Generation och 3-dimensionell kvantifiering av arteriell Skador i möss med användning av optisk Projection Tomography

Abstract

Genereringen och analys av kärlskador i lämpliga djurmodeller är en hörnsten i forskning kring hjärt- och kärlsjukdomar, vilket genererar viktig information om patogenesen av lesionsbildning och effekten av nya terapier. Användning av ateroskleros benägna möss, kirurgiska metoder för skada induktion, och dietary modifiering har dramatiskt förbättrat förståelse för de mekanismer som bidrar till sjukdomsutveckling och potentialen för nya behandlingar.

Klassiskt, är analys av lesioner utförs ex vivo med användning av 2-dimensionella histologiska tekniker. I denna artikel beskrivs tillämpningen av optisk projektionstomografi (OPT) till 3-dimensionell kvantifiering av arteriella lesioner. Eftersom denna teknik är icke-förstörande, kan den användas som ett komplement till vanliga histologiska och immunhistokemiska analyser.

Neointimala lesioner induceras av tråd insättning eller ligering av musen lårbens konstEry medan aterosklerotiska skador alstrades genom administrering av en aterogen diet till apoE-brist möss.

Skador undersöktes med hjälp av OPT avbildning av autofluorescent utsläpp följt av kompletterande histologiska och immunhistokemiska analyser. OPT tydligt framstående skador från den underliggande kärlväggen. Lesionsstorleken beräknades i 2-dimensionella bildytor med planimetri, vilket möjliggör beräkning av lesionen volym och maximal tvärsnittsarea. Data som genereras med hjälp av OPT överensstämde med mätningar som erhållits med hjälp av histologi, bekräftar riktigheten av tekniken och dess potential som ett komplement (snarare än alternativ) till traditionella metoder för analys.

Detta arbete visar potentialen för OPT för avbildning aterosklerotiska och neointimala skador. Det ger en snabb, mycket behövs ex vivo teknik för rutinen 3-dimensionell kvantifiering av vaskulär remodellering.

Introduction

Bildandet av arteriella skador är av central betydelse för den höga sjuklighet och dödlighet i samband med hjärt-kärlsjukdom ^1. Lesionsbildning anses vara orsakad av en ohämmad inflammatorisk reaktion på arteriell skada ^2. Aterosklerotiska lesioner bildar långsamt som svar på kronisk skada på artärväggen, medan restenosvävnad lesioner utvecklas snabbt efter akut mekaniska skador (till exempel efter stentimplantation). De mekanismer som bidrar till utvecklingen av arteriella lesioner har förtydligats avsevärt genom användning av lämpliga djurmodeller, ofta i kombination med relevanta genetiska manipulationer ^1.

Analys av skada storlek och sammansättning har klassiskt berodde mycket på ex vivo, 2-dimensionell histologi (även om detta håller på att förändras med utvecklingen av förbättrade metoder för in vivo och ex vivo detektion och analys av lesioner i smådjur <sup> 3). Histologisk analys av arteriella lesioner är arbetsintensiv, tidskrävande och ger begränsad information av 3-dimensionella struktur. Till exempel är lesionen bördan vanligen bedömas genom mätning av tvärsnittsarean av en lesion (antingen på slumpvis valda ställen eller vid stället för maximal ocklusion). Detta ger en ofullständig analys av totala bördan skada. Hela-mount 3-dimensionell bildteknik ger en möjlig lösning på detta problem, men förvånansvärt få lämpliga tillvägagångssätt har beskrivits. Detta kan bero huvudsakligen på storleken av mus artärer som är för stora för single-photon konfokalmikroskopi men för liten för magnetisk resonanstomografi (MRT) ⁴ och röntgen datortomografi (CT) ^5. Tillämpning av ex vivo MRI och mikro CT till studiet av aterosklerotiska lesioner hos möss antyder de erbjuder begränsad upplösning, även i relativt stora artärer. Till detta kommer de relativt långa hämtningstider krävsbegränsa genomströmning (och öka skanningskostnader) ^4,6.

