Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging av Glial Cell atferd Live Sebrafisk

Summary

Selv om det perifere nervesystemet (PNS) er i stand til betydelig reparasjon etter skade, er lite kjent om de cellulære og molekylære mekanismer som styrer dette fenomenet. Ved hjelp av levende, transgen sebrafisk og en reproduserbar nerve transection analysen, kan vi studere dynamiske glial celle atferd under nerve degenerasjon og regenerasjon.

Abstract

Den nervesystemet blir ofte beskrevet som en fastkablet komponent av kroppen selv om det er et betydelig væske organ som reagerer på ytre stimuli på en konsekvent, stereotyp måte, og samtidig opprettholde en utrolig fleksibilitet og plastisitet. I motsetning til det sentrale nervesystemet (CNS), i det perifere nervesystemet (PNS) i stand til vesentlig reparasjon, men vi har nettopp begynt å forstå de cellulære og molekylære mekanismer som styrer dette fenomenet. Ved hjelp av sebrafisk som modell system, har vi den enestående muligheten til å par regenererende studier med in vivo avbilding og genetisk manipulasjon. Perifere nerver er sammensatt av aksoner omgitt av lag av gliaceller og bindevev. Axoner er ensheathed ved myelinating eller ikke-myelinating Schwann celler, som i sin tur er pakket inn i en fascicle av en mobil skjede kalt perineurium. Etter en skade, voksen perifere nerver har bemerkelsesverdig evne til remove skadet axonal rusk og re-innervate mål. For å undersøke rollene til alle perifer gliaceller i PNS gjenfødelse, beskriver vi her en axon transection analysen som bruker en kommersielt tilgjengelig nitrogen-pumpet dye laser til axotomize motoriske nervene i levende transgen sebrafisk. Vi videre beskrive metoder for å koble disse eksperimentene til time-lapse avbildning av skadde og kontroll nerver. Denne eksperimentelle paradigmet kan brukes til å ikke bare vurdere rollen som glia spiller i nerve gjenfødelse, men kan også være plattformen for å belyse de molekylære mekanismene som styrer nervesystemet reparasjon.

Introduction

Sebrafisk har vært brukt mye til å studere utviklingen av nervesystemet på grunn av deres optisk transparens og enkel transgenesis, som når kombinert, gir mulighet for spektakulære avbildning av dynamiske celle atferd i et levende embryo. I tillegg, fordi sebrafisk og pattedyr dele nesten alle gener som kreves for nervesystemet formasjon, cellulært og molekylært informasjon som er samlet i denne modellen organisme er direkte relatable til andre arter virveldyr. Selv om utrolig kraftig for nevrale utviklingsstudier, sebrafisk og dets unike egenskaper har potensial til også å belyse mekanismene som opprettholder og gjenoppbygge nervesystemet etter skade. Sebrafisk larver opprettholde sin gjennomskinnelighet i sene larvestadier og pigmentering kan være effektivt blokkert med enten bruk av farmakologiske hemmere av melanin produksjon eller genetiske mutanter som mangler pigment celler. Derfor, for å bruke denne modellen organisme studere skade og regeneration i eldre dyr er mulig og tilbyr en unik mulighet til å direkte undersøke cellulære og molekylære mekanismer som gjenoppbygge nervesystemet. I dette manuskriptet, beskriver vi hvordan du effektivt og reproduserbar skade nerver i PNS av sebrafisk larver. Denne skaden paradigmet gir seg til å studere ikke bare degenerasjon, men også svarene på perifer gliaceller og immunceller samt interaksjoner mellom disse populasjonene under regenerering.

PNS er et komplekst nettverk av motoriske og sensoriske nerver som er nødvendig for å sende informasjon mellom det sentrale nervesystemet (CNS) og i huden, muskler og organer i kroppen, slik at en organisme for å samhandle med omgivelsene og overleve. Langs disse nerver, perifer gliaceller, inkludert myelinating og ikke-myelinating Schwann-celler og perineurial gliaceller, samt bindevev, omslutter aksoner og slutt danner den modne nerve. Skade av disse nervene initierer en prosess known som Wallerian degenerasjon ^10. Denne mekanismen av aksonal fragmentering, immun rekruttering, rusk klarering og gjenfødelse er veldig stereotyp og genetisk regulert ^en. Tidligere studier i mammalske systemer har beskrevet rollene som Schwann celler under nerve degenerasjon og ^{en gjenfødelse, 2, 6, 8.} I disse studier av fast vev eller cellekultur, Schwann cellene ikke bare rekruttert makrofager til skaden området for å hjelpe til med rusk klaring, men også hjulpet i myelin fagocytose selv. Mens disse studiene har vært utrolig lærerikt, vi har aldri før visualiserte glial svar på perifer axon skade in vivo i sanntid, og ingen andre studier har undersøkt sammenhengen mellom de forskjellige klasser av perifer gliaceller i løpet av disse hendelsene.

