Summary
Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.
Abstract
El sistema nervioso se describe a menudo como un componente de cableado del cuerpo a pesar de que es un sistema de órgano considerablemente líquido que reacciona a los estímulos externos en una manera estereotipada coherente, mientras que se mantiene la flexibilidad y plasticidad increíble. A diferencia del sistema nervioso central (SNC), el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación significativa, pero sólo han comenzado a comprender los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso del pez cebra como modelo de sistema, tenemos la oportunidad sin precedentes de estudios de regeneración con par de imágenes in vivo y la manipulación genética. Los nervios periféricos se componen de los axones rodeados por capas de células gliales y el tejido conectivo. Los axones se envainado por myelinating o no myelinating células de Schwann, que son a su vez envuelto en un fascículo por una vaina celular llamado el perineuro. Después de una lesión, los nervios periféricos adultos tienen la notable capacidad de remoHe dañado restos axonal y objetivos re-inervan. Para investigar las funciones de todos los glía periférica en PNS la regeneración, como se describe aquí un ensayo de transección axón que utiliza un láser de colorante bombeado por nitrógeno disponible en el mercado a axotomize nervios motores en el pez cebra transgénico vivo. Se describen además los métodos para acoplar estos experimentos para time-lapse de los nervios lesionados y control. Este paradigma experimental se puede utilizar no sólo para evaluar el papel que el juego glía en la regeneración de los nervios, pero también puede ser la plataforma para elucidar los mecanismos moleculares que gobiernan la reparación del sistema nervioso.
Introduction
El pez cebra se han utilizado ampliamente para estudiar el desarrollo del sistema nervioso a causa de su transparencia óptica y la facilidad de transgénesis, que cuando se combina, para permitir la proyección de imagen espectacular de los comportamientos dinámicos de células en un embrión vivo. Además, dado que el pez cebra y los mamíferos comparten casi todos los genes necesarios para la formación del sistema nervioso, la información celular y molecular recogido en este organismo modelo es directamente relacionar con otras especies de vertebrados. Aunque increíblemente poderosa para los estudios de desarrollo neural, el pez cebra y sus atributos únicos tienen el potencial de también dilucidar los mecanismos que mantienen y reconstruir el sistema nervioso después de la lesión. Larvas de pez cebra mantener su translucidez en los estadios larvales finales de los años y la pigmentación puede ser efectivamente bloqueada, ya sea con el uso de inhibidores farmacológicos de la producción de melanina o mutantes genéticos que carecen de células de pigmento. Por lo tanto, el uso de este organismo modelo para el estudio de lesiones y regeneration en animales mayores es posible y ofrece la oportunidad única de investigar directamente los mecanismos celulares y moleculares que reconstruir el sistema nervioso. En este manuscrito, se describe la forma de perjudicar de manera eficiente y reproducible nervios en el SNP de larvas de pez cebra. Este paradigma de lesión se presta al estudio no sólo la degeneración, sino también las respuestas de glía periférica y células inmunes, así como las interacciones entre estas poblaciones durante la regeneración.
El SNP es una red compleja de nervios motores y sensoriales que es necesario para pasar información entre el sistema nervioso central (SNC) y la piel, músculo y órganos del cuerpo, lo que permite un organismo para interactuar con su entorno y sobrevivir. A lo largo de estos nervios, glía periférica, incluyendo las células mielinizantes y no mielinizante de Schwann y células gliales perineural, así como el tejido conectivo, encierran los axones y en última instancia formar el nervio madura. Lesión de los nervios inicia un proceso known como la degeneración walleriana 10. Este mecanismo de fragmentación axonal, la contratación inmune, limpieza de escombros y la regeneración es muy estereotipada y regulada genéticamente 1. Estudios previos en los sistemas de mamíferos han descrito las funciones de las células de Schwann del nervio durante la degeneración y la regeneración 1, 2, 6, 8. En estos estudios de tejido fijado o cultivo de células, las células de Schwann no sólo macrófagos reclutados al sitio de la lesión para ayudar en la limpieza de escombros, sino también ayudaron en sí mismos la fagocitosis de mielina. Si bien estos estudios han sido muy informativo, nunca tenemos ante respuestas gliales visualizados a la lesión axonal periférica en vivo, en tiempo real, y no hay otros estudios han investigado la relación entre los diferentes tipos de glía periférica durante estos eventos.
