Generasjon og 3-dimensjonal Kvantifisering av arteriell lesjoner i Mus Bruke optisk projeksjon tomografi

Abstract

Generering og analyse av vaskulære lesjoner i egnede dyremodeller er en hjørnestein i forskning på hjerte- og karsykdommer, genererer viktig informasjon om patogenesen av lesjon formasjonen og virkningen av nye behandlingsformer. Bruk av aterosklerose utsatt mus, kirurgiske metoder for lesjon induksjon, og kosttilskudd modifikasjon har dramatisk forbedret forståelse av mekanismene som bidrar til sykdomsutvikling og potensialet for nye behandlinger.

Klassisk, er analyse av lesjoner utført ex vivo ved hjelp av to-dimensjonale histologiske teknikker. Denne artikkelen beskriver anvendelsen av optisk projeksjon tomografi (OPT) til 3-dimensjonal kvantifisering av arterielle lesjoner. Ettersom denne teknikk er ikke-destruktiv, kan den brukes som et supplement til standard histologiske og immunhistokjemiske analyser.

Neointimale lesjoner ble indusert av wire-innsetting eller ligering av musen femoral arteri mens aterosklerotiske lesjoner ble samlet ved administrering av en aterogen diett til apoE-manglende mus.

Lesjoner ble undersøkt ved hjelp av OPT avbildning av autofluorescent utslipp etterfulgt av komplementær histologisk og immunhistokjemisk analyse. OPT tydelig fremstående lesjoner fra den underliggende vaskulær vegg. Lesjon Størrelsen ble beregnet i to-dimensjonale seksjoner ved hjelp planimetri, muliggjør beregning av lesjon volum og maksimal tverrsnittsareal. Data som er generert ved hjelp av OPT var i samsvar med målinger oppnådd ved anvendelse av histologi, bekrefter riktigheten av teknikken og dens potensial som et komplement (i stedet for alternativ) til tradisjonelle metoder for analyse.

Dette arbeidet viser mulighetene for OPT for bildebehandling aterosklerotiske og neointimal lesjoner. Det gir en hurtig, mye nødvendig ex vivo teknikk for rutinen tre-dimensjonale kvantifisering av vaskulær remodellering.

Introduction

Dannelsen av arterielle lesjoner er sentralt i høy sykelighet og dødelighet forbundet med kardiovaskulær sykdom ^1. Lesjonsdannelse er ansett å være forårsaket av en ubundet inflammatoriske respons på arteriell skade ^2. Aterosklerotiske lesjoner dannes langsomt i respons til kronisk skade på arterieveggen, mens restenotic lesjoner utvikle seg raskt etter akutt mekanisk skade (for eksempel etter stent). Mekanismene som bidrar til utvikling av arterielle lesjoner er avklart betraktelig ved bruk av egnede dyremodeller, ofte i kombinasjon med relevante genetiske manipulasjoner ^en.

Analyse av lesjon størrelse og sammensetning har klassisk avhengig tungt på ex vivo, to-dimensjonal histologi (selv om dette endrer seg med utvikling av forbedrede fremgangsmåter for in vivo og ex vivo deteksjon og analyse av lesjoner i små dyr <sup> 3). Histologisk analyse av arterielle lesjoner er arbeidskrevende, tidkrevende og gir begrenset informasjon av tre-dimensjonal struktur. For eksempel er lesjon belastning vanligvis bestemt ved å måle tverrsnittsarealet av en lesjon (enten ved tilfeldig valgte steder, eller på stedet for maksimal okklusjon). Dette gir en ufullstendig analyse av den samlede belastning lesjon. Hel-montere 3-dimensjonal bildeteknologi gir en mulig løsning på dette problemet, men overraskende få egnede tilnærminger har blitt beskrevet. Dette kan skyldes hovedsakelig til størrelsen på mus arteriene som er for store for enkelt-foton konfokal mikroskopi, men for liten for magnetisk resonansavbildning (MRI) og ⁴ røntgenberegnet tomografi (CT), ^5. Bruk av ex vivo MR og micro CT til studiet av aterosklerotiske lesjoner hos mus antyder de tilbyr begrenset oppløsning, selv i relativt store arterier. Lagt til dette, de relativt lange innhentingstider krevesbegrense gjennomstrømming (og øke skanning kostnader) ^4,6.

