogos de laser, mas sem ataque é visto, verifique se o "branco" divisor de feixe está no lugar. Se tudo estiver no lugar, aumentar a potência do laser e "FRAP" até o gravuras are visível. Se uma fonte de laser de fixação superior 10 é necessário para gravar o vidro, isto pode indicar que o cartucho de laser plasma tem de ser substituído.
- Se as manchas aparecem gravadas centrado dentro do ROI selecionado, nenhuma calibração é necessário (vá para 2.12). Se os pontos não estão centradas, o ajuste de calibração precisa ser atualizado.
- Para calibrar, clique na atualização da configuração de calibragem. O laser vai disparar e será apresentada uma imagem que contém um único ponto gravado. Se o ponto não aparecer, cancelar a calibração, aumentar a potência do laser, e iniciar a calibração novamente.
- Clique no centro do local. O laser vai disparar de novo, e outro ponto aparecerá. Clique nesse ponto, e repita o processo até que a calibração está completa e 9 pontos aparecem em forma de grade. Repita os passos de 2,6-2,9 para verificar se a calibração foi bem sucedida.
- Retire a lâmina de vidro a partir do estágio do microscópio e limpar a objetiva. Abra o caminho da luz para a oculars, e substituir o "branco" divisor de feixe com o "100% ILL" divisor de feixe.
3. Secção do nervo Usando ablação a laser e Time-lapse imagem confocal de Comportamentos de células gliais
- Remover a fase usado para manter a lâmina de vidro e substitua por uma fase adequada para a realização de 35 milímetros pratos de vidro com fundo. Continuar a utilizar o objetivo de imersão em água 1.2NA 63x.
- Aplique uma pequena gota de meio de imersão em água com o objectivo, e coloque o prato com larva montado no palco. Estabilizar o prato com clips.
- Usando a ocular e iluminação de campo amplo, o foco da larva e localizar os nervos motores. Digitalizar os nervos hemisegments 10-20 e selecionar um nervo motor para transecção.
- Traga um live-view do nervo na tela do computador usando o software de imagem. Selecione Z-aviões e adquirir uma imagem dos axônios e células gliais do nervo ileso.
- Prepare as configurações de imagem time-lapse no software de imagem para capturarZ-projecções de todos os tipos de células em intervalos de 5-30 min, dependendo da experiência. O melhor é criar todas as configurações necessárias para o lapso de tempo antes de realizar a ablação, para que não haja atraso no início do lapso de tempo uma vez que a lesão é completa.
- Retire o "100% ILL" divisor de feixe e substituir com o "branco". Feche o caminho da luz para as oculares.
- Voltar para o live-view do nervo. Use o canal fluorescente apropriado para ver os axônios que será seccionado.
- Usando a ferramenta elipse, crie um ROI elíptica fino na área a ser cauterizado, em seguida, criar ROIs menor dentro da região selecionada.
- Na janela que controla as configurações de laser, defina o número de pulsos para "2" ea placa de atenuação para "18" transmissão%. Disparar o laser dentro do ROI selecionada. Se restos de fluorescência dentro do ROI, aumentar a potência do laser, espere cerca de 10 segundos e disparar o laser novamente. Faça isso até chegar a uma configuração que faz com que fluoresce a desaparecer dentro do ROI.
- Aguarde 10 segundos ou mais e verifique a área ablacionada novamente por fluorescência. Tenha em atenção que um ROI pode parecer inicialmente ablated, quando na verdade é Foto-descoloração. Se os retornos de fluorescência, aumentar a potência do laser e disparar o laser novamente. Repita este procedimento até florescimento desaparece dentro do ROI e não retornar dentro de 10 seg. É melhor começar com uma fonte de laser de menor e aumentar a energia necessária. A potência do laser necessária pode variar de acordo com cada sistema de microscopia, com idade de corante cumarina, montagem de amostras, a idade das larvas, e da espessura do tecido. Uma vez que a potência do laser ideal ter sido estabelecida, esta definição de potência pode ser utilizado novamente em nervos subsequentes no mesmo experimento.
- Uma vez que a ablação é concluída, começam imagem time-lapse.
- Quando o time-lapse é completo, use o software de imagens para compilar dados e criar cor composta Z-projeções para cada ponto de tempo. Crie um filme QuickTime para analisar o comportamentode axônios e células gliais simultaneamente.
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Representative Results
O ensaio aqui descrito pode ser usado para avaliar a resposta das células da glia e outras populações de células nervosas associadas a lesão axonal in vivo. Filme 1 mostra um exemplo de uma lesão do nervo criada usando este método e a resposta de células vizinhas gliais. Este experimento foi realizado em Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (OLIG2: DsRed) zebrafish, no qual glia perineural expressar uma membrana alvo EGFP e neurônios motores expressa cytosolic DsRed. A lesão foi feito ao longo da projeção rostral de um nervo motor tronco em um peixe-zebra ao vivo 6 dpf, eo nervo foi posteriormente time-lapse fotografada tanto no EGFP e canais DsRed. Esta visualização simultânea permitido de axônio e comportamentos de células gliais, imediatamente após a lesão.
A Figura 1 mostra ainda imagens estáticas tempo pontos de tomadas de um filme. A elipse pontilhado mostra o ROI que foi extirpada utilizando o laser. Um minutopós transecção (MPT), a área excisada carecido de fluorescência e na zona de lesão medido aproximadamente 3,5 hum do coto proximal para distal. O sucesso de um corte transversal pode ser confirmado por imagem do coto do nervo distal e procurando sinais de degeneração Walleriana, incluindo a fragmentação do axônio distal e liberação rápida. A ausência de fluorescência axonal ao longo do coto distal na Figura 1 a 120 mpt indica esses axônios têm de fato sofrido degeneração Walleriana ea transecção foi bem sucedida.
