Abstract
توليد وتحليل الآفات الوعائية في النماذج الحيوانية المناسبة هو حجر الزاوية للبحث في أمراض القلب والأوعية الدموية، وتوليد معلومات هامة عن التسبب في تشكيل الآفة والعمل من علاجات جديدة. استخدام الفئران المعرضة للتصلب الشرايين، الأساليب الجراحية من آفة التعريفي، وتعديل النظام الغذائي قد تحسنت بشكل كبير فهم الآليات التي تساهم في تطور المرض واحتمال علاجات جديدة.
تقليديا، يتم إجراء تحليل للآفات خارج الجسم الحي باستخدام تقنيات النسيجية 2-الأبعاد. توضح هذه المقالة تطبيق التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية (الأراضي الفلسطينية المحتلة) إلى الكميات 3 الأبعاد للآفات الشريانية. لأن هذا الأسلوب هو غير مدمرة، يمكن استخدامه كمساعد للالتحليلات النسيجية والمناعية القياسية.
استميلت الآفات Neointimal بواسطة سلك الإدراج أو ربط الماوس الفن الفخذتم إنشاء ريها بينما آفات تصلب الشرايين عن طريق إدارة نظام غذائي تصلب الشرايين على الفئران APOE التي تعاني من نقص.
تم فحص الآفات باستخدام التصوير الأراضي الفلسطينية المحتلة من الانبعاثات autofluorescent تليها النسيجية التكميلية وتحليل المناعى. الأرض الفلسطينية المحتلة الآفات المتميزة بوضوح من جدار الأوعية الدموية الأساسي. تم حساب حجم الآفة في القسمين 2-الأبعاد باستخدام planimetry، مما يتيح حساب حجم الآفة والحد الأقصى من مساحة المقطع العرضي. وكانت البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام الأراضي الفلسطينية المحتلة بما يتفق مع القياسات التي تم الحصول عليها باستخدام الأنسجة، مما يؤكد دقة هذه التقنية وإمكاناتها كتكملة (بدلا من البديل) إلى الأساليب التقليدية للتحليل.
يوضح هذا العمل إمكانات الأراضي الفلسطينية المحتلة لتصوير تصلب الشرايين وneointimal الآفات. وهو يوفر، خارج الحي التقنية السريعة التي تشتد الحاجة إليها لتقدير 3-الأبعاد الروتيني لإعادة الأوعية الدموية.
Introduction
تشكيل الآفات الشريانية أمر أساسي لارتفاع معدلات المراضة والوفيات المرتبطة بأمراض القلب والأوعية الدموية 1. يعتبر تشكيل الآفة أن يكون ناجما عن استجابة التهابية غير المقيدة لالشرايين إصابة 2. تشكل آفات تصلب الشرايين ببطء في الاستجابة لإصابة مزمنة لجدار الشرايين في حين الآفات restenotic وضعها بعد بسرعة التلف الميكانيكي الحاد (على سبيل المثال، بعد الدعامة الزرع). وقد تم توضيح الآليات التي تسهم في تطوير الآفات الشريانية إلى حد كبير عن طريق استخدام نماذج حيوانية مناسبة، في كثير من الأحيان في تركيبة مع التلاعب الجيني ذات الصلة 1.
تحليل حجم الآفة والتكوين الكلاسيكي يعتمد بشكل كبير على المجراة سابقا، 2-الأبعاد الأنسجة (على الرغم من أن هذا بدأ يتغير مع تطور أساليب محسنة في الجسم الحي وخارج الحي كشف وتحليل الآفات في الحيوانات الصغيرة <سوب> 3). التحليل النسيجي للآفات الشريانية هي عمالة كثيفة، تستغرق وقتا طويلا، ويوفر معلومات محدودة من هيكل 3-الأبعاد. على سبيل المثال، يتم تقييم عبء الآفة عادة عن طريق قياس مساحة المقطع العرضي للآفة (إما في مواقع مختارة عشوائيا أو في موقع الأقصى انسداد). وهذا يوفر تحليلا غير مكتمل من عبء الآفة بشكل عام. كله يشن تقدم تكنولوجيا التصوير 3 الأبعاد والحلول الممكنة لهذه المشكلة ولكن تم وصفها قليلة للغاية نهج مناسبة. قد يكون هذا يرجع أساسا إلى حجم الشرايين الماوس التي تكون كبيرة جدا لاحد الفوتون المجهري متحد البؤر ولكنها صغيرة جدا للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 4 والأشعة السينية التصوير المقطعي (CT) 5. تطبيق فيفو السابقين التصوير بالرنين المغناطيسي والصغرى CT لدراسة آفات تصلب الشرايين في فئران يوحي أنها توفر قرار محدود، حتى في الشرايين الكبيرة نسبيا. يضاف إلى كل ذلك، ومرات الاستحواذ طويلة نسبيا المطلوبةلحد الإنتاجية (وزيادة تكاليف المسح الضوئي) 4،6.