Utvikling av nye optiske bildediagnostikk (som optisk koherens tomografi ^3,7 og foto-akustisk tomografi ⁸⁾ tilbyr mye potensial for forbedring avbildning av lesjoner i muse arterier. Tilsvarende potensial er vist ved optisk projeksjon tomografi (OPT) som ble utviklet for å tillate analyse av museembryoer. OPT er designet for å bilde eksemplarer spenner fra ~ 0,3 til 10 mm i diameter ^9. Transmisjons avbildning registrerer tettheten av et halvgjennomsiktig prøven polykromatisk synlig lys og kan anvendes for identifikasjon av anatomiske strukturer. Utslippsavbildnings poster emisjon av lys etter eksitasjon ved bestemte bølgelengder fra endogene (for eksempel kollagen, elastin) og eksogene fluoroforer i prøven. Dette kan også gi anatomisk informasjon (siden forskjellige vev komponentene kan variere i type og tetthet av autofluorescent artertilstede). Dessuten kan fordelingen av immunoreaktivitet eller genekspresjon bli bestemt ved bruk av egnede fluorescerende prober ^10. For enten bildemodus (overføring eller utslipp), blir lyset fokusert til en CCD å tillate iterativ bildeopptak som eksempel roterer (vanligvis 400 bilder på trinn 0,9 °). Disse kan brukes for beregning av volum ved standard tomografiske rekonstruksjonsmetoder (for eksempel filtrert tilbakeprojeksjon (ved hjelp av en kjegle algoritme) eller iterativ rekonstruksjon).

Denne videoen demonstrerer vår nye applikasjon for OPT for rask, kvantifiserbare og kostnadseffektiv 3-dimensjonal analyse av aterosklerotiske og neointimal lesjoner, som tidligere beskrevet i Kirkby et al. ^11. Teknikken ble vist seg å være egnet for kvantifisering av lesjon størrelse i tre brukte modeller: (i) femoralarterie wire-skade; (Ii) lårarterie ligering, og (iii) diett-indusert aterosklerose hos apolipoprotein E mangel (apoE ^{- / -)} mus.

Protocol

1. Kirurgisk Induksjon av neointimal lesjoner i Mouse lårarterie

1. Eksperimenter med dyr bør utføres i samsvar med nasjonale og institusjonelle etiske krav. All kirurgi bør utføres ved hjelp av egnet aseptisk teknikk. Induksjon av neointimale lesjoner er oppnådd ved hjelp av en modifikasjon av teknikken beskrevet av Roque et al. ¹² og SATA et al., ^13.
2. Vei mannlige C57BL6 / J mus (Alder 10-12 uker, vekt 25-30 g) så bedøver ved å levere 4-5% isofluran i en induksjonskammeret. Når anestesi er blitt indusert, overføre musen til en oppvarmet matte for å holde kroppstemperaturen på 37 ° C. Fortsett administrasjon av isofluran (2-3%) via en maske.
3. Når et passende nivå av anestesi har blitt indusert (manglende respons på tå klype), gi smertestillende dekning av administrasjon av buprenorfin (0,1 mg / kg ^-1). Deretter plasserer musen i liggende stilling end barbere ventral overflaten på venstre bakben.
4. Lag et snitt å avsløre musklene i øvre bakben og mellom bifurcation med popliteal arterien og bukveggen, bruker stump disseksjon å isolere femoral arterie og vene fra femoral nerve. Vanne såret etter behov ved anvendelse av 1% w / v lidokain.
5. Plasser proksimale (nær bukveggen) og distal (rett under den grenen med knehasecyste arterie) midlertidige ligaturer (6/0 Mersilk) rundt femoral arterie og vene til å styre blodstrømmen. Deretter isolere knehasecyste arterie (for ca 2-5 mm distalt for gren med lårarterie) og ligate distalt. Plasser et sekund, ubundne ligatur under knehasecyste arterien.
6. Lag et lite snitt (arteriotomi) i popliteal arterien, umiddelbart distalt for gren med lårarterie, hindre blødning ved å legge press på den proksimale midlertidig ligatur. Forhånds en rett, sprang 0,014 "ledetråden1-1,5 cm langs lårarterien i retning av bukveggen og la i stedet for 30 sekunder (figur 1A).
7. Fjern guidewiren og ligate popliteal arterien over arteriotomi, ved hjelp av ligatur plassert for dette formålet, og tar seg ikke å tilstoppe lårarterie.
   MERK: For ligation-indusert skade. Neointimale ombygging uten intraluminal skade kan induseres ved å ligere de femoral eller knehasen arterier (Figur 1B og 1C). For å oppnå dette, følg trinn 01.01 til 01.05. Men ikke gjør arteriotomi men (unngå trinn 1.6) enten (i) ligate popliteal arterien umiddelbart distalt for femoralarterie eller (ii) ligate felles lårarterie ved avdelingspunktet med knehasecyste arterien. Fortsett deretter med trinn 1.8.
8. Fjern midlertidige ligaturer, lukke såret med en usammenhengende ekstern sutur (5/0 Mersilk) og påfør EMLA krem ​​(2,5% lidokain, 2,5% prilokain). At dyrene for å re få bevissthet (vanligvis 5-10 min) og sikre at de beveger seg fritt rundt buret (svak halthet kan være tydelig i det berørte beinet, men dette bør løse i løpet av de første 2-3 dagene etter operasjonen) før du går tilbake til å holde rommene. Mus som ikke trenger å være plassert enkeltvis etter operasjonen.
9. At dyrene å komme i inntil tre måneder. Små lesjoner vil begynne å dukke opp ~ 7 dager etter ledningen skader og vil nå en stabil maksimal størrelse etter ~ 21-28 dager.