Ajustar a potência do laser para um ajuste ideal é crítica quando a realização de experimentos de ablação a laser. As configurações de energia do laser ideal será limpa extirpar o nervo apenas dentro do ROI selecionada e configurações de energia do laser que são ou muito baixo ou muito alto irá produzir resultados de qualidade inferior. Figura 2a mostra uma lesão que foi realizado com uma fonte de laser, que era muito baixo. Fluorescência permaneceu dentro do ROI após disparar o laser, Resultando num corte transversal incompleto. Figura 2b mostra uma lesão que foi realizada com uma fonte de laser que era demasiado elevada, resultando numa ablação extremamente grande.
Filme 1. Secção do nervo motor e confocal de imagem time-lapse do comportamento das células glial perineural. Filme mostra um tronco nervo motor pré-lesão, seguido de uma imagem tirada uma MPT, e as imagens a cada 10 minutos para um total de 190 min. Lesão foi realizada em um live 6 dpf Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (OLIG2: DsRed). Larva zebrafish montado com anterior para a esquerda e dorsal ao topo Clique aqui para ver filme .
Figura 1. Secção do nervo motor e imagens estáticasdo comportamento das células gliais. painéis ainda são imagens tiradas de um filme. A área tracejada representa o elíptica ROI que foi feita a ablação, a criação de uma lesão transecção denotado pela linha a tracejado. As setas apontam para fluorescência axonal que está presente em 10 MPT, mas não a 120 MPT, indicando os axónios distais degenerados. Barra de escala, 10 mM.
Figura 2. As configurações de energia do laser de qualidade inferior leva a resultados indesejados. (A) Uma tentativa de ablação realizada com uma fonte de laser que é demasiado baixa. A elipse pontilhado indica o ROI seleccionado. 1 MPT a área tem sido um pouco Foto-descoloração e não seccionado (seta). (B) Uma ablação realizada com uma fonte de laser que é muito alto. A elipse pontilhada denotava o ROI selecionada. 1 MPT aárea excisada é muito maior do que a ROI seleccionado (linha pontilhada). Todas as imagens são obtidas a partir de 6 dpf vivo Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (OLIG2: DsRed) larvas de peixes-zebra com o anterior para a esquerda e para a parte superior dorsal. Barra de escala, 10 mM.
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Discussion
Os passos mais críticos da presente delineamento experimental são os seguintes: 1) para a montagem propriamente larvas lesão e subsequente in vivo de imagens e 2) calibrar o laser e escolhendo os ajustes de potência correctos, a fim de criar um corte transversal do nervo limpa que resulta em danos mínimos dos tecidos extra- . Para ajudar a garantir uma axotomia sucesso para in vivo de imagens e posterior análise, montar larvas múltiplas tanto em pratos com fundo de vidro individuais ou em um prato fundo de vidro com divisórias. Depois de calibrar o laser, recomendamos testar diferentes configurações de energia em uma larva de teste para identificar os parâmetros ótimos para a secção do nervo. Essas configurações são geralmente bastante consistente entre os experimentos, mas pode mudar se: 1) as larvas não são montados corretamente, 2) larvas de diferentes idades são utilizados, 3) o laser não está calibrado corretamente, 4) o laser precisa de manutenção ou 5) se os nervos estão localizadas em diferentes posições ântero-posterior que resultariamem uma diferença na espessura do tecido. Um corte transversal do nervo óptima irá criar um ferimento ao longo de um nervo que é de entre 2 e 5 micrómetros e não perturba o tecido vizinho.
Quando se analisa a resposta de qualquer tipo de célula a uma lesão do sistema nervoso, sugerimos a realização de pelo menos dois tipos de controlos. A primeira é selecionar uma área para ferir que está imediatamente ao lado do nervo de interesse, mas não é tocar em qualquer tecido nervoso. Isso permitirá que você para determinar se as respostas celulares que você vê são devido a danos em geral, ou a lesão dos axônios. O segundo controle é a imagem de um nervo ileso no mesmo peixe que você tenha criado uma lesão. Este tipo de controle elimina larva à variabilidade larva devido aos parâmetros de preparo e de imagem, incluindo os tempos de exposição confocal para imagens, etc
Neste protocolo, também descrevem cenários que criam lesões que são pequenos demais ou grandes demais para nossos estudos particulares. Dependendo a questão experimental, estes tipos de lesões podem ser utilizados para análise. As principais limitações para este tipo de procedimento seria os objetivos disponíveis para a criação da lesão e posterior imagem time-lapse. Quanto mais velha a larva que você usa, o objetivo maior distância de trabalho necessário.
O protocolo aqui descrito permite que o usuário crie transecções nervosas focais ao longo dos nervos profundos em larvas maduras. Nós par desta tecnologia para in vivo, de imagens de lapso de tempo e usar um sistema de ablação a laser disponível no mercado que reproducibly cria lesões focais do axônio. Esta tecnologia pode ser alterada para utilizar diferentes linhas transgénicas ou larvas mutante para testar diferentes hipóteses acerca dos mecanismos que reconstroem o sistema nervoso após a lesão.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Laboratório Kucenas pelas valiosas discussões e Tecnologias de quorum, Inc. Para obter suporte técnico soberbo. O trabalho foi apoiado pelo Fundo UVA de Excelência em Ciência e Tecnologia (FEST) (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
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