Motorisk nerv transection och Time-lapse avbildning av stödjeceller Beteenden Live Zebrafish

Summary

Även det perifera nervsystemet (PNS) kan betydande reparation efter skada, är lite känt om de cellulära och molekylära mekanismer som styr detta fenomen. Använda levande, transgena zebrafisk och en reproducerbar nerv transection analysen, kan vi studera dynamiska gliacellsmarkörer beteenden under nervdegenerering och regeneration.

Abstract

Nervsystemet beskrivs ofta som en trådbunden komponent i kroppen trots att det är en betydligt flytande organsystem som reagerar på yttre stimuli i en konsekvent, stereotypt sätt, samtidigt otrolig flexibilitet och plasticitet. Till skillnad från det centrala nervsystemet (CNS), är det perifera nervsystemet (PNS) kan betydande reparation, men vi har bara börjat att förstå de cellulära och molekylära mekanismer som styr detta fenomen. Använda zebrafisk som modellsystem har vi helt nya möjligheter att koppla regenerativa studier med in vivo imaging och genetisk manipulation. Perifera nerver är sammansatta av axoner omgivna av lager av glia och bindväv. Axoner ensheathed genom myeliniserande eller icke-myeliniserande Schwann-celler, som är i sin tur inslagna i en fascicle genom ett cellulärt hölje kallas perineurium. Efter en skada, vuxna perifera nerver har den märkliga förmågan att remove skadade axonal skräp och åter innerverar mål. För att undersöka de roller alla perifera glia i PNS regeneration, beskriver vi här en analys axon transection som använder ett kommersiellt tillgängligt kväve-pumpad färglaser att axotomize motoriska nerver i levande transgena zebrafisk. Vi beskriver vidare de metoder för att koppla dessa försök till time-lapse avbildning av skadade och kontroll nerver. Denna experimentella paradigm kan användas för att inte bara bedöma den roll som glia spela i nervregenerering, men också kan vara en plattform för att klargöra de molekylära mekanismer som styr nervsystemet reparation.

Introduction

Zebrafisk har använts i stor utsträckning för att studera utvecklingen av nervsystemet på grund av deras optiska transparens och lätthet av transgenes, som när den är kopplad, möjliggöra spektakulära avbildning av dynamiska cell beteenden i en levande embryo. Dessutom, eftersom zebrafisk och däggdjur delar nästan alla de gener som krävs för nervsystemet bildas, cellulär och molekylär information som samlats in i denna modell organism är direkt relatable för andra ryggradsdjur. Även otroligt kraftfull för neurala utvecklingsstudier, zebrafisk och dess unika egenskaper har potential att även belysa de mekanismer som upprätthåller och återuppbygga nervsystemet efter skada. Zebrafisk larver behålla sin genomskinlighet i sena larvstadier och pigmentering kan effektivt blockeras med antingen användning av farmakologiska hämmare av melanin produktionen eller genetiska mutanter som saknar pigmentceller. Således, för att använda denna modell organism studera skada och regeneratjon i äldre djur är möjligt och erbjuder en unik möjlighet att direkt undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som återuppbygga nervsystemet. I detta manuskript, beskriver vi hur man effektivt och reproducerbart skada nerver i PNS av zebrafisk larver. Denna skada paradigm lämpar sig för att studera inte bara degeneration, utan även svaren från perifera glia och immunceller samt samspelet mellan dessa populationer under regeneration.

De PNS är ett komplext nätverk av motoriska och sensoriska nerver som är nödvändigt för att överföra information mellan det centrala nervsystemet (CNS) och huden, organ och muskel i kroppen, vilket gör att en organism att interagera med dess omgivning och överleva. Längs dessa nerver, perifer glia, inklusive myeliniserande och icke-myeliniserande Schwann-celler och perineurial glia, samt bindväv, innesluta axoner och slutligen bilda den mogna nerven. Skada av dessa nerver initierar en process kNown som Wallerian degeneration ^10. Denna mekanism av axonal fragmentering, immun rekrytering, skräp clearance och förnyelse är väldigt stereotypa och genetiskt reglerat ^1. Tidigare studier i däggdjurssystem har beskrivit rollerna av Schwann-celler under nervdegenerering och förnyelse ^{1, 2, 6, 8.} I dessa studier med fast vävnad eller cellkultur, Schwannceller inte bara rekryterat makrofager till skadan webbplats för att underlätta skräp clearance, men också hjälp i myelin fagocytos själva. Även om dessa studier har varit oerhört informativt, har vi aldrig tidigare visualiserade gliaceller svar på perifer axonet skada in vivo i realtid, och inga andra studier har undersökt sambandet mellan de olika klasserna av perifer glia under dessa händelser.