2. Induksjon av aterosklerotiske lesjoner i Apolipoprotein E ^{- / -} Mus

1. Administrere vestlig kosthold (0,2% kolesterol, Forsknings dietter, USA) for å male, 6 uker gamle ApoE-null mus (oppvokst i huset) i 12 uker.
2. Aterosklerotiske lesjoner er ofte synlig på brutto inspeksjon av aortabuen og dens store grener (figur 2).

3. Analyse Arteriell lesjoner ved hjelp av optisk projeksjon tomografi (OPT)

nt "> MERK: OPT bilder av lesjoner i muse lårarteriene og aorta bue prøver ble innhentet ved hjelp av en optisk projeksjon tomograph.

1. Avlive mus ved transcardiac perfusjon fiksering og blodtapping henhold terminal anestesi (80 mg / kg natriumpentobarbital), ved bruk av heparinisert (10 U / ml) fosfatbufret saltvann (PBS) fulgt av 10% nøytral bufret formalin.
2. Isolere lårarteriene eller aortabuen og dens store grener (venstre halspulsåre, venstre arteria subclavia, brachiocephalic trunk), som hensiktsmessig, og fjerne overflødig peri-adventitia materiale. Post-fix i 10% bufret formalin O / N, før lagring i 70% etanol inntil nødvendig.
3. Embed arterier i 1,5% lavt smeltepunkt agarose, pre-filtrert gjennom Whatman 113 V papir. Fest hver prøve til en magnetisk OPT montere med cyanoacrylate lim med fartøyet akse i takt med at av fjellet. Trim overflødig agarose til en konisk form. Dehydrere i 100% metanol i minst 12 timer.
4. CLear fartøy ved nedsenking (etter 12-24 timer) i en blanding av benzylalkohol og benzylbenzoat (1: 2 v / v).
5. Plasser ryddet prøver i en kalibrert tomograph. Satt oppløsningen til 1024 x 1024, og bestemme en optisk forstørrelse som gjør at hele området av interesse å bli sett. OPT volum er isotropt z-aksen er rekonstruert til den samme oppløsning (dvs. 1,024 x 1,024 x 1,024), voxel størrelse ~ 200 mikrometer. Dette kan representere en over-estimat av oppløsning som det er sannsynlig å være rekonstruksjon gjenstander. Juster prøveposisjon, slik at den roterer på sin egen akse i sentrum av synsfeltet i den lyse felt, overføringskanal.
6. I GFP1 filteret utslippskanal (eksitasjon 425 nm filter med 40 nm båndpass; utslipp filter: 475 nm langt frem), konsentrere prøven og justere eksponeringen tid til å maksimere det dynamiske området til det resulterende bildet (unngå overmetning). Skann fartøyet i GFP1 utslipp kanal bare, med en 0,9 ° rotasjon trinn. </ Li>
7. Ved ferdigstillelse, bekrefte kvaliteten på datainnsamling ved hjelp DataViewer programvare. Fjern prøven fra skanneren.
8. Å tillate påfølgende histologisk analyse, sted prøven i 100% metanol i> 24 timer før behandling til parafin voks som normalt.