Utveckling av nya optiska avbildningsmetoder (såsom optisk koherens tomografi ^3,7 och foto akustisk tomografi ⁸⁾ erbjuder stor potential för att förbättra avbildning av lesioner i murina artärer. Liknande potential framgår av optisk projektion tomografi (OPT) som togs fram för att möjliggöra analys av musembryon. OPT designades för att avbilda prover som spänner från ~ 0,3-10 mm i diameter ^9. Transmission avbildning registrerar opaciteten för en halvgenomskinlig prov till polykromatiskt synligt ljus och kan användas för identifiering av anatomiska strukturer. Emissionsavbildnings register emission av ljus efter excitation vid specifika våglängder från endogena (t.ex. kollagen, elastin) och exogena fluoroforer i provet. Detta kan också ge anatomisk information (eftersom olika vävnadskomponenter kan skilja sig i typen och densiteten av autofluorescerande arternärvarande). Dessutom kan fördelningen av immunoreaktivitet eller genuttryck bestämmas med användning av lämpliga fluorescerande prober ^10. För båda bildläget (överföring eller emission), är ljus fokuseras till en charge-coupled device för att möjliggöra iterativ bildfångst som provtagnings roterar (vanligtvis 400 bilder i steg om 0,9 °). Dessa kan användas för beräkning av volym av standard tomografiska rekonstruktionsmetoder (såsom filtrerad back-projektion (med hjälp av en kon algoritm) eller iterativ rekonstruktion).

Denna video visar vår nya tillämpning av OPT för snabb, mätbar och kostnadseffektiv 3-dimensionell analys av aterosklerotiska och neointimala skador, såsom tidigare beskrivits i Kirkby et al. ^11. Tekniken visades vara lämplig för att kvantifiera lesionsstorlek i tre vanligen använda modeller: (i) femoralis trådskador; (Ii) lårbensartären ligering, och (iii) dietinducerad ateroskleros i apolipoprotein E bristfällig (apoE ^{- / -)} möss.

Protocol

1. Kirurgisk Induktion av neointimal Skador i mus lårbensartären

1. Experiment med djur bör utföras i enlighet med nationella och institutionella etiska krav. Alla operationer ska utföras med lämplig aseptisk teknik. Induktion av neointimala lesioner åstadkommes med användning av en modifiering av den teknik som beskrivits av et al. Roque ¹² och Sata et al., ^13.
2. Väg hane C57BL6 / J-möss (Ålder 10-12 veckor, vikt 25-30 g) söva sedan genom att leverera 4-5% isofluran i en induktionskammare. När anestesi har inducerats, överföra musen till en uppvärmd matta att upprätthålla kroppstemperaturen vid 37 ° C. Fortsätt administrering av isofluran (2-3%) via en mask.
3. När en lämplig nivå av anestesi har inducerats (bristande respons på tå nypa), ge smärtstillande omslag genom administrering av buprenorfin (0,1 mg / kg ^-1). Placera sedan musen i ryggläge end raka den ventrala ytan av den vänstra bakben.
4. Göra ett snitt för att exponera musklerna i den övre bakbenen och, mellan bifurkationen med popliteal artär och bukväggen, använd trubbig dissektion för att isolera den femorala artären och venen från den femorala nerven. Skölj såret efter behov med användning av 1% vikt / volym lignokain.
5. Placera proximal (nära bukväggen) och distala (omedelbart under gren med Poplietallymfknutor artär) tillfälliga ligaturer (6/0 Mersilk) runt lårbensartären och venen för att kontrollera blodflödet. Sedan isolera Poplietallymfknutor artär (cirka 2-5 mm distalt till grenen med lårbensartären) och ligera distalt. Placera en sekund, obundet ligatur under Poplietallymfknutor artär.
6. Gör ett litet snitt (arteriotomi) i Poplietallymfknutor artär, omedelbart distalt till grenen med lårbensartären, förhindra blödning genom att sätta press på den proximala tillfälliga ligatur. Advance en rak, sprungit 0,014 "ledaren1-1,5 cm längs femoralartären i riktningen av bukväggen och lämnar i stället för 30 sek (Figur 1A).
7. Ta ledaren och ligera Poplietallymfknutor artär ovanför arteriotomy, med hjälp av ligatur placeras för detta ändamål, och noga med att inte täppa till lårbensartären.
   OBS: För ligering-inducerad skada. Neointimal ombyggnad utan intraluminal skada kan induceras genom att ligera lårbens- eller popliteala artärer (fig 1B och 1C). För att uppnå detta följa steg 1,1-1,5. Men gör inte arteriotomin men (för att undvika steg 1,6) antingen (i) ligera Poplietallymfknutor artär omedelbart distalt lårbensartären eller (ii) ligera den gemensamma lårbensartären vid förgreningspunkten med Poplietallymfknutor artär. Fortsätt sedan med steg 1.8.
8. Ta bort tillfälliga ligaturer, stänga såret med diskontinuerligt extern sutur (5/0 Mersilk) och tillämpa EMLA kräm (2,5% lidokain, 2,5% prilokain). Tillåta djuren att åter få medvetande (vanligtvis 5-10 min) och se till att de rör sig fritt runt sin bur (lätt hälta kan vara tydlig i det drabbade benet men detta bör lösa under de första 2-3 dagarna efter operation) innan han återvände till att hålla rum. Möss behöver inte hållas individuellt efter operationen.
9. Tillåta djuren att återhämta sig i upp till tre månader. Små skador kommer att börja visas ~ 7 dagar efter tråd skada och kommer att nå en stabil maximal storlek efter ~ 21-28 dagar.