Nylig har flere laboratorier undersøkt Wallerian degenerasjon bruker sebrafisk og laser-mediert axon skade som ligner på det vi beskriver her 4, 5, 9. I en annen studie, som er svært lik vår egen, ble dypere axoner innenfor ventrale motor nerve transektert i fem dager gamle larver ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig laser ablasjon system ^7. I begge disse eksperimentelle set-ups, var fokus på Wallerian degenerasjon og begge axoner og immunceller ble fotografert. For å utdype disse studiene beskriver vi skadet motoriske axoner i eldre larver med mer modne, myelinerte nerver og analyse responsen til alle nerve-assosiert perifer glia under degenerasjon og regenerasjon.

For å gjøre dette, transekt vi motoriske nerver i 6 og 7 dag etter befruktning (DPF) larver og visualisere svarene av individuelle glial bestander samt undersøke samspillet mellom disse populasjonene langs skadde axoner. Ved hjelp av dobbel og trippel transgenic linjer som etiketten perifer gliaceller, inkludert Schwann celler og perineurial gliaceller, samt en markør for axoner, bruker vi en kommersielt tilgjengelig laser ablasjon system som består av en nitrogen-pumpet dye laser (bølgelengde 435 nm) som er festet til en roterende disk confocal system å skape axon transections. Dette eksperimentelle oppsettet tillater oss å visualisere levende, larvenes sebrafisk, skade bestemte perifere motoriske axon traktater og time-lapse bilde svarene av forskjellige glial populasjoner til axon skade og deres forhold til hverandre. Denne protokollen kan videre tilpasses for å skape nerve skader i sebrafisk i ulike aldre, med ulike transgene linjer eller genetiske mutanter for å løse ulike vitenskapelige spørsmål.

Protocol

En. Utarbeidelse og montering av sebrafisk embryoer for ablasjon og Live Imaging

1. Forbered et lager på 0,8% lavt smeltepunkt agarose i egg vann. Delmengde inn 13X 100 mm disponibel kultur rør og oppbevar ved 4 ° C inntil nødvendig.
2. Cross voksen sebrafisk som inneholder stabilt integrert transgener til fluorescently merke motoriske nevroner og gliaceller celletyper av interesse. Samle sebrafisk embryoer i egg vann og plasser i 28,5 ° C inkubator for korrekt oppsetning senere ^tre.
3. Ved ca 24 timer etter befruktning (HPF), fjerne egg vann og tilsett 0,002% 1-fenyl 2-thiourea (PTU) i egg vann. Tilbake embryo til inkubatoren.
4. Mellom 24 og 96 HPF, bør embryoene bli undersøkt for tilstedeværelse av ønsket transgener på et fluorescerende dissekerende omfang. Plasser utvalgte embryoer i frisk PTU egg vann og gå tilbake til inkubatoren.
5. Når larvene har nådd seks dager etter befruktning (DPF) (eller ønsket alder), fjerne dem fra inkubatorenVelger noen larver for montering, og overføre dem til en mindre tallerken.
6. Fjerne vannet fra fatet og umiddelbart erstatte med ca 0,02% Tricane i PTU egg vann. Tillate larvene å sitte i narkose ca 5 min.
7. Plasser en alikvot av 0,8% lavt smeltepunkt agarose i et beger med vann fra springen og mikrobølgeovn i 30 sekunder eller inntil den er smeltet agarose. Tillat begerglasset kjøles til agarose i kulturen røret føles lunken ved berøring (varme).
8. Velg en bedøvet larve og overføre den til en singel eller multi-brønn 35 mm glassbunn parabolen. Fjern eventuelt vann som ble overført med larve, deretter umiddelbart dekke larven med nok varme agarose å fylle glassbunn del av parabolen, men ikke lage en stor kuppel.
9. Som agarose stivner, bruk en dissekere nål for å plassere larven på sin side i bunnen av fatet, deretter vippe larve bare litt på ryggen. Det er viktig for skade og påfølgende bildebehandling, sommontert larve berøre glasset på bunnen av fatet. Bruk dissekere nål for å opprettholde larven i denne stilling inntil den er størknet og agarose larven immobiliseres.
10. Når agarose er fullt herdet, sakte pipette nok Tricane vann (dette kan være den samme Tricane brukes til anestesi) i formen til å fullstendig dekke agarose og larve.