4. Bilde Rekonstruksjon og analyse

Tomographic re-konstruksjon av filtrert back-projeksjon er utført ved hjelp NRecon programvare eller lignende. Rekonstruksjoner kan utføres uten tilsyn, i grupper.

1. Forbedre bildekvaliteten ved å kompensere for feiljustering og justering bildeintensitetsnivåer.
2. Sjekk kvaliteten på bildet rekonstruksjon med DataViewer programvare.
3. Identifisere den aktuelle delen av prøven for analyse. Hold denne lengden konsekvent mellom fartøy hvis luminale dimensjoner er å bli registrert.
4. Definere omrisset av lesjonene ved manuelt å spore den aktuelle grensen for 1 i hver 50 re-konstruert tverrsnitt.
5. Sjekk hver innfelt tverrsnitt for å sikre datagenerert interpolations er riktige. Justere manuelt grensen der det er nødvendig.
6. Sett grå-nivået terskel, slik at bare lesjonen er valgt og eksportere måledata.
7. For hver avsøkning, definerer et vertikalt område av interesse som inneholder lesjonen og spor grensen mellom media og neointima (ie., Posisjonen til den interne elastiske lamina) for hver ^{50-scan-linje.} Interpolere intima / medie grenser for de innfelte skanningslinjer i programvare, og verifisere og korrigere passform der det er nødvendig. Videre segment av dette definerte tredimensjonale volumet til en manuelt definert intensitet terskel for å frembringe et binært bilde sett i hvilket hvite piksler representere neointima og svarte piksler representere patent lumen.
8. Målinger tatt inkluderer: samlet volum lesjon (objekt volum), luminal volum (totalt volum - objekt volum) og fordelingen av lesjonen og lumen kryss sektional område langs den aksiale lengden av den undersøkte beholderen.

Representative Results

Foreløpige scanning av sunne (unlesioned) murine lårarteriene (n = 5) viste at overføringen avbildning ikke gir nyttige bilder. Dette var en følge av de tømte arteriene blir for gjennomsiktig (i stedet for ugjennomsiktig) for overføring imaging.However, er dette fordelaktig for utslipp avbildning som det er ingen absorbans / spredning av det utsendte signalet. I motsetning til dette, lårarteriene autofluoresce sterkt i utslippskanalen, med størst signal etter eksitasjon ved 405-445 nm (i samsvar med et 410 nm eksitasjon topp for elastin ^14). 2-dimensjonale skiver rekonstruert fra disse bildene tydelig preget medie fra lumen og adventitia og lumen.

I murine lårarteriene høstet 28 dager etter at wire-(n = 6) eller ligation- (n = 5) indusert skade neointimal fortykning var tydelig i ikke-tomografiske utslippsspring (figur 3A). I rekonstruert 2-Dimensional skiver, konsentriske neointimale lesjoner kan skilles fra media ved deres svakere utslipp (figur 3B og figur S1).

OPT utslipps bilder av hele montere prøver av aortabuen og dens store grener fra aterosklerotiske mus (n = 8) identifiserte lesjoner med den forventede anatomiske distribusjon (ie., I det minste krumningen av aortabuen, den brachiocephalic arterien, og opprinnelsen av venstre carotis og venstre subclavia arterier (Figur 4A). Cross-sectional bilder indikerte at disse var typisk eksentriske lesjoner og var lett skilles fra media og lumen (figur 4B, figurene S2 og S3).

Foredling av arterier for histologisk analyse etter OPT bekreftet den ikke-destruktive natur OPT, med seksjoner hell farget hjelp histologisk (United States Trichrome, Picrosirius rød) og immunhistokjemisk (α-SMA, Mac-2) teknikker (Tall 3C og 4C).

Måling av lesjon størrelse ved hjelp OPT har vist seg å være konsistent med målingene som oppnås ved hjelp av bildeanalyse av histologiske snitt tatt fra samme arterie ^11.