2. Induktion av aterosklerotiska skador i apolipoprotein E ^{- / -} möss

1. Administrera västerländsk diet (0,2% kolesterol, Forskning dieter, USA) manliga, 6 veckor gamla ApoE-null möss (uppvuxna i huset) under 12 veckor.
2. Aterosklerotiska lesioner är ofta synliga på brutto inspektion av aortabågen och dess större grenar (Figur 2).

3. Analysera Arteriell lesioner med hjälp av optisk Projection Tomography (OPT)

nt "> OBS: OPT bilder av skadorna i murina lårbensartärer och aortabågen prover erhölls med hjälp av en optisk projektions tomograf.

1. Euthanize möss genom transkardial perfusion fixering och blodtappning under terminal anestesi (80 mg / kg natriumpentobarbital), med användning av hepariniserad (10 E / ml) fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 10% neutral buffrad formalin.
2. Isolera lårbensartärer eller aortabågen och dess huvudgrenar (vänster halspulsådern, vänster subclavia, brachiocephalic stam), i förekommande fall, och ta bort ovidkommande peri-adventitial material. Post-fix i 10% buffrad formalin O / N, före lagring i 70% etanol tills det behövs.
3. Bädda artärerna i 1,5% lågsmältande agaros, för-filtrerades genom Whatman 113 V papper. Fäst varje prov till en magnetisk OPT Fäste med cyanoakrylatlim med kärlaxeln i linje med fästet. Trimma överskott agaros till en konisk form. Torka i 100% metanol under minst 12 timmar.
4. Clear kärl genom nedsänkning (till 12-24 h) i en blandning av bensylalkohol och bensylbensoat (1: 2 vol / vol).
5. Placera rensas prov i en kalibrerad tomograf. Ställ resolution till 1,024 x 1,024, och bestämma en optisk förstoring som gör hela området av intresse att se. OPT volym är isotropisk z-axeln rekonstrueras till samma upplösning (dvs., 1024 x 1024 x 1024), voxelstorlek ~ 200 | j, m. Detta kan innebära en överskattning av upplösning, eftersom det sannolikt är återuppbyggnads artefakter. Justera provposition så att den roterar på sin egen axel i centrum av synfältet i det ljusfält, överföringskanal.
6. I utsläppskanalen GFP1 filter (excitationsfilter 425 nm med 40 nm bandpass, emissionsfilter: 475 nm lång passning), fokusera provet och justera exponeringstiden för att maximera det dynamiska omfånget av den resulterande bilden (undvika övermättnad). Skanna fartyget i GFP1 utsläpps enda kanalen, med en 0,9 ° rotationssteg. </ Li>
7. Vid slutförandet, bekräftar kvaliteten på datainsamling med hjälp av Dataviewer mjukvara. Ta prov från skannern.
8. För att tillåta efterföljande histologisk analys, plats prov i 100% metanol under> 24 h före behandling för att paraffinvax som vanligt.

4. Bild återuppbyggnad och analys

Tomografiska ombyggnad av filtrerad back-projektion utförs med hjälp NRecon programvara eller liknande. Rekonstruktioner kan utföras utan uppsikt, i omgångar.