Nyligen har flera labb undersökt Wallerian degeneration med zebrafisk och laser-medierad axon skada liknar det vi beskriver här 4, 5, 9. I en annan studie, som är mycket lik vår egen, var djupare axoner i den ventrala nerven transekterades i 5 dagar gamla larver med ett kommersiellt tillgängligt system laser ablation ^7. I båda dessa experimentella uppställningar, låg fokus på Wallerian degeneration och både axoner och immunceller avbildades. Att expandera på dessa studier, beskriver vi sårar motoriska axoner i äldre larver med mer mogna, myeliniserade nerver och analys svaret på alla nerv-associerad perifer glia under degeneration och regeneration.

För att göra detta, transekt vi motoriska nerver i 6 och 7 dagars efter befruktning (DPF) larver och visualisera svaren från enskilda gliaceller populationer samt undersöka samspelet mellan dessa populationer längs skadade axoner. Använda dubbel och trippel transgenic linjer den etiketten perifer glia, inklusive schwannceller och perineurial glia, samt en markör för axoner, använder vi ett kommersiellt tillgängligt system för laser ablation består av en kväve-pumpad färglaser (våglängd 435 nm) fäst till en snurrande skiva konfokala systemet att skapa Axon transections. Denna experimentella set-up tillåter oss att visualisera levande, larver zebrafisk, skada specifika perifera områden motoriska axon och tidsförlopp image svaren från olika gliaceller populationer till axon skada och deras förhållande till varandra. Detta protokoll kan anpassas ytterligare för att skapa nerv skador i zebrafisk av olika åldrar, med olika transgena linjer eller genetiska mutanter för att ta upp olika vetenskapliga frågor.

Protocol

Ett. Förberedelse och montering av Zebrafish embryon för ablation och Live Imaging

1. Förbered ett lager på 0,8% låg smältpunkt agaros i ägg vatten. Alikvot in 13X 100 mm disponibla odlingsrör och förvara vid 4 ° C tills det behövs.
2. Cross vuxna zebrafisk innehållande stabilt integrerat transgenerna fluorescerande märka motoriska nervceller och gliaceller celltyper av intresse. Samla zebrafisk embryon i ägg vatten och placera i 28,5 ° C inkubator för korrekt stadieindelning senare ^3.
3. Vid ungefär 24 timmar efter befruktning (HPF), ta bort ägg vatten och tillsätt 0,002% 1-fenyl-2-tiourea (PTU) i ägg vatten. Återgå embryon till inkubatorn.
4. Mellan 24 och 96 HPF bör embryon screenas med avseende på närvaro av önskade transgener på en fluorescerande dissektionsmikroskop. Placera utvalda embryon i färskt PTU ägg vatten och återgå till inkubatorn.
5. När larverna har nått 6 dagar efter befruktningen (DPF) (eller önskad ålder), ta bort dem från inkubatornVäljer ett fåtal larver för montering, och överföra dem till en mindre skål.
6. Avlägsna vattnet från skålen och omedelbart ersätta med ca 0,02% Tricane i PTU ägg vatten. Låt larver sitta i narkos ca 5 min.
7. Placera en alikvot av 0,8% låg smältpunkt agaros i en bägare med kranvatten och mikrovågsugn i 30 sekunder, eller tills agaros är smält. Låt bägaren svalna tills agaros i kulturen röret känns ljummet vid beröring (inte varmt).
8. Välj en sövd larv och överföra det till en enda eller flera väl 35 mm glas nedre skålen. Ta bort eventuellt vatten som överfördes med larven, sedan omedelbart täcka larven med tillräckligt varm agaros att fylla glasbottnad delen av skålen men inte skapa en stor kupol.
9. Som agarosen härdar, använda en dissekera nål för att positionera larven på sin sida på botten av skålen, sedan luta larven bara något på rygg. Det är absolut nödvändigt för skada och efterföljande avbildning, somden monterade larven finnas beröra glaset på botten av skålen. Använd dissekera nålen att upprätthålla larven i detta läge tills agaros stelnar och larven immobiliseras.
10. När agarosen är genomhärdad, långsamt pipettera nog Tricane vatten (detta kan vara samma Tricane används för anestesi) i skålen för att helt täcka agaros och larven.