Recientemente, varios laboratorios han investigado la degeneración walleriana utilizando el pez cebra y el daño axonal láser mediada similar a lo que se describe aquí
Para ello, nos transecto nervios motores de 6 y 7 días después de la fertilización (dpf) larvas y visualizar las respuestas de las poblaciones gliales individuales, así como investigar las interacciones entre esas poblaciones a lo largo de los axones lesionados. Usando tra dobles y tripleslíneas nsgenic que glía periférica etiqueta, incluyendo las células de Schwann y células gliales perineural, así como un marcador de los axones, que utilizan un sistema de ablación por láser disponible comercialmente que consiste en un átomo de nitrógeno bombeado por láser de colorante (longitud de onda 435 nm) conectada a un sistema confocal de disco giratorio para crear transections axón. Este montaje experimental nos permite visualizar, larvas de pez cebra en vivo, dañar la imagen de lapso de tiempo las respuestas de las poblaciones gliales distintos tractos de axones motores periféricos específicos y al daño axonal y su relación entre sí. Este protocolo puede ser adaptado, además, para crear lesiones nerviosas en el pez cebra de diferentes edades, con diferentes líneas de transgénicos o mutantes genéticos para abordar diferentes cuestiones científicas.
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Protocol
1. Preparación y montaje de embriones de pez cebra de Ablación e imágenes en vivo
- Preparar un balance de 0,8% agarosa de baja fusión en el agua del huevo. Alícuota en 13X mm cultura tubos desechables 100 y se almacena a 4 ° C hasta que se necesite.
- Adultos de pez cebra Cross contiene transgenes integrados establemente para etiquetar fluorescente neuronas motoras y tipos de células gliales de interés. Recoger los embriones de pez cebra en el agua del huevo y colocar en 28.5 ° C incubadora para una correcta estadificación posterior 3.
- Aproximadamente a las 24 horas después de la fecundación (HPF), eliminar el agua de huevo y añadir 0,002% 1-fenil 2-tiourea (PTU) en el agua de huevo. Embriones Volver a la incubadora.
- Entre el 24 y el 96 HPF, los embriones deben ser examinados para la presencia de transgenes deseados en un microscopio de disección fluorescente. Coloque embriones seleccionados en agua PTU huevo fresco y volver a la incubadora.
- Cuando las larvas han llegado a 6 días después de la fertilización (dpf) (o la edad deseada), sacarlos de la incubadora, Seleccionar unas pocas larvas para el montaje, y transferirlos a un plato más pequeño.
- Eliminar el agua de la fuente y reemplace inmediatamente con aproximadamente 0,02% en agua Tricane huevo PTU. Permita que las larvas se siente en anestesia aproximadamente 5 min.
- Colocar una alícuota de 0,8% agarosa de baja fusión en un vaso de precipitados con agua del grifo y microondas durante 30 segundos, o hasta que la agarosa se funde. Deje que el recipiente se enfríe hasta que la agarosa en el tubo de cultivo se siente tibia al tacto (no caliente).
- Seleccione una larva anestesiados y transferirlo a un único o múltiples pocillos de 35 mm plato con fondo de cristal. Quite el agua que se ha transmitido con la larva, luego cubra inmediatamente la larva con suficiente calor agarosa para llenar la parte de vidrio de fondo del plato, pero no crear una gran cúpula.
- A medida que la agarosa se endurece, utilizar una aguja de disección para posicionar la larva en su lado en la parte inferior del plato, a continuación, incline la larva sólo ligeramente en su parte posterior. Es imprescindible para la lesión y la posterior formación de imágenes, quela larva montado estar en contacto con el vidrio en la parte inferior del plato. Utilice la aguja de disección para mantener la larva en esta posición hasta que la agarosa se solidifica y la larva se inmoviliza.
- Una vez que la agarosa esté completamente endurecido, lentamente pipetear agua Tricane suficiente (esto puede ser la misma Tricane utilizado para la anestesia) en el plato para cubrir completamente la agarosa y larva.
2. Calibración láser y pruebas
- Encienda todos los instrumentos confocal microscopio, los láseres de diodo apropiados para emocionantes transgenes pez cebra, y el nitrógeno bombeado por láser de colorante. Asegúrese de que el rayo "en blanco" splitter está en su lugar, el atenuador de láser está completamente abierta, y la celda de colorante 435 nm cumarina está en su lugar. En el equipo, abra el software de imágenes.
- Mover un objetivo de inmersión en agua 1.2NA 63x en su posición y aplicar una pequeña gota de medio de inmersión para los objetivos de agua sobre el objetivo. Un objetivo 63x permitirá una buena precisión la ablación con láser, y el agua immersion permite para una distancia de trabajo más grande, que es necesaria cuando se trabaja con 6-7 larvas de pez cebra dpf.