1. Förbättra bildkvaliteten genom att kompensera för snedställning och justera bildintensitetsnivåer.
2. Kontrollera kvaliteten på bildrekonstruktion med hjälp av Dataviewer mjukvara.
3. Identifiera lämpligt avsnitt av provet för analys. Håll denna längd konsekvent mellan fartyg om luminala dimensioner skall registreras.
4. Definiera konturerna av skadorna genom att manuellt spåra lämpliga gränsen för 1 av 50 åter konstruerad tvärsnitt.
5. Kontrollera varje interfolierade tvärsnittet för att säkerställa datorgenererade interpolationer är korrekta. Manuellt justera gränsen vid behov.
6. Ställ tröskel den grå-nivå så att endast lesionen har valts och exportera mätdata.
7. För varje avsökning, definierar en vertikal område av intresse som innehåller lesionen och spåra gränsen mellan media och neointima (dvs., Läget för inre elastisk lamina) för varje 50 ^{-avsökningselektroden-line.} Interpolera intima / media gränserna för de interfolierade skanningslinjer i programvaran, och kontrollera och korrigera passform där så krävs. Ytterligare segment definieras detta tredimensionell volym till en manuellt definierad intensitet tröskel för att producera en binär bildserien där vita pixlar representerar neointima och svarta pixlar representerar patent lumen.
8. Mätningar som görs inkluderar: total skada volym (objekt volym), luminal volym (total volym - objekt volym) och fördelningen av skada och lumen tvär sektional område längs den axiella längden av den studerade kärlet.

Representative Results

Preliminär skanning av friska (unlesioned) murina lårbensartärerna (n = 5) visade att transmissionsavbildning inte ge användbara bilder. Detta var en följd av de röjda artärer blir genomskinligt (snarare än alltför ogenomskinlig) för överföring imaging.However, är detta fördelaktigt för avbildning av utsläpp eftersom det inte finns någon absorbans / spridning av den utsända signalen. Däremot lårbensartärerna autofluoresce starkt i kanalen emissions, med den största signal efter excitering vid 405 till 445 nm (i enlighet med en 410 nm exciteringstoppen för elastin ^14). 2-dimensionella skivor rekonstruerade från dessa bilder skiljer sig tydligt media från lumen och adventitia och lumen.

I murina lårbensartärerna skörd 28 dagar efter tråd- (n = 6) eller ligation- (n = 5) inducerad skada neointimal förtjockning var tydlig i icke-tomografiska utsläppsprognoser (figur 3A). I rekonstruerade 2-Dimensional skivor kan koncentriska neointimala lesioner skiljas från media genom sin svagare utsläpp (figur 3B och figur S1).

OPT utsläpps bilder av hela berget prover av aortabågen och dess viktigaste grenar från aterosklerotisk möss (n = 8) identifierade lesioner med den förväntade anatomiska fördelningen (dvs.., I mindre krökning av aortabågen, den brachiocephalic artär, och ursprunget av den vänstra halspulsådern och vänstra subclavia artärer (Figur 4A). tvärsnittsbilder visade att uppgifterna var typiskt excentriska skador och var lätt att skilja från media och lumen (Figur 4B, figurer S2 och S3).

Bearbetnings artärer för histologisk analys efter OPT bekräftade icke-förstörande natur OPT, med sektioner framgångsrikt färgade med hjälp av histologiska (United States Trichrome, Picrosirius röd) och immunhistokemisk (α-SMA, Mac-2) tekniker (figurerna 3C och 4C).

Mätning av lesionsstorleken använder OPT har visat sig överensstämma med mätningar som erhållits med hjälp av bildanalys av histologiska sektioner tagna från samma artär ^11.

Planimetrisk mätningar av skadeområdet som erhållits genom OPT och histologi korrelerade tätt genom linjär regression för trådlösa (R ² = 0,92) och ligation-inducerad (R ² = 0,89) neointimala skador och aterosklerotiska plack ^(R2 = 0,85). En viktig fördel med OPT är dess förmåga att aktivera 3-dimensionell analys. Genom att utveckla volymetriska kvantifiering av lesioner med denna teknik, kunde vi spela skadevolymer i trådlösa (0,1100 ± 0,0091 mm ^3, n = 6) och ligering skadade lårbensartärer (0,0200 ± 0,0089 mm ^3, n = 5) och även i aterosklerotiska brachiocephalic artärer (0.180 ± 0,018 mm ^3; n = 8). Mätningar var mycket reproducerbara (variationskoefficienter 5,4%, 11,4% och 4,8%, respektive, n = 4) för alla typer av skada. Neointimala lesioner i tråd skadade kärl var större (p <0,0001) än de som produceras genom ligering, i överensstämmelse med den större grad av skador som orsakats av den förra.