تطوير طرائق التصوير الضوئي الجديدة (مثل التصوير المقطعي البصري التماسك 3،7 والصورة الصوتية التصوير المقطعي 8) تقدم الكثير من الإمكانيات لتحسين التصوير الآفات في شرايين الفئران. يظهر إمكانات مماثلة من قبل المقطعي الإسقاط الضوئية (الأراضي الفلسطينية المحتلة) التي وضعت للسماح للتحليل أجنة الفئران. وقد تم تصميم الأراضي الفلسطينية المحتلة لعينات صورة تتراوح بين ~ 0،3 حتي 10 مم وقطرها 9. التصوير نقل يسجل غموض عينة شبه شفافة للضوء المرئي متعدد الألوان، ويمكن أن تستخدم لتحديد الهياكل التشريحية. الانبعاثات سجلات التصوير انبعاث الضوء التالية الإثارة في موجات محددة من الذاتية (على سبيل المثال، الكولاجين، الإيلاستين) وfluorophores الخارجية في العينة. هذا ويمكن أيضا توفير المعلومات التشريحية (منذ مكونات الأنسجة المختلفة يمكن أن تختلف في نوع وكثافة الأنواع autofluorescentالحالي). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد توزيع مناعية أو التعبير الجيني باستخدام تحقيقات الفلورسنت المناسب (10). إما وضع التصوير (نقل أو الانبعاثات)، يركز الضوء على جهاز إلى جانب المسؤول عن السماح تكرارية التقاط الصور كما تدور عينة (عادة 400 صورة في 0.9 درجة الزيادات). هذه يمكن استخدامها لحساب حجم التداول بنسبة أساليب إعادة الإعمار تصوير الشعاعي الطبقي القياسية (مثل المصفاة الخلفية الإسقاط (باستخدام خوارزمية مخروط) أو إعادة تكراري).
يوضح هذا الفيديو تطبيق رواية لدينا من الأراضي الفلسطينية المحتلة لتحليل 3-الأبعاد السريع، وقابلة للقياس الكمي وفعالة من حيث التكلفة لآفات تصلب الشرايين وneointimal، كما هو موضح سابقا في كيركبي وآخرون. 11. وقد أظهرت هذه التقنية لتكون مناسبة لقياس حجم الآفة في ثلاثة نماذج شائعة الاستخدام: (ط) الفخذ الشريان الأسلاك الإصابات؛ (ب) الفخذ الشريان الربط، و (ج) تصلب الشرايين الناجم عن النظام الغذائي في apolipoproteiن E ناقصة (APOE - / -) الفئران.
Protocol
1. الحث الجراحي لNeointimal الآفات في الشريان الفخذي ماوس
- التجارب باستخدام الحيوانات يجب أن يتم تنفيذ وفقا لمتطلبات الأخلاق الوطنية والمؤسسية. يجب أن يتم تنفيذ كل عملية جراحية باستخدام تقنية العقيم المناسبة. ويتحقق تحريض الآفات neointimal باستخدام تعديل لهذه التقنية التي وصفها روكي وآخرون. 12 وساتا وآخرون. 13.
- تزن الذكور C57Bl6 / J الفئران (العمر 10-12 أسابيع؛ وزن 25-30 جم) ثم تخدير عن طريق تقديم 4-5٪ الأيزوفلورين في غرفة الاستقراء. مرة واحدة وقد تم بفعل التخدير، ونقل الماوس إلى حصيرة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. تواصل إدارة الأيزوفلورين (2-3٪) عن طريق قناع.
- مرة واحدة وقد يتسبب على مستوى مناسب من التخدير (عدم استجابة إلى أخمص قدميه قرصة)، وتوفير غطاء مسكن من قبل إدارة البوبرينورفين (0.1 ملغم / كغم -1). ثم ضع الماوس في موقف ضعيف لد حلق السطح البطني للhindlimb اليسار.
- إجراء شق لفضح عضلات hindlimb العلوي، وبين التشعب مع الشريان المأبضي وجدار البطن، استخدم تشريح حادة لعزل الشريان الفخذي والوريد من العصب الفخذي. ري الجرح كما هو مطلوب باستخدام 1٪ ث / ت يجنوكائين.
- وضع الداني (على مقربة من جدار البطن) والبعيدة (مباشرة أسفل الفرع مع الشريان المأبضي) الحروف المركبة مؤقتة (6/0 Mersilk) حول الشريان الفخذي والوريد للسيطرة على تدفق الدم. ثم عزل الشريان المأبضي (ما يقرب من 2-5 ملم البعيدة إلى فرع مع الشريان الفخذي) وligate بشكل أقصى. وضع الثاني، ضمد غير مقيدة تحت الشريان المأبضي.
- إجراء شق صغير (بضع الشريان) في الشريان المأبضي، البعيدة على الفور إلى فرع مع الشريان الفخذي، ومنع النزيف عن طريق الضغط على ربطة مؤقت الداني. دفع على التوالي، انتشرت 0.014 "سلك التوجيه1-1.5 سم على طول الشريان الفخذي في اتجاه جدار البطن وتترك في مكان لمدة 30 ثانية (الشكل 1A).
- إزالة سلك التوجيه وligate الشريان المأبضي فوق بضع الشريان، وذلك باستخدام رباط وضعت لهذا الغرض، ومع الحرص على عدم انسداد الشريان الفخذي.