Planimetric målinger av lesjonsområdet oppnådd ved OPT og histologi korrelert tett ved lineær regresjon for ^wire-(R2 = 0,92) og ligation-indusert ^(R2 = 0,89) neointimale lesjoner og aterosklerotisk plakk ^(R2 = 0,85). En viktig fordel med OPT er dens evne til å aktivere tre-dimensjonal analyse. Ved å utvikle volumetrisk kvantifisering av lesjoner med denne teknikken, var vi i stand til å ta opp lesjon volumer i wire-(0,1100 ± 0,0091 mm ^3; n = 6) og ligation skadet lårarteriene (0,0200 ± 0,0089 mm ^3; n = 5), og også i aterosklerotiske brachiocephalic arterier (0.180 ± 0,018 mm ^3; n = 8). Målinger ble svært reproduserbare (variasjonskoeffisient 5,4%, 11,4% og 4,8%, henholdsvis n = 4) for alle typer av lesjon. Neointimale lesjoner i tråd skadet fartøy var større (p <0,0001) enn de som fremstilles ved ligering, i samsvar med den større grad av skade påført av den tidligere.

Dataene som genereres kan også uttrykkes som lesjon profiler (figur 5) og gjengis for dynamisk, kvalitativ evaluering (se figurene S1 - S3). Denne fremgangsmåten viste tydelig graden av lesjon formasjonen som respons på forskjellige skade prosedyrer og fremhevet den ujevne fordelingen av lesjonsdannelse i skadet skip.

Figur 1: Fremgangsmåter for initiering lesjonsdannelse i murine lårarterien & #.160, (A) Retrograd innsetting av et angioplastisk styretråden inn i den femorale arterien ved hjelp av en arteriotomi i popliteal arterien stimulerer lesjonsdannelse i respons til å strekke skade og fjerning av endotelet. Blodstrømmen er re-etablert over den skadde delen av fartøyet. (B) neointimal proliferasjon i fravær av intraluminal strekk, denudasjon eller avbrytelse av blodstrømmen kan bli indusert ved å ligere enten femoral eller popliteal arterien umiddelbart distalt til arteria femoralis bifurkasjonen. (C) En mer alvorlig ikke-denuding skade / spredning respons kan bli indusert ved å ligere både femoral og knehasen arterier over grenen poenget med felles lårarteriens. Denne teknikken vil også blokkere blodstrømmen i den distale delen av lårarterien.

Fig. 2: Karakteristisk avsetning av atheroma i mus aortabuen Atherosclerosis tilbøyelig (Apolipopotein E mangelfull mus) foret med en høy kolesterol vestlig diett i 12 uker utvikler et karakteristisk mønster av lesjon deponering i aortabuen og dens store grener. Som vist, er synlige lesjoner (piler), grov inspeksjon under et disseksjonsmikroskop, i aortabuen, den brachiocephalic arterien, og i Ostia i venstre halspulsåren og venstre subclavia.

Figur 3:. Lesjonsdannelse etter ligering av venstre femoralarterie (A) Non-tomografiske fluorescens utslipps bilder (inverterte å øke klarhet - mørke regioner tilsvarer sterkere utslipp) tillate identifisering av intimalfortykning (rød arrowheannonser). (B) Klare vaskulære regioner og lumen kan skilles i tomografiske rekonstruksjoner. (C) Histologisk analyse (United States Trichrome) understreker det klare likhetstrekk med bildene innhentet ved hjelp av OPT. Skala barer i (AC) er 200 mm. Tilpasset fra Kirkby et al. ¹¹ Scale barer i (AC) er 200 mikrometer.

Figur 4:. Imaging of atheroma i aortabuen av aterosklerose utsatt mus (A) aterom (rød pilspisser) er lett synlig i ikke-tomografiske bilder (invertert slik at mørkere områdene indikerer sterkere utslipp, og dermed forbedre klarhet) av aortabuen, i områder som predikert aterom bærende ved inspeksjon under lett mikroskopi (se figur 2). (B) Dette mønsteret av fordelingen er bekreftet i tomographic crOss-seksjoner. (C) Histologisk (United States Trichrome) farging viser nær likhet med tomografiske seksjoner, og immunhistokjemi ved hjelp av flere forskjellige antistoffer streker komplementære OPT med tradisjonelle tilnærminger til lesjon analyse. Skala barer i (A-B) er en mm; Scale bar i (C) er 250 mikrometer. RSA, rett subclavia; RCA, rett carotisar; LCA, venstre halspulsåren; LSA, venstre subclavia; BCA, brachiocephalic arterie; AAo stigende aorta; Dão, synkende aorta. Tilpasset fra Kirkby et al. ¹¹