De data som genereras kan också uttryckas som skadeprofiler (Figur 5) och som lämnats till dynamisk, kvalitativ utvärdering (se figur S1 - S3). Detta tillvägagångssätt visade tydligt omfattningen av lesionsbildning som svar på olika förfaranden skade och betonade den ojämna fördelningen av lesionsbildning i skadade kärl.

Figur 1: Metoder för att initiera lesionsbildning i murin lårbensartären & #.160, (A) Retrograd insättning av en angioplastikstyrledningen i lårbensartären, med hjälp av en arteriotomi i Poplietallymfknutor artär stimulerar lesionsbildning som svar att sträcka skada och avlägsnande av endotelet. Blodflödet återupprättas över den skadade delen av kärl. (B) neointimal proliferation i frånvaro av intraluminala sträcka, blottläggning eller avbrott i blodflöde kan induceras genom ligering antingen den femorala eller popliteal artären omedelbart distalt till den femorala artären bifurkation. (C) En allvarligare icke-denuding skada / spridning svar kan induceras genom att ligera både lårbens och popliteala artärer över förgreningspunkten för den gemensamma lårbensartären. Denna teknik kommer också att blockera blodflödet i den distala delen av lårbensartären.

Figur 2:. Karakteristiskt avsättning av aterom i musen aortabågen Atherosclerosis benägna (Apolipopotein E brist möss) livnärde ett högt kolesterol västerländsk diet under 12 veckor fram ett karaktäristiskt mönster av skada nedfall i aortabågen och dess större grenar. Såsom demonstreras, lesioner är synliga (pilar), genom grov inspektion under ett dissektionsmikroskop, i aortabågen, den brachiocephalic artären, och i ostia av den vänstra karotisartären och den vänstra subklavikulära artären.

Figur 3:. Lesionsbildning efter ligering av den vänstra lårbensartären (A) Icke-tomografiska fluorescens emissions bilder (inverterad att öka tydligheten - mörka områdena motsvarar starkare emission) möjliggöra identifiering av intimaförtjockning (röd arrowheannonser). (B) Tydliga kärl regioner och lumen kan urskiljas i tomografiska rekonstruktioner. (C) Histologisk analys (United States trikrom) betonar klara likheter med bilder som erhållits med hjälp av OPT. Skala barer i (AC) är 200 mm. Anpassad från Kirkby et al. ¹¹ Skala barer i (AC) är 200 nm.

Figur 4:. Avbildning av aterom i aortabågen av ateroskleros benägna möss (A) aterom (röda pilspetsar) är uppenbart i icke-tomografiska bilder (inverterad så att mörkare områden indikerar starkare utsläpp och därmed förbättra tydligheten) av aortabågen, på platser förutspådde som aterom bärande genom inspektion under ljusmikroskop (se figur 2). (B) Denna fördelningsmönster bekräftas i tomografiska spOss-sektioner. (C) Histologisk (United States trikrom) färgning visar nära likhet med tomografiska sektioner och immunohistokemi med hjälp av flera olika antikroppar betonar den kompletterande karaktären hos OPT med traditionella metoder för skadeanalys. Skalstrecken i (A-B) är en mm; Skala bar i (C) är 250 nm. RSA, höger subclavia; RCA, högra halspulsådern, LCA, vänster halspulsådern, LSA, vänster subclavia; BCA brachiocephalic artär; AAo stigande aorta; Dao, nedåtgående aorta. Anpassad från Kirkby et al. ¹¹