ملاحظة: للحصول على الإصابة الناجمة عن ربط. Neointimal إعادة دون وقوع إصابات داخل اللمعة يمكن أن يتسبب كتبها ligating الشرايين الفخذية أو المأبضية (1B الشكل و1C). ولتحقيق ذلك اتبع الخطوات من 1،1-1،5. ومع ذلك، لا تجعل بضع الشريان ولكن (تجنب الخطوة 1.6) إما (ط) ligate الشريان المأبضي البعيدة على الفور إلى الشريان الفخذي أو (ب) ligate الشريان الفخذي مشترك في نقطة تفرع مع الشريان المأبضي. ثم المضي قدما في الخطوة 1.8. - إزالة الحروف المركبة مؤقتة، أغلق الجرح مع خياطة الخارجية متقطع (5/0 Mersilk) وتطبيق كريم EMLA (2.5٪ ليدوكائين، 2.5٪ بريلوكائين). السماح للحيوانات لإعادة اكتساب الوعي (عادة 5-10 دقيقة) وتأكد من أنهم يتحركون بحرية في جميع أنحاء القفص (قد يكون عرج طفيف واضحا في المحطة المتضررة ولكن هذا يجب حل خلال 2-3 أيام الأولى بعد الجراحة) قبل أن تعود إلى غرف القابضة. الفئران لا يجب أن يكون مقر منفردة بعد الجراحة.
- السماح للحيوانات لاسترداد لمدة تصل إلى 3 أشهر. وسوف تبدأ الآفات الصغيرة لتظهر ~ 7 أيام بعد الإصابة الأسلاك وسوف تصل إلى الحد الأقصى لحجم مستقر بعد ~ 21-28 يوما.
2. تحريض تصلب الآفات في ئي E - / - الفئران
- إدارة النظام الغذائي الغربي (0.2٪ الكوليسترول في الدم؛ الحمية البحوث، USA) للذكور، 6 أسابيع الفئران APOE-باطل القديم (ولدت في بيت) لمدة 12 أسبوعا.
- آفات تصلب الشرايين وغالبا ما تكون مرئية على التفتيش الإجمالي من قوس الأبهر والفروع الأساسية (الشكل 2).
3. تحليل الشرياني الآفات باستخدام الإسقاط الضوئي المقطعي (الأراضي الفلسطينية المحتلة)
الإقليم الشمالي "> ملاحظة: تم الحصول على الصور من الأراضي الفلسطينية المحتلة آفات في الشرايين الفخذية الفئران وعينات قوس الأبهر باستخدام التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية.- الموت ببطء الفئران عن طريق تثبيت transcardiac نضح واستنزاف تحت التخدير الطرفي (80 ملغ / كغ بنتوباربيتال الصوديوم)، وذلك باستخدام heparinised (10 U / مل) الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تليها 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة.
- عزل الشرايين الفخذية أو قوس الأبهر والفروع الأساسية (يسار الشريان السباتي، الشريان تحت الترقوة الأيسر والجذع العضدي الرأسي)، حسب الاقتضاء، وإزالة المواد شبه براني الدخيلة. ما بعد الإصلاح في 10٪ من الفورمالين مخزنة O / N، قبل تخزينها في الايثانول 70٪ لحين الحاجة إليها.
- الشرايين تضمين في 1.5٪ نقطة انصهار منخفضة الاغاروز وتصفيتها قبل من خلال هتما 113 V الورق. نعلق كل عينة إلى الأراضي الفلسطينية المحتلة المغناطيسي جبل مع لاصقة cyanoacrylate مع محور السفينة وتمشيا مع هذا الجبل. تقليم الاغاروز الزائدة إلى شكل مخروطي. يذوى في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 12 ساعة على الأقل.
- Cسفن لير عن طريق الغمر (لمدة 12-24 ساعة) في خليط من الكحول البنزيل بنزوات البنزيل و(1: 2 ت / ت).
- وضع عينات مسح في التصوير المقطعي معايرة. تعيين دقة إلى 1024 X 1024، وتحديد والتكبير البصري الذي يسمح للمنطقة بأكملها من الفائدة أن ينظر إليها. حجم الأرض الفلسطينية المحتلة هي الخواص يتم بناؤها محور Z إلى نفس القرار (أي 1024 X 1024 X 1024)، وحجم فوكسل ~ 200 ميكرون. وهذا قد يمثل الإفراط في تقدير قرار كما أن هناك احتمالا أن تكون القطع الأثرية إعادة الإعمار. ضبط الموقف العينة بحيث تدور على محورها الخاص في مركز مجال الرؤية في حقل مشرق، وقناة الإرسال.
- في قناة الانبعاثات مرشح GFP1 (فلتر الإثارة 425 نانومتر مع 40 نانومتر الفرقة تمرير؛ تصفية الانبعاثات: 475 تمريرة طويلة نانومتر)، والتركيز على العينة وضبط وقت التعرض لتعظيم المدى الديناميكي للصورة الناتجة (تجنب الإفراط في التشبع). تفحص سفينة في القناة الانبعاثات GFP1 فقط، مع خطوة 0،9 درجة دوران. </ لى>
- في الإنجاز، تأكيد الجودة من الحصول على البيانات باستخدام برنامج DataViewer. إزالة عينة من الماسح الضوئي.