2. Laser Kalibrering og testing

1. Slå på alle confocal mikroskop instrumentering, passende diode lasere for spennende sebrafisk transgener, og nitrogen-pumpet dye laser. Pass på at "blank" beam splitter er på plass, er laser demperen helt åpen, og 435 nm Coumarin fargestoff celle er på plass. På datamaskinen åpner bildebehandlingsprogrammer.
2. Flytte en 63x 1.2NA vannimmersjonsobjektiv på plass og bruke en liten dråpe nedsenking medium for vann mål på mål. En 63x objektiv vil gi rom for god laser ablasjon nøyaktighet, og vann immersion tillater en større arbeidsavstand, noe som er nødvendig når det arbeides med 6-7 dpf zebrafisk larver.
3. Skaff en glass-slide med en speilvendt side å bruke for kalibrering av laseren. Plasser lysbildet, speil side ned, på mikroskopet scenen.
4. Bruke okularet henhold lysfelt belysning, finne og fokusere på en ripe eller etse i speilet. Den lysfelt lys skal skinne ned på glass slide, men vil bare passere gjennom til mål på steder der speilet har blitt ripete eller etset bort, forårsaker speilet for å se svart gjennom okularet, og etsninger å se ut som flekker eller linjer av lys.
5. Vis og fokusere etsninger på dataskjermen ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer. Åpne vinduet som styrer laser kalibrering og strøminnstillingene. Sett antall pulser til "1" og dempningen platen til "3"% transmisjon. Antallet pulser som representerer antallet av ganger laseren avfyres innenfor hvert område av interesse (ROI), og% transmisjon representerer lasereffekten. Pass på riktig kalibrering er valgt for den 63x 1.2NA vannimmersjonsobjektiv.
6. Velg ellipse verktøyet fra hovedverktøylinjen, og klikk på bildet på skjermen for å lage en enkelt sirkulær ROI. Gjør dette tre ganger til før det er fire sirkulær ROIs fordelt tilfeldig over bildet.
7. Noen systemer kan omfatte en sikkerhetsfunksjon som ikke vil tillate at laseren til brann hvis lyset banen til okulars er åpen. Hvis dette er tilfelle, manuelt lukke lysbanen til okulars på dette tidspunktet.
8. Brann laser. Dette vil skape fire små spot-etsninger, en i hver runde ROI. Hvis laseren ikke brann, sjekk for å være sikker på at laseren er slått på og koblet riktig, og at lyset banen til okulars er stengt. Hvis laseren branner, men ingen etsning er sett, sjekk for å være sikker på at den "blank" beam splitter er på plass. Hvis alt er på plass, øke laser makt og "frap" inntil etsninger are synlig. Hvis en laser koketrinn større enn 10 er nødvendig for å etse glass, kan dette indikere at laseren plasma patronen må skiftes.
9. Hvis etset flekker sentrert innenfor det valgte ROIs, er ingen kalibrering nødvendig (fortsett til 2.12). Hvis flekkene ikke er sentrert, må kalibreringsinstillingene å bli oppdatert.
10. For å kalibrere, klikk oppdateringen kalibreringen innstillingen. Laseren vil brann og et bilde vil vises med én enkelt etset punkt. Hvis punktet ikke vises, avbryte kalibreringen, øke laser makt, og starte kalibreringen igjen.
11. Klikk i sentrum av flekken. Laseren vil fyre igjen, og et annet punkt vil vises. Klikk dette punktet, og gjenta denne prosessen til kalibreringen er ferdig og ni flekker i et rutenett mote. Gjenta trinn 02.06 til 02.09 for å sjekke at kalibreringen var vellykket.
12. Fjern glass-slide fra mikroskopet scenen og rengjøre målet. Åpner lys banen til OCUlars, og erstatte "blank" strålesplitter med "100% ILL" beam splitter.