Figur 5: Analys av lesion och lumen profiler indikerar varierande omfattning av neointimal proliferation som svar på olika metoder för arteriell skada Optisk projektionstomografi tillåter lesionen och lumentvärsnitts measuremen.ts som skall plottas mot avståndet längs lårbensartären. Detta visar tydligt att, jämfört med en oskadad artär (A), partiell ligering (B) ger små, relativt diskreta skador, medan den totala ligation (C) ger fullständig ocklusion på platsen för ligering men skadan inte sträcker sig långt längs artären . Intraluminal trådskada (D) ger en lesion som nästan helt täpper den distala delen av provet och sträcker sig längs hela längden av den avsökta delen av artären. Anpassad från Kirkby et al. ¹¹

Figur S1. Animerad rekonstruktion av tvärsnittsbilder som erhållits från en mus lårbensartären efter ligation skada. Denna typ av animerad bild är användbar för både kvalitativ och kvantitativ analys. Som animeringen flyttas från den proximala till distala delar av artären gradvis utveckling av en ocklusiv neointima, skivaernible från lumen och media, är uppenbart. Sidogrenar kan lätt identifieras och det är uppenbart luminala ocklusion och utåt ombyggnad av artären som skade ökar i storlek. Fullständig ocklusion av kärlet sker en gång platsen för ligering uppnås. Anpassad från Kirkby et al. ¹¹

.. Figur S2 Animerade rekonstruktion av tvärsnittsbilder av en aortabågen från en ateroskleros benägna mus Animationen börjar med tvärsnitt av stigande (vänster - som visas först) och fallande (höger) aorta. Små skador visas i aorta ascendens som skannings rör sig i riktningen för aortabågen. Bilderna rör sig sedan genom bågen för att visa kraftigt skadad ostia av brachiocephalic (vänster), vänstra hals (mitten) och vänster subclavia (höger) artärer. När genomsökningen flyttas distalt längs dessa grenar skadorna gradvis minska och försvinna, först i subCLavian artären, sedan i halspulsådern och slutligen i brachiocephalic artären. Intressant, skadan i brachiocephalic artär rör på flödesdelaren som detta fartyg delar i den högra halspulsådern och höger subclavia artärer. Anpassad från Kirkby et al. ¹¹

Figur S3. Animerad, volym renderad bild av en aortabågen från en ateroskleros benägna mus. Optisk projektion tomografi tillåter generering av 3-dimensionella bilder, i det här fallet visar skadefördelning i aortabågen av en apolipoprotein E brist mus. (A) aterom är närvarande i de förväntade ställen (i hela brachiocephalic artär, i ostia av de vänstra karotida och subclavia artärer och i den mindre krökningen av aortabågen). (B) Segmentering och rendering av skada (visas i rött) bärande tvärsnitt betonar fördelningen av plack när ovanpå den ursprungliga bilden.Anpassad från Kirkby et al. ¹¹

Discussion

3-dimensionella analyser har en stor potential för att ersätta eller lägga till de 2-dimensionella histologiska tekniker som fortfarande ligger till grund för majoriteten av undersökningar av arteriell lesionsbildning. Här OPT visas i små murina artärer (med murina lårbensartärerna förmodligen representerar de minsta fartyg som kan analyseras framgångsrikt använder denna teknik). Det är emellertid också lämplig för användning med artärer (och skador) från andra arter, inklusive små till medel mänskliga fartyg stora; vår grupp har framgångsrikt använt tekniken för att analysera lesioner i kaninaorta (Bezuidenhout et al;. opublicerad). OPT lovar snabbare analyser och ökad strukturell information jämfört med traditionella histologi och har fördelen av att inte förhindra efterföljande analys av provet med både histologiska och immunhistokemiska tekniker.