2. Laser kalibrering och provning

1. Slå på alla konfokalmikroskop instrumentering, lämpliga lasrar diod för spännande zebrafisk transgener, och kväve-pumpad färglaser. Var noga med att "tomma" beam splitter är på plats, är lasern dämparen helt öppen, och 435 nm Kumarin färgämnescell är på plats. På datorn, öppna bildbehandlingsprogram.
2. Flytta en 63x 1.2NA objektiv nedsänkning i vatten i position och applicera en liten droppe nedsänkning medium för vatten mål på mål. En 63x mål kommer att möjliggöra god laser ablation noggrannhet, och vatten immersion möjliggör ett större arbetsavstånd, vilket är nödvändigt när man arbetar med 6-7 DPF zebrafisk larver.
3. Skaffa en glasskiva med en speglad sida som ska användas för kalibrering av lasern. Placera bilden, spegeln nedåt, på mikroskop scenen.
4. Använda okularet enligt brightfield belysning, hitta och fokusera på en repa eller etch i spegeln. Den brightfield ljus skall lysa ner på glasskivan, men kommer bara passera till målet på platser där spegeln har repats eller etsas bort, vilket gör att spegeln för att se svart genom okularet, och etsningar likna fläckar eller linjer av ljus.
5. Visa och fokusera etsningar på datorskärmen med hjälp av bildbehandlingsprogram. Öppna fönstret som styr lasern kalibrering och inställningar makt. Ställ in antalet pulser till "1" och dämpningen plattan till "3"% transmission. Antalet pulser representerar antalet gånger lasern avfyras inom varje region av intresse (ROI) och% transmission representerar lasereffekten. Kontrollera att korrekt kalibrering inställning är vald för 63x 1.2NA nedsänkning i vatten mål.
6. Välj ellipsverktyget på verktygslisten och klicka på bilden på datorskärmen för att skapa en enda cirkelformad ROI. Gör detta tre gånger tills det finns 4 cirkulära ROI fördelade slumpvis över bilden.
7. Vissa system kan innefatta en säkerhetsfunktion som inte kommer att tillåta laser för att skjuta om ljusets väg till okularen är öppen. Om detta är fallet, manuellt stänga ljusvägen till okularen vid denna tidpunkt.
8. Brand lasern. Detta kommer att skapa 4 små plats etsningar, en inom varje cirkulärt ROI. Om lasern inte avfyras, måste du kontrollera att lasern är påslagen och korrekt ansluten, och att strålgången till okularen är stängd. Om laser bränderna men ingen etsning syns, kontrollera att vara säker på att den "tomma" beam splitter är på plats. Om allt är på plats, ökar laserns effekt och "frap" tills etsningar ARe synlig. Om en lasereffekt inställning större än 10 är nödvändig för att etsa glas kan det indikera lasern plasma patron behöver bytas ut.
9. Om de etsade fläckar centrerad inom den valda ROI, ingen kalibrering behövs (fortsätt till 2,12). Om fläckarna inte finns mitt måste kalibreringsinställning som ska uppdateras.
10. För att kalibrera, klicka på uppdatera kalibreringen inställningen. Lasern avfyras och en bild visas som innehåller en enda etsad punkt. Om punkten inte visas avbryta kalibreringen, öka lasern makten, och starta kalibreringen igen.
11. Klicka i mitten av fläcken. Lasern kommer att avfyras, och en annan punkt visas. Klicka på den punkten, och upprepa processen tills kalibreringen är klar och 9 fläckar i en grid mode. Upprepa steg 2,6-2,9 för att kontrollera att kalibreringen lyckades.
12. Avlägsna glasskiva från mikroskopet scenen och rengör målet. Öppna ljusbanan till OCUlars, och ersätta "tomma" beam splitter med "100% ILL" beam splitter.