- Obtener un portaobjetos de vidrio con una cara de espejo para utilizar para la calibración del láser. Coloque la tapa, espejo lateral hacia abajo, sobre la platina del microscopio.
- Con el ocular de bajo iluminación de campo claro, encontrar y centrarse en un rasguño o grabar en el espejo. La luz campo claro estará brillando hacia abajo sobre la lámina de vidrio, pero sólo pasará a través del objetivo en lugares donde el espejo ha sido rayados o grabado de distancia, haciendo que el espejo para mirar negro a través del ocular, y los grabados se vea como manchas o las líneas de luz.
- Ver y enfocar los grabados en la pantalla del ordenador con software de imágenes. Abra la ventana que controla la calibración láser y la configuración de energía. Establecer el número de pulsos a "1" y la placa de la atenuación de la transmisión% "3". El número de impulsos representa el número de veces que el láser se disparará dentro de cada región de interés (ROI) y el% de transmisión representa la potencia del láser. Asegúrese de que el ajuste de la calibración correcta se selecciona para el objetivo de inmersión en agua 1.2NA 63x.
- Seleccione la herramienta elipse desde la barra de herramientas y haga clic en la imagen en la pantalla del ordenador para crear un ROI circular. Haga esto 3 veces más hasta que haya 4 ROI circular espaciados al azar sobre la imagen.
- Algunos sistemas pueden incluir un dispositivo de seguridad que no permite que el láser para disparar cuando la trayectoria de la luz a los oculares está abierta. Si este es el caso, cerrar manualmente la trayectoria de la luz a los oculares en este momento.
- Disparar el láser. Esto creará 4 aguafuertes lugar pequeño, 1 en cada ROI circular. Si el láser no se dispara, verifique que el láser esté encendido y conectado correctamente y que la trayectoria de la luz a los oculares se cierra. Si se dispara el láser de grabado, pero no se ve, verifique que el "blanco" divisor de haz está en su lugar. Si todo está en su lugar, aumentar la potencia del láser y "frap" hasta que el aguafuertes are visibles. Si es necesario grabar el vidrio de un establecimiento de más de 10 la potencia del láser, esto puede indicar que el cartucho de plasma láser necesita ser reemplazado.
- Si las manchas grabadas aparecen centradas en el ROI seleccionada, no se requiere calibración (proceder a 2,12). Si las manchas no están centrados, el ajuste de calibración debe ser actualizado.
- Para calibrar, haga clic en la actualización de la configuración de calibración. El láser se activará y aparecerá una imagen que contiene un único punto grabado. Si no aparece el momento, cancelar la calibración, aumentar la potencia del láser, y comenzar la calibración de nuevo.
- Haga clic en el centro de la mancha. El láser se disparará de nuevo, y aparecerá otro punto. Haga clic en ese punto, y repetir este proceso hasta que la calibración se ha completado y 9 puntos aparecen en forma de cuadrícula. Repita los pasos 2.6 a 2.9 para comprobar que la calibración se ha realizado correctamente.
- Retire la lámina de vidrio de la platina del microscopio y limpiar el objetivo. Abra el paso de luz a la OCUlars, y vuelva a colocar el divisor de haz "en blanco" con el "100% ILL" divisor de haz.
3. Transección del nervio Uso Ablación Láser y Time-lapse de imágenes confocal de Conductas de células gliales
- Retire el escenario se utiliza para mantener la lámina de vidrio y reemplazar con un escenario adecuado para la celebración de 35 mm con fondo de cristal platos. Continúe utilizando el objetivo de inmersión en agua 1.2NA 63x.
- Aplique una pequeña gota de medio de inmersión en agua con el objetivo, y colocar el plato con larva montado en el escenario. Estabilizar el plato con clips.
- Con el ocular de campo amplio y la iluminación, el enfoque de la larva y localizar los nervios motores. Digitalizar los nervios en hemisegments 10-20 y seleccione un nervio motor de transección.
- Traiga un live-vista del nervio en la pantalla de ordenador con software de imágenes. Seleccionar Z-planos y adquirir una imagen de los axones y células gliales del nervio no lesionado.
- Preparar los ajustes de imagen de lapso de tiempo en el software de imágenes para capturarZ-proyecciones de todos los tipos de células en intervalos de 5-30 min, dependiendo del experimento. Lo mejor es crear todos los ajustes necesarios para el lapso de tiempo antes de realizar la ablación, lo que no hay retraso en el inicio del lapso de tiempo una vez que la lesión es completa.