- للسماح للتحليل النسيجي لاحق، عينة مكان في الميثانول بنسبة 100٪ ل> 24 ساعة قبل تجهيزها لشمع البارافين كالمعتاد.
4. صورة إعادة الإعمار وتحليل
يتم إجراء تصوير الشعاعي الطبقي إعادة البناء التي تمت تصفيتها الخلفية الإسقاط باستخدام برنامج NRecon أو ما شابه ذلك. إعادة البناء لا يمكن أن يؤديها غير المراقب، على دفعات.
- تحسين جودة الصورة من خلال التعويض عن اختلال وتعديل مستويات شدة الصورة.
- تحقق من جودة الصورة باستخدام برنامج إعادة الإعمار DataViewer.
- تحديد القسم المناسب للعينة لتحليلها. الحفاظ على هذا الطول متناسقا بين السفن إذا أبعاد اللمعية هي ليتم تسجيلها.
- تحديد الخطوط العريضة للآفات من خلال تتبع يدويا الحدود المناسبة ل1 في كل 50 شيدت إعادة العابرة للأقسام.
- التحقق من كل معشق المقطع العرضي لضمان الزيادات الحاسوب ولدت صحيحة. ضبط يدويا الحدود عند الضرورة.
- تعيين عتبة مستوى الرمادي بحيث يتم تحديد فقط الآفة وتصدير بيانات القياس.
- لكل فحص، وتحديد منطقة عمودية من الفائدة التي تحتوي على الآفة وتتبع الحدود بين وسائل الإعلام وneointima (أي.، موقف الصفيحة المرنة الداخلية) لكل ال 50 خط مسح. أقحم الحدود البطانية / وسائل الإعلام للخطوط المسح معشق في مجال البرمجيات، والتحقق من وتصحيح صالح عند الاقتضاء. المزيد من هذه الشريحة تعريف ثلاثة مجلدات الأبعاد إلى عتبة كثافة محددة يدويا لإنتاج مجموعة صورة الثنائي الذي بكسل البيضاء تمثل neointima وبكسل سوداء تمثل التجويف البراءة.
- القياسات التي اتخذت في ما يلي: إجمالي حجم الآفة (حجم الكائن)، وحجم اللمعية (السعة الإجمالية - حجم الكائن) وتوزيع الآفة والتجويف عبر طائفةمنطقة IONAL على طول المحوري للسفينة التي شملتها الدراسة.
Representative Results
مسح أولي لصحية (unlesioned) الشرايين الفخذية الفئران (ن = 5) أثبت أن التصوير لم نقل لا توفر الصور المفيدة. وكان هذا نتيجة للشرايين مسح تصبح شفافة جدا (وليس مبهمة للغاية) لimaging.However انتقال، وهذا مفيد للتصوير الانبعاثات حيث لا يوجد الامتصاصية / تناثر الإشارة المنبعثة. في المقابل، الشرايين الفخذية autofluoresce بقوة في القناة الانبعاثات، مع أكبر إشارة التالية الإثارة في 405-445 نانومتر (بما يتفق مع الإثارة ذروتها 410 نانومتر لالإيلاستين 14). شرائح 2-الأبعاد بناؤها من هذه الصور تتميز بوضوح وسائل الإعلام من التجويف والبرانية والتجويف.
في الشرايين الفخذية الفئران التي تحصد بعد 28 يوما wire- (ن = 6) أو ligation- (ن = 5) وكانت الإصابة الناجمة عن neointimal سماكة واضحة في توقعات الانبعاثات غير تصوير الشعاعي الطبقي (الشكل 3A). في إعادة بنائها 2-dimensشرائح IONAL، يمكن تمييز الآفات neointimal متحدة المركز من وسائل الاعلام الخاصة بانبعاث الأضعف (الشكل 3B) والشكل (S1).
صور الانبعاثات الأراضي الفلسطينية المحتلة من عينات جبل بأكمله من قوس الأبهر والفروع الرئيسية لها من الفئران تصلب الشرايين (ن = 8) الآفات التي تم تحديدها مع التوزيع التشريحي المتوقع (أي، في انحناء أقل من قوس الأبهر، الشريان العضدي الرأسي، وأصول من الشريان السباتي الأيسر والشرايين تحت الترقوة اليسرى (الشكل 4A). صورا مقطعية وأشارت إلى أن هذه الأمور عادة آفات غريب الأطوار، وكانت بسهولة حاليا من وسائل الإعلام والتجويف (الشكل 4B، أرقام S2 و S3).
وأكدت معالجة الشرايين للتحليل النسيجي التالية الأراضي الفلسطينية المحتلة طبيعة غير مدمرة للأرض الفلسطينية المحتلة، مع أقسام ملطخة بنجاح باستخدام النسيجية (الولايات المتحدة ثلاثي الألوان، Picrosirius الأحمر) والمناعى (α-SMA، ماك-2) تقنيات (أرقام 3C و4C).
وقد تبين قياس حجم الآفة باستخدام الأراضي الفلسطينية المحتلة لتكون متسقة مع القياسات التي تم الحصول عليها باستخدام تحليل الصور من المقاطع النسيجية المأخوذة من نفس الشريان 11.