Tre. Nerve transection Använda laser ablation och Time-lapse Confocal avbildning av stödjeceller Beteenden

1. Ta steget används för att hålla glasskiva och ersätta med en scen som lämpar sig för att hålla 35 mm glas botten rätter. Fortsätt att använda 63x 1.2NA objektiv nedsänkning i vatten.
2. Applicera en liten droppe vatten nedsänkning medium till målet, och placera skålen med monterad larv på scenen. Stabilisera skålen med clips.
3. Använda okularet och widefield belysning, fokusera larven och lokalisera de motoriska nerverna. Skanna nerverna i hemisegments 10-20 och välj en nerv för transektion.
4. Ta fram en live-bild av nerven på datorskärmen med hjälp av bildprogram. Välj Z-plan och få en bild av axoner och gliaceller i den oskadade nerven.
5. Förbered tidsförlopp imaging inställningar i bildbehandlingsprogram för att fångaZ-projektioner av alla celltyper i 5-30 minuters intervall, beroende på experimentet. Det är bäst att skapa alla nödvändiga inställningar för den tid som förflutit innan du utför ablation, så det finns ingen fördröjning i början av tidsförlopp när skadan är komplett.
6. Ta bort "100% ILL" beam splitter och ersätt med "tomma". Stäng ljusets väg till okularen.
7. Återgå till levande-vy av nerven. Använd lämplig fluorescerande kanal för att visa de axoner som ska transected.
8. Använda ellipsverktyget, skapa en tunn elliptisk ROI i området som skall avlägsnas, sedan skapa mindre ROI inom det valda området.
9. I fönstret som styr laser inställningarna, ange antalet pulser till "2" och dämpningen plattan "18"% transmission. Brand lasern inom det valda ROI. Om fluorescens stannar inom ROI, öka lasern makten, vänta ca 10 sek, och avfyra lasern igen. Gör detta tills du når en inställning som orsakar fluorescence att försvinna inom ROI.
10. Vänta minst 10 sekunder och kontrollera borttagen området igen för fluorescens. Tänk på att en ROI initialt kan verka ablation, då det faktiskt photobleached. Om fluorescens avkastning, öka laser makt och avfyra lasern igen. Upprepa detta tills blomningstid försvinner inom ROI och inte återvänder inom 10 sek. Det är bäst att börja med en mindre laser makt och öka den nödvändiga makten. Den nödvändiga laser makt kan variera beroende på enskilda mikroskopi system, ålder av kumarin färgämne, prov montering, ålder larver, och tjockleken av vävnaden. När en idealisk lasereffekt har fastställts, kan denna effektinställning att användas igen på efterföljande nerver i samma experiment.
11. När ablation är klar, börjar tidsförlopp avbildning.
12. När tidsförlopp är klar, använda bildbehandlingsprogram för att sammanställa data och skapa färg komposit Z-projektioner för varje tidpunkt. Skapa en QuickTime-film för att analysera beteendetav axoner och gliaceller samtidigt.

Representative Results

Analysen som beskrivs här kan användas för att utvärdera svaret av gliaceller och andra nerv-associerade cellpopulationer till axonal skada in vivo. Movie 1 visar ett exempel på en nervskada skapas med hjälp av denna metod och svaret av omgivande gliaceller. Detta experiment utfördes i Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (OLIG2: DsRed) zebrafisk, där perineurial glia uttrycka ett membran riktade EGFP och motoriska neuroner uttrycker cytosoliska DsRed. Skadan skedde längs rostrala projektionen av en stam nerv i en 6 DPF levande zebrafisk, och nerven var därefter tidsförlopp avbildas i både EGFP och DsRed kanaler. Detta tillät samtidig visualisering av axon och gliaceller beteenden cell omedelbart efter skadan.

Figur 1 visar stillbilder av statiska tidpunkter tagna från film 1. Den streckade ellipsen visar ROI som var borttagen med laser. En minutpost transektion (MPT), saknade den ablationsbehandlade området fluorescens och skadan zonen mätte ca 3,5 um från den proximala till distala stumpen. Framgången för en transection kan bekräftas genom att avbilda den distala nerv stumpen och letar efter tecken på Wallerian degeneration, inklusive distala axon fragmentering och snabb clearance. Frånvaron av axonal fluorescens längs distala stumpen i figur 1 vid 120 mpt indikerar dessa axoner faktiskt har genomgått Wallerian degeneration och transection var framgångsrik.

Justera lasern makten till en idealisk miljö är avgörande när man utför experiment laserablationstekniker. Idealiska laser effektlägen kommer rent abiadera nerven endast inom den valda ROI, och laser effektlägen som antingen är för låga eller för höga kommer att ge suboptimala resultat. Figur 2a visar en skada som utfördes med en laser makt som var för låg. Fluorescens kvar inom ROI efter bränning lasern, Vilket resulterar i en ofullständig transektion. Figur 2b visar en skada som utfördes med en laser makt som var för hög, vilket resulterar i en extremt stor ablation.