- Quite el "100% ILL" divisor de haz y reemplazar con el "blanco". Cierre el paso de luz a los oculares.
- Vuelva a la visualización en directo del nervio. Utilice el canal de fluorescencia correspondiente para ver los axones que se secciona.
- Usando la herramienta de elipse, crear un retorno de la inversión elíptica delgada en el área de la ablación, a continuación, crear regiones de interés más pequeña dentro de la región seleccionada.
- En la ventana que controla los ajustes del láser, ajuste el número de pulsos a "2" y la placa de la atenuación de la transmisión% "18". Encienda el láser dentro de la ROI seleccionada. Si los restos de fluorescencia en el rendimiento de la inversión, aumentar la potencia del láser, espere unos 10 segundos y disparar el láser de nuevo. Haga esto hasta que llegue a una configuración que hace que fluorescence a desaparecer dentro de la ROI.
- Espere al menos 10 segundos y compruebe el área de ablación de nuevo por fluorescencia. Tenga en cuenta que un retorno de la inversión puede parecer inicialmente ablación, cuando en realidad es photobleached. Si la rentabilidad de fluorescencia, aumentar la potencia del láser y disparar el láser de nuevo. Repita este procedimiento hasta fluorescencia desaparece en el rendimiento de la inversión y no vuelve dentro de 10 seg. Lo mejor es comenzar con una potencia de láser menor y aumentar la potencia necesaria. La potencia necesaria puede variar en función de distintos sistemas de microscopía, la edad de tinte cumarina, montaje de muestras, la edad de las larvas y el grosor del tejido. Una vez que una potencia del láser ideales se ha establecido, este ajuste de potencia puede ser utilizado de nuevo en los nervios posteriores en el mismo experimento.
- Una vez que la ablación se ha completado, comenzará time-lapse.
- Cuando el lapso de tiempo, se debe utilizar el software de imágenes para compilar datos y crear color compuesto Z-proyecciones para cada momento. Crear una película QuickTime para analizar el comportamientode los axones y células gliales simultáneamente.
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Representative Results
El ensayo descrito aquí se puede utilizar para evaluar la respuesta de las células gliales y otras poblaciones celulares del nervio asociadas a lesión axonal in vivo. Película 1 muestra un ejemplo de una lesión del nervio creado usando este método y la respuesta de las células gliales circundantes. Este experimento se realizó en Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) pez cebra, en el que la glía perineural expresar una membrana específica EGFP y el motor neuronas expresan citosólica DsRed. La lesión se hizo a lo largo de la proyección rostral de un nervio motor del tronco de un pez cebra en vivo 6 dpf, y el nervio fue posteriormente a intervalos reflejado tanto en la EGFP y canales dsRed. Esta visualización simultánea permitida del axón y las conductas de células gliales inmediatamente después de la lesión.
La figura 1 muestra las imágenes fijas de estática puntos de tiempo tomados de la película 1. La elipse punteada muestra el retorno de la inversión que se realizó ablación con el láser. En un minutoposte transección (MPT), la zona separada por ablación carecía de fluorescencia y la zona de lesión mide aproximadamente 3,5 um desde el extremo proximal al muñón distal. El éxito de una transección se puede confirmar mediante formación de imágenes el muñón distal del nervio y en busca de signos de degeneración walleriana, incluyendo axón distal fragmentación y eliminación rápida. La ausencia de fluorescencia axonal a lo largo del muñón distal en la Figura 1 a 120 MPT indica estos axones de hecho han sido sometidos a la degeneración walleriana y la transección fue un éxito.
Ajuste de la potencia del láser para un entorno ideal es crítico cuando se realizan experimentos de ablación láser. Configuración de energía láser Ideal se limpia la ablación del nervio sólo dentro de la ROI seleccionada y la configuración de energía de láser que son demasiado bajos o demasiado altos darán resultados óptimos. Figura 2a muestra una lesión que se lleva a cabo con una potencia de láser que era demasiado bajo. La fluorescencia se mantuvo dentro de la ROI después de disparar el láser, Lo que resulta en una incompleta transección. Figura 2b muestra una lesión que se lleva a cabo con una potencia de láser que era demasiado alto, lo que resulta en una cantidad extremadamente grande de ablación.