قياسات Planimetric من منطقة الآفة التي حصلت عليها الأراضي الفلسطينية المحتلة والأنسجة المترابطة بشكل وثيق من قبل الانحدار الخطي لwire- (R 2 = 0.92) والتي يسببها ربط (R 2 = 0.89) الآفات neointimal وويحات تصلب الشرايين (R 2 = 0.85). المهم الاستفادة من الأراضي الفلسطينية المحتلة هو قدرته على تمكين تحليل 3-الأبعاد. من خلال تطوير الكمي الحجمي للآفات مع هذه التقنية، تمكنا من تسجيل أحجام الآفة في wire- (0.1100 ± 0.0091 مم 3، ن = 6) والشرايين بجروح ربط الفخذ (0.0200 ± 0.0089 مم 3، ن = 5)، وكذلك في شرايين عضدي رأسي تصلب الشرايين (0.180 ± 0.018 مم 3. ن = 8). وكانت القياسات استنساخه للغاية (معامل التغير 5.4٪، 11.4٪ و 4.8٪ على التوالي، ن = 4) لجميع أنواع الآفة. وكانت الآفات Neointimal في السفن جرح سلك أكبر (P <0.0001) من تلك التي تنتجها ربط، بما يتفق مع درجة أكبر من الأضرار التي لحقت السابق.
ويمكن أيضا أن يتم التعبير عن البيانات التي تم إنشاؤها لمحات الآفة (الشكل 5) وجعل لدينامية التقييم، النوعي (أنظر الشكلين S1 - S3). أثبت هذا النهج بوضوح مدى تشكيل الآفة ردا على الإجراءات إصابة مختلفة، وسلط الضوء على التوزيع غير المتكافئ للتشكيل الآفة في الأوعية الدموية المصابة.
الشكل 1: طرق للبدء في تشكيل آفة في الشريان الفخذي الفئران & #.160؛ (A) الإدراج إلى الوراء لقسطرة سلك التوجيه في الشريان الفخذي، وذلك عن طريق بضع الشريان في الشريان المأبضي يحفز تشكيل الآفة في استجابة لتمتد الإصابة والتخلص من البطانة. وإعادة تأسيس تدفق الدم خلال القسم المصاب من السفينة. (B) انتشار Neointimal في غياب داخل اللمعة وتمتد، وتعرية أو انقطاع تدفق الدم يمكن أن يسببها ligating إما الفخذ أو الشريان المأبضي البعيدة على الفور إلى الشريان الفخذي التشعب. (C) A أشد غير تجريد استجابة الإصابة / الانتشار يمكن أن يسببها ligating كل من شرايين الفخذ والمأبضية عبر نقطة تفرع الشريان الفخذي مشترك. وهذه التقنية أيضا عرقلة تدفق الدم في الجزء الأعلى من الشريان الفخذي.
الشكل 2: ترسب المميزة من التصلب في قوس الأبهر الماوس تصلب الشرايين المعرضة (Apolipopotein E الفئران ناقصة) غذى ارتفاع نسبة الكولسترول الغذائي الغربي لمدة 12 أسبوعا تطوير نمط مميز من ترسب الآفة في قوس الأبهر والفروع الرئيسية. كما هو موضح، والآفات واضحة (الأسهم)، عن طريق التفتيش الإجمالي تحت المجهر تشريح، في قوس الأبهر، الشريان العضدي الرأسي، وفي فوهات الشريان السباتي الأيسر والشريان تحت الترقوة الأيسر.
الرقم 3: تشكيل الآفات التالية ربط الشريان الفخذي الأيمن (A) الصور الانبعاثات مضان عدم تصوير الشعاعي الطبقي (مقلوب لزيادة وضوح - المناطق المظلمة تتوافق مع انبعاث أقوى) يمكن التعرف على باطنة سماكة (arrowhe الأحمرالإعلانات). (B) مناطق الأوعية الدموية متميزة والتجويف يمكن تمييزها في إعادة البناء تصوير الشعاعي الطبقي. (C) التحليل النسيجي (الولايات المتحدة ثلاثي الألوان) يؤكد تشابه واضح مع الصور التي تم الحصول عليها باستخدام الأراضي الفلسطينية المحتلة. الحانات النطاق في (AC) هي 200 ملم. مقتبس من كيركبي وآخرون 11 أشرطة النطاق في (AC) هي 200 ميكرون.