3. Nerve transection Bruke laser ablasjon og Time-lapse Confocal Imaging av Glial Cell atferd

1. Fjern scenen brukes til å holde glasset lysbilde og erstatte med en scene egnet for å holde 35 mm glassbunn retter. Fortsett å bruke 63x 1.2NA vannimmersjonsobjektiv.
2. Påfør en liten dråpe vann nedsenking medium til målet, og sett formen med montert larve på scenen. Stabilisere fatet med klipp.
3. Ved hjelp av okularet og widefield belysning, fokus larven og finne de motoriske nervene. Skanne nervene i hemisegments 10-20 og velg en motor nerve for transection.
4. Ta opp en live-visning av nerve på dataskjermen ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer. Velg Z-flyene og få et bilde av axoner og gliaceller av uskadde nerve.
5. Forbered time-lapse bildeinnstillinger i bildebehandlingsprogrammer for å fangeZ-projeksjoner av alle celletyper i 5-30 min intervaller, avhengig av forsøket. Det er best å lage alle nødvendige innstillinger for time-lapse før du utfører ablasjon, så det er ingen utsettelse av time-lapse når skaden er fullført.
6. Ta ut "100% ILL" beam splitter og erstatte med "blank". Lukk lyset banen til okulars.
7. Tilbake til live-visning av nerve. Bruk riktig fluorescerende kanalen å vise axoner som vil bli transektert.
8. Bruke ellipse verktøyet, lage en tynn elliptisk ROI i området som skal ablated, og deretter opprette mindre ROIs innenfor den valgte regionen.
9. I vinduet som styrer laser, angi antall pulser til "2" og demping plate til "18"% transmisjon. Brann laseren innenfor det valgte ROIs. Hvis fluorescens restene innenfor ROIs, øke laser makt, vent ca 10 sek, og fyre av laseren igjen. Gjør dette til du kommer til en innstilling som forårsaker fluorescence å forsvinne i ROIs.
10. Vent 10 sekunder eller mer og sjekk ablated området igjen for fluorescens. Vær oppmerksom på at en ROI kan i utgangspunktet virke ablated, når det faktisk er photobleached. Hvis fluorescens avkastning, øke laser makt og fyre av laseren igjen. Gjenta dette til florescence forsvinner i ROIs og ikke tilbake innen 10 sekunder. Det er best å starte med en mindre laser makt og øke til nødvendig kraft. Den nødvendige laser makt kan variere basert på individuelle mikroskopi systemer, alder Coumarin fargestoff, prøven montering, alder av larver, og tykkelsen på vevet. Når en ideell laser makt er etablert, kan denne kraften innstillingen brukes igjen ved senere nerver i det samme eksperimentet.
11. Når ablasjon er fullført, begynner time-lapse imaging.
12. Når time-lapse er ferdig, bruker bildebehandlingsprogrammer for å sammenstille data og lage farge kompositt Z-anslag for hvert tidspunkt. Lag en QuickTime-film å analysere atferdenav axoner og gliaceller samtidig.

Representative Results

Analysen beskrevet her kan brukes til å vurdere responsen av glial-celler og andre nerve-assosierte cellepopulasjoner til aksonal skade in vivo. Film 1 viser et eksempel på en nerveskade laget ved hjelp av denne metoden og responsen til omliggende gliaceller. Dette eksperimentet ble utført i Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (olig2: DsRed) sebrafisk, der perineurial glia uttrykke en membran målrettet EGFP og motor nevroner uttrykke cytosolic DsRed. Skaden ble gjort langs rostral projeksjon av en koffert motor nerve i en 6 DPF levende sebrafisk, og nerven var senere time-lapse avbildes både i EGFP og DsRed kanaler. Dette tillot samtidig visualisering av axon og glial celle atferd umiddelbart etter skaden.

Figur 1 viser stillbilder av statiske tidspunkter tatt fra Movie en. Den stiplede ellipse viser avkastningen som ble ablated hjelp av laser. Ett minuttpost transection (mpt), manglet ablated området fluorescens og skaden sonen målt ca 3,5 um fra den proksimale til distale stubben. Suksessen til en transection kan bekreftes ved avbildning distale nerve stubben og ser etter tegn på Wallerian degenerasjon, inkludert distal axon fragmentering og raske clearance. Fraværet av aksonal fluorescens langs distale stump i figur 1 på 120 mpt indikerer disse axoner har virkelig gjennomgått Wallerian degenerasjon og transection var vellykket.

Justering av laser strøm til en ideell setting er kritisk når du utfører laser ablasjon eksperimenter. Ideell laser strøminnstillingene vil rent ablate nerve bare innenfor det valgte ROI, og laser strøminnstillingene som er enten for lavt eller for høyt vil gi suboptimale resultater. Figur 2a viser en skade som ble utført med en laser makt som var for lavt. Fluorescens forble innenfor ROI etter avfyring av laser, Noe som resulterer i en ufullstendig transection. Figur 2b viser en skade som er utført med et laser-kraft som var for høy, noe som resulterer i en ekstremt stor ablasjon.