Movie 1. Motor transección del nervio y confocal time-lapse de comportamiento de las células glial perineurial. Película muestra un motor del nervio tronco antes de la lesión, seguido de una imagen tomada 1 MPT, y las imágenes cada 10 min para un total de 190 min. Lesión se realizó en un vivo 6 dpf Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed). Larva de pez cebra montado con anterior a la izquierda y dorsal hasta la parte superior Haga clic aquí para ver la película .
Figura 1. Transección del nervio motor y de imágenes fijasdel comportamiento de las células gliales. Los paneles son imágenes fijas tomadas de la película 1. El área elíptica de puntos representa el retorno de la inversión que se realizó ablación, la creación de una lesión en la transección denotada por la línea de puntos. Las puntas de flecha apuntan a la fluorescencia axonal que está presente al 10 MPT, pero no a 120 MPT, indicando los axones distales degeneraron. Barra de escala, 10 micras.
Figura 2. Configuración de energía láser subóptimas conduce a resultados no deseados. (A) Un intento de ablación lleva a cabo con una potencia de láser que es demasiado bajo. La elipse punteada indica la ROI seleccionada. 1 MPT la zona ha sido ligeramente photobleached y no seccionado (punta de flecha). (B) Una ablación lleva a cabo con un láser de potencia que es demasiado alto. La elipse punteada denota la ROI seleccionada. 1 MPT laárea de ablación es mucho más grande que el ROI seleccionada (línea punteada). Todas las imágenes son tomadas de vivo 6 dpf Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed), larvas de pez cebra con la anterior a la izquierda y dorsal de la parte superior. Barra de escala, 10 micras.
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Discussion
Los pasos más importantes de este diseño experimental son: 1) correctamente larvas de montaje para la lesión y posterior de imágenes in vivo y 2) calibrar el láser y la selección de los ajustes de potencia correctos con el fin de crear un corte transversal del nervio limpio que resulta en un daño mínimo del tejido extra- . Para ayudar a asegurar una axotomía exitoso para imágenes in vivo y análisis posterior, monte larvas múltiples, ya sea en platos individuales con fondo de cristal o en un plato con fondo de cristal con separadores. Después de calibrar el láser, recomendamos probar diferentes valores de energía de una larva de prueba para identificar los parámetros óptimos para la transección del nervio. Estos ajustes son por lo general bastante consistentes entre los experimentos, pero pueden cambiar si: 1) las larvas no se montan correctamente, 2) las larvas de diferentes edades se utilizan, 3) el láser no está calibrado correctamente, 4) el láser necesita mantenimiento o 5) si los nervios se encuentran en posiciones muy diferentes anterior-posterior que resultaríanen una diferencia en el espesor del tejido. Un corte transversal del nervio óptimo creará una lesión a lo largo de un nervio que es entre 2 y 5 micras y no perturbe el tejido vecino.
Al analizar la respuesta de cualquier tipo de células a una lesión del sistema nervioso, se sugiere la realización de al menos 2 tipos de controles. La primera es la selección de un área de dañar que está inmediatamente al lado del nervio de interés, pero no está tocando cualquier tejido nervioso. Esto le permitirá determinar si las respuestas celulares que se ven son debido a los daños en general, o una lesión de los axones. El segundo control es a la imagen de un nervio sano en el mismo pescado que ha creado una lesión. Este tipo de control elimina larva larva a la variabilidad debido a los parámetros de ensayo y de formación de imágenes, incluyendo tiempos de exposición confocal para imágenes, etc
En este protocolo también se describe escenarios que crean lesiones que son demasiado pequeños o demasiado grandes para nuestros estudios particulares. Depending sobre la cuestión experimental, estos tipos de lesiones pueden ser utilizados para el análisis. Las principales limitaciones de este tipo de procedimiento serían los objetivos para la creación de la lesión y posterior time-lapse. Cuanto más vieja la larva que utilice, el objetivo mayor distancia de trabajo requerido.
El protocolo se describe aquí permite al usuario crear transections nerviosas focales a lo largo de los nervios profundos en larvas maduras. Nos pareja esta tecnología en vivo, time-lapse y utilizar un sistema de ablación por láser disponible comercialmente que reproducen crea lesiones focales axón. Esta tecnología se puede modificar para utilizar diferentes líneas transgénicas o larvas mutante para probar diferentes hipótesis acerca de los mecanismos que reconstruyen el sistema nervioso después de la lesión.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Laboratorio Kucenas valiosa para los debates y quórum Technologies, Inc. para soporte técnico excelente. El trabajo fue apoyado por el Fondo UVa para la Excelencia en Ciencia y Tecnología (FEST) (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
References
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