الرقم 4: التصوير من تصلب الشرايين في قوس الأبهر تصلب الشرايين الفئران المعرضة (A) عصيدة (السهام الحمراء) هو واضح بسهولة في صور غير تصوير الشعاعي الطبقي (مقلوب بحيث المناطق الداكنة تشير الانبعاثات أقوى، وبالتالي تحسين وضوح) من قوس الأبهر، في مواقع تنبأ كما عصيدة الحمل عن طريق التفتيش تحت المجهر الضوئي (انظر الشكل 2). (B) ويؤكد هذا النمط من التوزيع في كر الشعاعي الطبقيتابعنا المقاطع. ويبين (C) النسيجية (الولايات المتحدة ثلاثي الألوان) تلطيخ تشابه وثيق مع أقسام تصوير الشعاعي الطبقي، والمناعية باستخدام أجسام مضادة عديدة تؤكد على الطابع التكاملي للأرض الفلسطينية المحتلة مع الأساليب التقليدية لتحليل الآفة. الحانات النطاق في (A-B) هي 1 مم؛ شريط النطاق في (C) هو 250 ميكرون. RSA، الشريان تحت الترقوة اليمنى. RCA، الشريان السباتي الأيمن. LCA، الشريان السباتي الأيسر. LSA، غادر الشريان تحت الترقوة. BCA، الشريان العضدي الرأسي. تعالوا، الصعود الشريان الأورطي. داو، تنازلي الشريان الأورطي. مقتبس من كيركبي وآخرون 11
الشكل 5: تحليل الآفة والتجويف ملامح يشير متفاوتة مدى انتشار neointimal ردا على الطرق المختلفة للإصابات الشرايين الإسقاط الضوئي المقطعي يسمح الآفة والتجويف عبر measuremen المقطعية.نهاية الخبر أن تآمر ضد المسافة على طول الشريان الفخذي. هذا يدل بوضوح على أنه، مقارنة مع الشريان لم يصب (A)، ربط الجزئي (B) تنتج، والآفات منفصلة نسبيا صغيرة، في حين ربط الكلي (C) وتنتج انسداد كامل في موقع ربط لكن الآفة لا تمتد بعيدا على طول الشريان . إصابة سلك داخل اللمعة (D) تنتج الآفة التي تسبب انسداد شبه كامل في الجزء الأعلى من العينة، ويمتد على طول القسم ممسوحة ضوئيا من الشريان. مقتبس من كيركبي وآخرون 11
الرقم S1. التعمير المتحركة من الصور مستعرضة تم الحصول عليها من شريان الفخذ الماوس بعد إصابة ربط هذا النوع من صورة متحركة مفيد لكلا التحليل الكيفي والكمي. كما ينتقل للرسوم المتحركة من الأقرب إلى أقسام البعيدة للشريان التطور التدريجي لneointima انسداد، القرصernible من التجويف وسائل الإعلام، غير بادية للعيان. فروع جانبية يمكن التعرف عليها بسهولة، وهناك انسداد اللمعية واضحا وإعادة الخارج من الشريان كما يزيد الآفة في الحجم. يحدث انسداد كامل للسفينة وعند الوصول إلى الموقع من الربط. مقتبس من كيركبي وآخرون 11
. الرقم S2 إعادة الإعمار رسوم متحركة من صور مقطعية للقوس الأبهر من الماوس عرضة للتصلب الشرايين والرسوم المتحركة تبدأ مع المقاطع العرضية للتصاعدي (من اليسار - الذي يظهر لأول مرة) وتنازلي (يمين) الشريان الأورطي. تظهر الآفات الصغيرة في الأبهر الصاعد بينما يتحرك المسح الضوئي في اتجاه قوس الأبهر. الصور ثم التحرك من خلال القوس لإظهار ثغرات lesioned بشدة من عضدي رأسي (يسار)، السباتي الأيسر (وسط) وتحت الترقوة اليسرى (يمين) الشرايين. كما يتحرك الفحص بشكل أقصى طول هذه الفروع الآفات يقلل تدريجيا وتختفي، لأول مرة في subcالشريان lavian، ثم في الشريان السباتي، وأخيرا في الشريان العضدي الرأسي. ومن المثير للاهتمام، والآفة في التحركات الشريان العضدية الرأسية على المفرق تدفق كما هذه السفينة يقسم إلى الشريان السباتي الأيمن والشرايين تحت الترقوة اليمنى. مقتبس من كيركبي وآخرون 11
الرقم S3. المتحركة، صورة-أصدرت حجم قوس الأبهر من الماوس عرضة للتصلب الشرايين. الإسقاط الضوئي المقطعي يسمح توليد الصور 3-الأبعاد، في هذه الحالة يدل توزيع الآفة في قوس الأبهر لئي E الماوس ناقص. (A) عصيدة غير موجودة في المواقع المتوقع (في جميع أنحاء الشريان العضدي الرأسي، في أوستيا من الشريان السباتي وتحت الترقوة اليسرى والشرايين في انحناء أقل من قوس الأبهر). (B) الإنقسام وجعل من الآفة (كما هو موضح باللون الأحمر) تحمل المقاطع العرضية يشدد على توزيع اللوحات عندما فرضه على الصورة الأصلية.مقتبس من كيركبي وآخرون 11
Discussion
تحليل 3-الأبعاد لديها امكانات كبيرة لاستبدال أو إضافة إلى التقنيات النسيجية 2-الأبعاد التي لا تزال تدعم غالبية التحقيقات في تشكيل آفة الشرايين. هنا يظهر الأراضي الفلسطينية المحتلة في شرايين الفئران الصغيرة (مع الشرايين الفخذية الفئران ربما تمثل أصغر الأوعية التي يمكن تحليلها بنجاح باستخدام هذه التقنية). غير أنه، ومناسبة أيضا للاستخدام مع الشرايين (والآفات) من الأنواع الأخرى، بما في ذلك سفن الإنسان الحجم الصغيرة والمتوسطة. وقد استخدمت مجموعتنا بنجاح هذه التقنية لتحليل الآفات في أرنب الشريان الأورطي (Bezuidenhout وآخرون؛ غير منشورة). الأراضي الفلسطينية المحتلة يعد أسرع التحليل وزيادة المعلومات الهيكلية مقارنة مع الأنسجة التقليدية ولها ميزة عدم منع التحليل اللاحق للعينة باستخدام تقنيات كلا النسيجية والمناعية.