Film en. Motor nerve transection og confocal time-lapse avbildning av perineurial glial celle atferd. Filmen viser en koffert motor nerve før skade, etterfulgt av et bilde tatt en MPT, og bildene hvert 10 min i totalt 190 min. Skade ble utført i en live seks DPF Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (olig2: DsRed). Sebrafisk larve montert med anterior til venstre og dorsal til toppen Klikk her for å se film .

Figur 1. Motor nerve transection og stillbilderav glial celle atferd. Panels er stillbilder tatt fra Movie en. Den stiplede elliptiske området representerer den avkastningen som ble ablated, og skaper en transection skade merket med stiplet linje. Pilspisser peker til aksonal fluorescens som er til stede ved 10 MPT, men ikke ved 120 MPT, som indikerer distale aksoner degenerert. Scale bar, 10 mikrometer.

Figur 2. Suboptimale laser strøminnstillingene fører til uønskede resultater. (A) Et forsøk ablasjon utføres med en laser makt som er for lavt. Den stiplede ellipse betegner den valgte ROI. 1 mpt området har vært litt photobleached og ikke transektert (pilspiss). (B) En ablasjon utføres med en laser makt som er for høy. Den stiplede ellipse betegnet den valgte ROI. 1 mpt denablated området er mye større enn den valgte ROI (stiplet linje). Alle bildene er tatt fra live-6 DPF Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (olig2: DsRed) sebrafisk larver med anterior til venstre og dorsal til toppen. Scale bar, 10 mikrometer.

Discussion

De mest kritiske trinn av denne eksperimentelle design er: 1) riktig montering larver for skade og påfølgende in vivo avbildning og 2) kalibrering av laseren og velge de riktige effektinnstillinger for å lage et rent nerve transection som resulterer i minimal ekstra-vevsskade . For å sikre en vellykket axotomy for in vivo avbilding og påfølgende analyse, montere flere larver i enten individuelle glassbunn retter eller i en glassbunn fatet med skillevegger. Etter kalibrering av laser, anbefaler vi at du tester forskjellige strøminnstillingene på en test larve å identifisere de optimale parametre for nerve transection. Disse innstillinger er vanligvis ganske konsekvent mellom eksperimenter, men kan endres hvis: 1) larvene ikke er montert riktig, 2) larver av forskjellige aldre benyttes, 3) fra laseren er ikke riktig kalibrert 4) laseren trenger vedlikehold eller 5) hvis nervene er plassert i svært forskjellige anterior-posterior posisjoner som ville resulterei en forskjell i vev tykkelse. En optimal nerve transection vil skape en skade langs en nerve som er mellom 2 og 5 mikrometer og ikke forstyrrer nabolandet vev.

Ved å analysere responsen fra en celle for å nervesystemet skade, foreslår vi gjennomfører minst to typer kontroller. Den første er å velge et område for å skade som er umiddelbart ved siden av nerve av interesse, men er ikke berører noen nervevev. Dette vil tillate deg å avgjøre om de cellulære responser du ser er på grunn av skade generelt, eller til skade av aksoner. Den andre kontrollen er å avbilde en uninjured nerve i den samme fisken som du har opprettet en skade. Denne typen kontroll eliminerer larve til larve variasjon pga iscenesettelse og bildebehandling parametere, inkludert konfokale eksponeringstider for bildebehandling, osv.

I denne protokollen også vi beskriver scenarier som skaper skader som er for liten eller for stor for våre spesielle studier. Avhengighetding på den eksperimentelle spørsmålet, kan disse typer skader anvendes for analyse. De viktigste begrensninger i denne type prosedyre ville være målene tilgjengelige for å opprette skaden og påfølgende time-lapse imaging. Jo eldre larven du bruker, jo lengre arbeidsavstand objektiv nødvendig.

Protokollen vi beskriver her tillater brukeren å skape kontaktpunkter nerve transections langs dype nerver i modne larver. Vi par denne teknologien til in vivo, time-lapse bildebehandling og bruke en kommersielt tilgjengelig laser ablasjon system som reproduserbart skaper kontaktpunkter axon skader. Denne teknologien kan endres for å bruke forskjellige transgene linjer eller mutant larver for å teste ulike hypoteser om hvilke mekanismer som gjenoppbygge nervesystemet etter skade.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenylthiourea	Sigma	P7629-100G
Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222	Argent Chemical	C-FINQ-UE-100G
Low melting point agarose	Sigma	A9414-10G
Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One	VWR/Greiner	89125-444
Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick	Willco Wells	GWSt-3512
MicroPoint Laser System with all components	Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.	2203-SYS
MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)	Andor Technology	MP-27-435-DYE