Figur 5: Analyse av lesjon og lumen profiler indikerer varierende grad av neointimal spredning i respons til ulike metoder for arteriell skade optisk projeksjon tomografi lar lesjon og lumen tverrsnitt measuremen.ts å bli plottet mot avstand langs lårarterie. Dette viser klart at, sammenlignet med en uskadd arterie (A), delvis ligering (B) produserer små, relativt diskrete lesjoner, mens total ligering (C) produserer komplett okklusjon på stedet av ligation men lesjonen strekker seg ikke langt langs arterien . Intraluminal trådskade (D) frembringer en lesjon som nesten helt tetter den distale delen av prøven og strekker seg langs hele lengden av den skannede delen av arterien. Tilpasset fra Kirkby et al. ¹¹

Figur S1. Animated rekonstruksjon av tverrsnitt bilder hentet fra en mus lårarterie følgende ligation skade. Er nyttig for både kvalitativ og kvantitativ analyse Denne type animert bilde. Som animasjon beveger seg fra den proksimale til de distale deler av arterien en gradvis utvikling av en okklusiv neointima, skiveernible fra lumen og media, er åpenbart. Sidegreiner kan lett identifiseres, og det er tydelig luminal okklusjon og utover ombygging av arterien som lesjonen øker i størrelse. Fullstendig lukking av beholderen finner sted på eiendommen til ligerings er nådd. Tilpasset fra Kirkby et al. ¹¹

.. Figur S2 Animated rekonstruksjon av tverrsnitt bilder av en aortabuen fra en atherosclerosis utsatt mus Animasjonen starter med tverrsnitt av den stigende (venstre - som kommer først) og synkende (høyre) aorta. Små lesjoner vises i den oppstigende aorta for eksempel skanne beveger seg i retning av aortabuen. Bildene deretter gå gjennom buen for å vise tungt lesioned ostia av brachiocephalic (til venstre), venstre carotis (midten) og venstre subclavia (høyre) arterier. Som skanningen beveger seg distalt sammen disse grenene lesjonene gradvis redusere og forsvinne, først i subclavian arterie, deretter i arteria carotis og til slutt i brachiocephalic arterien. Interessant, lesjon i brachiocephalic blod beveger seg inn på strømningsdeler som dette fartøyet deler inn i høyre carotis og høyre subclavia arterier. Tilpasset fra Kirkby et al. ¹¹

Figur S3. Animert, volumgjengitte bildet av en aortabuen fra en aterosklerose utsatt mus. Optisk projeksjon tomography tillater generering av tre-dimensjonale bilder, i dette tilfellet viser fordelingen lesjon i aortabuen av et apolipoprotein E mangelfull mus. (A) atheroma er til stede i de forventede områder (hele brachiocephalic arterien, i ostia av venstre carotis og subclavia arterier og i den mindre krumning av aortabuen). (B) Segmentering og gjengivelse av lesjon (vist i rødt) som bærer tverrsnitt streker utdeling av plaketter når oppå originalbildet.Tilpasset fra Kirkby et al. ¹¹

Discussion

3-dimensjonal analyse har et stort potensial for å erstatte eller legge til de to-dimensjonale histologiske teknikker som fortsatt ligger til grunn for de fleste undersøkelser av arteriell lesjon formasjonen. Her OPT er vist i små muse arterier (med murine lårarteriene trolig representerer de minste fartøyene som kan analyseres med hell bruke denne teknikken). Det er imidlertid også egnet for bruk med arterier (og lesjoner) fra andre arter, blant annet små til mellomstore menneskelige fartøyer; vår gruppe har med hell brukt teknikken til å analysere lesjoner i kaninaorta (Bezuidenhout et al;. upublisert). OPT løfter hurtigere analyse og øket strukturell informasjon sammenlignet med tradisjonell histologi, og har fordelen av ikke å hindre påfølgende analyse av prøven ved bruk av både histologiske og immunohistokjemiske teknikker.