الصور المنتجة باستخدام الأراضي الفلسطينية المحتلة أعطت التفاصيل التشريحية، والتي تبين مواقع تشكيل الآفةوحجم الآفات في هذه المجالات. الشرايين المستخدمة في هذه التحقيقات هي على الأرجح قريبة من الحد من قرار للتقنية وجودة الصورة وبالتالي تضعف إلى درجة معينة من خلال الأعمال الفنية (وربما الناتجة عن دوران اختلال والمقاصة غير مكتملة، والانعكاس / الانكسار في القمم الاغاروز ومشاكل التركيز) . على الرغم من هذا، والتفاصيل المطلوبة (أي طبقات من جدار الوعاء الدموي) لا تزال ملحوظ، وبالتالي فإن أسلوب مفيد للغاية لتقدير حجم طبقات الفردية. في الواقع، يمكن أن يكون كميا الصور بسرعة وبتكاثر لتوفير قياسات الآفة وحجم اللمعية في أقسام تحمل لوحة للسفينة، وكذلك المناطق مستعرضة الآفة والتجويف في مواقع مختارة في العينة. الكبيرة (الشريان الأورطي) والمتوسطة (الفخذ، السباتي، تحت الترقوة) شرايين الفئران - تلك التي تستخدم عادة لتحليل تشكيل الآفة تصلب الشرايين وneotintimal في الفئران - كانت بنجاحتحليلها باستخدام هذا الأسلوب. في الواقع نحن لم تستخدم الآن الأراضي الفلسطينية المحتلة لإثبات تأثير التدخلات الدوائية والتلاعب الجيني على تصلب الشرايين وneointimal حجم الآفة. على سبيل المثال، endothelin مستقبلات الحصار تغيير تشكيل الآفة neointimal حين حذف انتقائي لمستقبلات endothelin B من بطانة الأوعية الدموية لم يكن 15. في تصلب الشرايين الفئران المعرضة، عرضت حذف الجينية للأنزيمات 11β-HSD1 16 أو galectin 3 17 إلى تقليص حجم آفات تصلب الشرايين.
الكمي لحجم الآفة هو فائدة واضحة من الأراضي الفلسطينية المحتلة. أنه يعطي مؤشرا أكثر إفادة من عبء الآفة الكلي في أحد الشرايين 4 من عادة يتم الحصول عليها بطرق النسيجية. تحليل الآفة كلها يقلل من التحيز في الاختيار والخطأ الذي سيحدث حتما عندما يتم اختيار أقسام منفصلة من سفينة لتحليلها. إنتاج لمحات الآفة الطولية هو مصدر قوة إضافية من الأراضي الفلسطينية المحتلة، أكد المقارنة من الآفات التي تسببها أنواع مختلفة من إصابة 13،16 (الشكل 5). على سبيل المثال، على حد سواء الربط الكامل والأسلاك الإدراج يسببها انسداد شبه كامل على مقربة من التشعب-femero المأبضية. إصابة الأسلاك، والآفات ولكن، أنتجت التي امتدت على طول القسم الممسوحة ضوئيا، في حين أن الآفات الناجمة عن عملية ربط الشرايين تتقلص بشكل سريع في حجم وتختفي. وينسجم هذا النمط مع أكبر قدر من الضرر الناجم عن إدخال سلك التوجيه الاوعية الدموية. توليد نتائج مماثلة باستخدام المقاطع النسيجية مكلفة ومستهلكة للوقت وكثيفة العمالة.
مزايا الأراضي الفلسطينية المحتلة وتشمل نوعية الصور التي تنتج والسرعة النسبية وبساطتها (لقد تم مسحها ضوئيا بشكل روتيني 20 سفينة يوميا). ويبدو أن نوعية صورة متفوقة، أو قابلة للمقارنة على الأقل، إلى أساليب أخرى لتوليد الصور 3 الابعاد خارج الجسم الحي (مثل التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي الصغرى)، صوآخرون الأراضي الفلسطينية المحتلة تتطلب مرات المسح أقصر (الوقت التكامل لدراستنا كانت 1-2sec عادة / الصورة) وأقل تكلفة. إعداد نموذج يمتد على مدى عدة أيام ولكن يتطلب العمل القليل، والأوعية يمكن أن تكون مستعدة على دفعات، والبيانات التي يمكن الحصول عليها في جلسة واحدة. ونتيجة لذلك، سرعة عالية ولا تتطلب التوسع في استخدام الماسح الضوئي. الأهم من ذلك أن طبيعة غير مدمرة للأرض الفلسطينية المحتلة يعني أنها يمكن أن تستخدم لتحديد المواقع ذات الأهمية للفحص المناعى. وبالتالي تقليل كمية من قطع وتلطيخ المطلوبة. فمن الممكن أن تطوير عالية الدقة الموجات فوق الصوتية ستوفر طريقة بديلة للالكمي الحجمي للآفات في الشرايين بهذا الحجم، ولكن الكتاب لا يدركون أي المنشورات التي تثبت هذا التطبيق.