Film 1. Motor nerv transection och konfokal tidsförlopp avbildning av perineurial gliacellsmarkörer beteende. Filmen visar en nervstam motor innan skadan, följt av en bild tagen 1 MPT, och bilder var 10 min för totalt 190 min. Skada utfördes i en levande 6 DPF Tg (nkx2.2a: megfp), Tg (OLIG2: DsRed). Zebrafisk larv monterad med främre till vänster och rygg till toppen Klicka här för att se filmen .

Figur 1. Motor nerv transection och stillbilderav stödjeceller beteende. Paneler är stillbilder tagna från film 1. Den prickade elliptiska område utgör det ROI som var borttagen, vilket skapar en transection skada betecknas med den streckade linjen. Pilspetsar pekar på axonal fluorescens som är närvarande vid 10 MPT, men inte vid 120 MPT, anger de distala axoner urartade. Skala bar, 10 um.

Figur 2. Suboptimal laser effektinställningar leder till oönskade resultat. (A) Ett försök till ablation utförs med en lasereffekt som är för låg. Den streckade ellipsen anger den valda ROI. 1 mpt området har varit något photobleached och inte transected (pilspets). (B) En ablation utförs med en lasereffekt som är alltför hög. Den streckade ellipsen betecknade den valda ROI. 1 mpt denablationsbehandlade området är mycket större än den valda ROI (streckad linje). Alla bilder är tagna från levande 6 dpf Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (OLIG2: DsRed) zebrafisk larver med främre till vänster och dorsala till toppen. Skala bar, 10 um.

Discussion

De mest kritiska stegen i denna experimentella designen är: 1) korrekt montering larver för skador och efterföljande in vivo imaging och 2) kalibrera lasern och välja rätt effektinställningar för att skapa en ren nerv transection som resulterar i minimalt extra-vävnadsskada . För att säkerställa en lyckad axotomy för in vivo imaging och efterföljande analys, montera flera larver antingen på enskilda rätter glas botten eller i ett glas nedre skålen med avdelare. Efter kalibrering av lasern, rekommenderar vi att du testar olika effektlägen på ett test larv att identifiera de optimala parametrarna för nerv transection. Dessa inställningar är vanligtvis ganska konsekvent mellan experiment, men kan ändras om: 1) larver inte är korrekt monterad, 2) larver av olika åldrar som används, 3) lasern inte korrekt kalibrerad, 4) lasern behöver underhåll eller 5) om nerver är belägna i mycket olika anterior-posterior positioner, som skulle medförai en skillnad i vävnadstjocklek. En optimal nerv transection kommer att skapa en skada längs en nerv som är mellan 2 och 5 | im och inte stör angränsande vävnad.

Vid en analys av svar av någon celltyp till nervsystemet skada, föreslår vi genomföra minst 2 typer av kontroller. Den första är att välja ett område för att skada som är omedelbart intill nerv av intresse, men är inte vidrör någon nervvävnad. Detta gör att du kan avgöra om de cellulära svaren du ser beror på skador i allmänhet, eller till skada på axoner. Den andra kontrollen är att avbilda en oskadad nerv i samma fisk som du har skapat en skada. Denna typ av kontroll eliminerar larv till larv variabilitet beroende på mellanstationer och bildbehandling parametrar, inklusive konfokala exponeringstider för avbildning etc.

I detta protokoll beskriver vi också scenarier som skapar skador som är för liten eller för stor för våra särskilda studier. Beroendenende på den experimentella fråga, kan dessa typer av skador användas för analys. De huvudsakliga begränsningar för denna typ av förfarande skulle vara de mål som finns för att skapa skada och efterföljande tidsförlopp avbildning. Den äldre larven du använder, desto längre arbetsavstånd mål krävs.

Protokollet som vi beskriver här tillåter användaren att skapa kontaktpunkter nerv transections längs djupa nerver i mogen larver. Vi par denna teknik för att in vivo, tidsförlopp imaging och använda ett kommersiellt tillgängligt system för laser ablation som reproducerbart skapar kontaktpunkter axon skador. Denna teknik kan ändras för att använda olika transgena linjer eller mutant larver att testa olika hypoteser om de mekanismer som återuppbygga nervsystemet efter skada.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenylthiourea	Sigma	P7629-100G
Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
Low melting point agarose	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One	VWR/Greiner	89125-444
Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick	Willco Wells	GWSt-3512
MicroPoint Laser System with all components	Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.	2203-SYS
MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)	Andor Technology	MP-27-435-DYE