Bildene produseres ved OPT ga anatomiske detaljer, som viser områder av lesjonsdannelseog størrelsen av lesjoner i disse områdene. Arteriene ble brukt i disse undersøkelser er sannsynligvis nær grensen for oppløsning for teknikken og bildekvalitet er derfor nedsatt til en viss grad av gjenstander (antagelig som følge av rotasjon forskyvning ufullstendig avregning, refleksjon / brytning ved agarose-punktene og fokuseringsproblemer) . Til tross for dette er de detaljer som kreves (dvs. lag av karveggen) forblir merkbar og dermed teknikken er svært nyttig for kvantifisering av enkelte lag. Faktisk kan bildene kvantifiseres hurtig og reproduserbart å tilveiebringe målinger av lesjon og luminal volum i plaque-bærende deler av fartøyet, samt tverrsnittsarealer av lesjonen og lumen på utvalgte steder i prøven. Large (aorta) og mellomstore (femoral, carotis, subclavian) murine arterier - de som vanligvis brukes for analyse av aterosklerotisk og neotintimal lesjon formasjonen i mus - var vellykketanalysert ved hjelp av denne metoden. Faktisk har vi nå brukt OPT å demonstrere effekten av farmakologiske intervensjoner og genetisk manipulasjon på aterosklerotisk og neointimal lesjon størrelse. For eksempel endotelinreseptor blokade endret neointimal lesjonsdannelse mens selektiv sletting av endotelin B-reseptoren fra vaskulærendotelet gjorde ikke ^15. I aterosklerose utsatt mus ble genetisk delesjon av enzymene 11β-HSD1 ¹⁶ eller galectin 3 ¹⁷ vist å redusere størrelsen av aterosklerotiske lesjoner.

Kvantifisering av lesjon volum er en åpenbar fordel med OPT. Det gir en mer informativ indikasjon av den totale lesjon belastning i en arterie ⁴ enn det som vanligvis oppnås med histologiske metoder. Analysere hele lesjonen reduserer utvalgsskjevhet og feiling som nødvendigvis vil oppstå når diskrete deler av et fartøy er valgt for analyse. Produksjon av langsgående profiler lesjoner er et ytterligere styrke av OPT, Understreket ved sammenligning av lesjoner indusert av forskjellige typer skader ^13,16 (figur 5). For eksempel, både komplett ligation og wire-innsetting indusert nesten total okklusjon nær femero-knehasecyste deli. Wire skade, men gav lesjoner som strakte seg langs hele lengden av det skannede seksjonen, mens lesjoner indusert av arteriell ligering hurtig redusert i størrelse og forsvinne. Dette mønsteret er i overensstemmelse med den større grad av skade forårsaket av tilførsel av det angioplastiske tråden. Generering av lignende resultater ved hjelp av histologiske snitt er kostbart, tidkrevende og arbeidskrevende.

Fordelene med OPT omfatter kvaliteten på bildene det produserer og dens relative hastighet og enkelhet (vi har rutinemessig skannet 20 fartøy per dag). Bildekvalitet vises overlegen eller i det minste sammenlignbare, med andre metoder for å generere tre-dimensjonale bilder ex vivo (for eksempel MRI og mikro- CT), yet OPT krever kortere skanne ganger (integrasjonstiden for våre studier var typisk 1-2sec / bilde) og er rimeligere. Prøveopparbeidelse strekker seg over flere dager, men krever litt arbeid, kan fartøy være forberedt i grupper, og data kan bli kjøpt i én økt. Derfor er gjennomstrømningen høy og krever ikke utvidet bruk av skanneren. Viktigere, betyr det ikke-destruktive natur OPT den kan brukes til å identifisere områder av interesse for immunhistokjemisk undersøkelse; og dermed redusere mengden av skjæring og flekker nødvendig. Det er mulig at utviklingen av høyoppløselig ultralyd vil gi en alternativ metode for volumetrisk kvantifisering av lesjoner i arteriene denne størrelsen, men forfatterne er klar over eventuelle publikasjoner som viser dette programmet.