ربما لا يثير الدهشة، جودة الصورة في الأراضي الفلسطينية المحتلة هي أدنى من التقنيات المجهرية (التي يمكن، بطبيعة الحال، إلا أن يؤديها على عينات أصغر). التحسينات المقترحة لreconstructioن من البيانات قد تعالج هذا القيد من خلال السماح للتحسن في المستقبل من جودة الصورة 19،20. القلق المنهجي آخر هو أن معالجة الأنسجة يغير خصائص العينة. على سبيل المثال عن طبيعة المادة وكيل المقاصة، البنزيل الكحول / بنزوات البنزيل (BABB)، ومن المرجح أن إزالة الدهون من آفات تصلب الشرايين، في حين الجفاف مسبق قد يسبب انكماش (على الرغم من وبطبيعة الحال، والجفاف وإزالة الدهون الخطوات هي أيضا سمة من سمات إعداد نموذج مبنية شمع البارافين). وقد استخدم BABB في هذا التحقيق كما، بالمقارنة مع وكلاء التخليص ماء (مثل الجلسرين 21) أنه يسبب تغييرات طفيفة فقط في التشكل.
هناك عدة احتمالات لمزيد من التطوير والتحسين في الأراضي الفلسطينية المحتلة، وخاصة فيما يتعلق تتبع الترتيب 3-الأبعاد من الخلايا الرئيسية ويشير العوامل التي تدخل في إعادة الشرايين. تألق ذاتي قوي من الأنسجة في الشرايين، والذي هو من هذا القبيلن ميزة في توليد الصور التشريحية، لا تطفأ بالطرق الحالية للتبييض 22 و قد تقيد استخدام تحقيقات الفلورسنت لتقييم RNA والبروتين أنماط التوزيع. استخدام المجسات اللونية (على سبيل المثال β غالاكتوزيداز) تصور بواسطة التصوير الإرسال قد تغلب على هذا القيد.
وفي الختام، الأراضي الفلسطينية المحتلة لديها امكانات كبيرة للتصوير 3 الأبعاد للآفات في البطانية الشرايين الفئران. أنها تمثل تقدما كبيرا على أساليب 2-الأبعاد التي عادة ما تكون كثيفة العمالة ولا تمثل على نحو فعال إجمالي حجم الآفة. الأراضي الفلسطينية المحتلة هو سريع نسبيا ومريحة وغير مدمرة. تطورات جديدة في تحليل الصور وعد لزيادة قوة وفائدة هذه التقنية.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل دراسية من جامعة ادنبره (NSK) وجامعة كارنيجي الثقة (LL؛ هنري مخطط Dryerre) وبتمويل من مؤسسة القلب البريطانية (PWFH، BRW، DJW؛ RG / 05/008؛ PG / 05/007. PG / 08/068/25461) ويلكوم ترست (JRS، BRW، DJW؛ 08314 / Z / 07 / Z). المؤلفون ممتنون لدعم لعملهم التي يقدمها المركز بتمويل فتقول لجائزة التميز البحثي لمركز القلب والأوعية الدموية العلوم.
المؤلفون ممتنون بشكل خاص للحصول على المشورة من أستاذ ماساتاكا ساتا (جامعة توكوشيما) والدكتور ايغور Chersehnev (في مجموعة الدكتور Ernane ريس 'في مدرسة جبل سيناء للطب) على إنشاء نماذج الجراحية الإنتاج neointimal الآفة. إنتاج الفيديو وإتاحتها ساتا وآخرون (http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) كان مفيدا للغاية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Microscope | Zeiss, Germany | OPMI Pico i | |
| Anesthetic Machine | Vet Tech, UK | ||
| Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
| Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
| Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
| Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
| Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
| Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
| Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
| Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, UK | 15000-01 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools, UK | 11251-35 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools, UK | 11370-31 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools, UK | 13008-12 | |
| Bulldog clips | Fine Science Tools, UK | 18050-35 | |
| Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | ||
| Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | ||
| Computer | Dell Inc, UK | ||
| Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
| DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
| NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
| CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
| Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapor, liquid |
| Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
| Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | 0.3 mg/ml | |
| 1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10 ml ampoule |
| EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | ||
| Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
| Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 250,000 Units |
| Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
| Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
| Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
| Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
| Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
| Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
| Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |
References
- Luis, A. J.
- Ross, R.
- Deuse, T. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J Vis Ex. (31), (2009).
- McAteer, M. A. Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).
- Martinez, H. G. Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice. Circulation. 120, 821-822 (2009).
- Langheinrich, A. C. Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens. Radiology. 231, 675-681 (2004).
- Ambrosi, C. M. Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography. J Biomed Opt. 14, 054002 (2009).
- Ku, G. Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution. J Biomed Opt. 15, 021302 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sharpe, J.
- Kirkby, N. S. Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography. PloS ONE. 6 (2), e16906 (2011).
- Roque, M. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).
- Sata, M. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).
- Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).
- Kirkby, N. S. Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury. Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).
- Kipari, T., et al. 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis. FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).
- Mackinnon, A. C. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Walls, J. R. Correction of artefacts in optical projection tomography. Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).
- Walls, J. R. Resolution improvement in emission optical projection tomography. Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).
- Bucher, D. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