Kanskje overraskende, er bildekvaliteten i OPT dårligere enn mikroskopiske teknikker (som kan selvfølgelig bare utføres på mindre prøver). Forslag til forbedringer til reconstruction av data kan møte denne begrensningen ved å tillate fremtidige forbedring av bildekvalitet ^19,20. En annen metode bekymring er at vev behandling endrer egenskapene til prøven. For eksempel den lipofile natur clearing agent, er sannsynlig å fjerne lipid fra aterosklerotiske lesjoner, mens før dehydrering kan forårsake krymping (men, selvfølgelig, dehydrering og lipid fjerning trinnene er også en funksjon av benzylalkohol / benzylbenzoat (Babb), prøveopparbeidelse for innebygging i parafinvoks). Babb ble brukt i denne undersøkelsen som i sammenligning med hydrofile clearingmidler (f.eks glyserol ²¹⁾ det fører bare små endringer i morfologi.

Det er flere muligheter for videreutvikling og foredling av OPT, særlig med hensyn til sporing av 3-dimensjonal arrangement av nøkkelceller og signal faktorer involvert i arteriell ombygging. Den sterke autofluorescence arteriell vev, som er en slikN fordel i generering av anatomiske bilder, ikke stoppes ved de eksisterende fremgangsmåter for bleking ²² og kan begrense bruken av fluorescerende prober for å vurdere RNA og proteinfordelingsmønster. Bruken av kolorimetriske prober (f.eks β-galaktosidase) synliggjort ved overføring avbildning kan overvinne denne begrensning.

For å konkludere, OPT har stort potensial for tre-dimensjonal avbildning av lesjoner i intima av murine arterier. Det representerer en betydelig forskudd på to-dimensjonale metoder som er generelt arbeidskrevende og ikke effektivt representerer total lesjon volum. OPT er relativt rask, enkel og ikke-destruktiv. Nye utbygginger i bildeanalyse lover å øke kraften og nytten av teknikk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating Microscope	Zeiss, Germany		OPMI Pico i
Anesthetic Machine	Vet Tech, UK
Fluovac	Harvard Apparatus UK	340387
Fluosorber	Harvard Apparatus UK	340415
Bead Sterilizer	Fine Science Tools, UK	1800-45
Heated Mat	Fine Sceince Tools, UK	21061-10
Balance	Mettler Toledo	MS1602S	PB1502 or equivalent
Sutures	Ethicon, UK		5/0 Mersilk
Guidewire	Cook Inc, USA	C-PMS-251	0.014”
Suture Silk	Fine Science Tools, UK	18020-60	6/0 Mersilk
Surgical Tools	Fine Science Tools, UK	14058-09	Toughcut Iris scissors
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, UK	15000-01
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools, UK	11251-35
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools, UK	11370-31
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools, UK	13008-12
Bulldog clips	Fine Science Tools, UK	18050-35
Bioptonics 3001 Tomograph	Bioptonics, UK
Magnetic OPT Mount	Bioptonics, UK
Computer	Dell Inc, UK
Peristaltic pump	Gilson	F117606	Minipuls 3
DataViewer software	Skyscan, Belgium	v.1.4.4
NRecon software	Skyscan, Belgium	v.1.6.8
CTan software	Skyscan, Belgium	v.1.12
Isoflurane	Merial Animal Health Ltd, UK	AP/Drugs/220/96	100% Inhalation vapor, liquid
Medical Oxygen	BOC Medical, UK	UN1072
Vetergesic	Alstoe Animal Health Ltd, UK		0.3 mg/ml
1% Lignocaine	Hamlen Pharmaceuticals, UK	LD1010	10 ml ampoule
EMLA Cream	Astra Zeneca, UK
Sodium Pentobarbital	Ceva Animal Health Ltd, UK
Western Diet	Research Diets, USA	D12079B	0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline	Sigma UK	P4417
Heparin (Mucous)	Leo Laboratories, UK	PL0043/003GR	250,000 Units
Neutral Buffered Formalin	Sigma, UK	HT501128	10%
Ethanol	VWR BDH Prolabo, UK	20821.33	Absolute AnalaR
Agarose	Invitrogen, UK	16020050	Low melting point
Filter Paper	GE Healthcare, UK	113v	Whatman
Cyanoacrylate adhesive	Henkel, UK	4304	Loctite
Benzyl alcohol	Sigma, UK	B6630
Benzyl benzoate	Sigma, UK	402834
Methanol	VWR BDH Prolabo, UK	20856.296	100%