De bilder som produceras med hjälp av OPT gav anatomiska detaljer, visar platser av lesionsbildningoch storleken av lesioner i dessa områden. De artärer som används i dessa undersökningar är förmodligen nära gränsen för upplösning för tekniken och bildkvaliteten är därför försämras till en viss grad av artefakter (förmodligen på grund av rotationsförskjutning, ofullständig clearing, reflexion / brytning vid agarosen hörn och fokusera problem) . Trots detta, de uppgifter som krävs (dvs skikt av kärlväggen) förblir urskiljas och därför tekniken är mycket användbar för kvantifiering av enskilda lager. I själva verket kan bilderna kvantifieras snabbt och reproducerbart för att ge mätningar av skada och luminala volym i plackbärande delar av fartyget, liksom tvärsnittsarea för den skada och lumen på utvalda platser i provet. Stor (aorta) och medelstora (lårbens, halspulsådern, subclavia) murina artärer - de som allmänt används för analys av aterosklerotisk och neotintimal lesionsbildning hos möss - var framgångsriktanalyseras med hjälp av denna metod. I själva verket har vi nu använt OPT att demonstrera effekten av farmakologiska interventioner och genetisk manipulation på aterosklerotisk och neointimal lesionsstorlek. Till exempel, endotelin receptorblockad förändrad neointimal lesionsbildning medan selektiv radering av endotelin B-receptorn från kärlendotelet inte ^15. I ateroskleros benägna möss, var genetiska strykningen av enzymerna 11β-HSD1 ¹⁶ eller galektin 3 ¹⁷ visat sig minska storleken av aterosklerotiska lesioner.

Kvantifiering av skada volym är en uppenbar fördel av OPT. Det ger en mer informativ uppgift om den totala skadebördan i en artär ⁴ än vad som vanligtvis erhålls med histologiska metoder. Analysera hela skadan minskar selektionsfel och fel som oundvikligen kommer att uppstå när diskreta delar av ett fartyg väljs för analys. Produktion av longitudinella skadeprofiler är en ytterligare styrka OPT, Understryks av jämförelsen av lesioner inducerade av olika typer av skador ^13,16 (Figur 5). Till exempel, både komplett ligering och trådinförings inducerade nästan total ocklusion nära femero-popliteal bifurkation. Trådskada emellertid medförde skador som sträckte sig utmed hela längden av den skannade sektionen, medan lesioner inducerade av arteriell ligering minskade snabbt i storlek och försvinna. Detta mönster är förenligt med den större omfattningen av skada som vållats genom insättning av angioplastik ledaren. Generera liknande resultat med användning av histologiska snitt är dyrt, tidskrävande och arbetsintensiv.

Fördelarna med OPT omfatta kvaliteten på bilderna den producerar och dess relativa snabbhet och enkelhet (vi har rutinmässigt skannat 20 fartyg per dag). Bildkvaliteten verkar överlägsen eller åtminstone jämförbara med andra metoder för att generera 3-dimensionella bilder ex vivo (t.ex. MRI och mikro- CT), yet OPT kräver kortare skanningstider (integrationstiden för våra studier var typiskt 1-2sec / bild) och är billigare. Provberedning sträcker sig över flera dagar, men kräver lite arbete, kan fartygen framställas i omgångar, och data kan förvärvas i en session. Följaktligen är genomströmningen hög och kräver inte utvidgas användningen av skannern. Viktigt är att icke-förstörande natur OPT innebär att den kan användas för att identifiera områden av intresse för immunohistokemisk undersökning; vilket sålunda reducerar mängden skärning och färgning krävs. Det är möjligt att utvecklingen av hög upplösning ultraljud ger en alternativ metod för volyme kvantifiering av skador i artärerna denna storlek, men författarna är omedvetna om de publikationer som visar det här programmet.

Kanske föga förvånande, är bildkvaliteten i OPT sämre än mikroskopiska tekniker (som kan naturligtvis endast utföras på mindre prover). Föreslagna förbättringar att reconstruction av data kan ta itu med denna begränsning genom att tillåta framtida förbättring av bildkvaliteten ^19,20. En annan metod bekymmer är att vävnadsbehandling förändrar egenskaper hos provet. Till exempel den lipofila karaktären av clearingmedel, är sannolikt att avlägsna lipid från aterosklerotiska skador, medan tidigare uttorkning kan orsaka krympning (även om naturligtvis, uttorkning och lipid borttagning steg är också ett inslag i bensylalkohol / bensylbensoat (BABB) provberedning för inbäddning i paraffin). BABB användes i denna undersökning som, i jämförelse med hydrofila clearingmedel (t ex glycerol ²¹⁾ orsakar endast små förändringar i morfologi.

Det finns flera möjligheter till vidareutveckling och förfining av OPT, i synnerhet när det gäller att spåra 3-dimensionella arrangemang av viktiga celler och signalering faktorer som påverkar arteriella ombyggnad. Den starka autofluorescens av arteriell vävnad, som är en sådann fördel vid alstring av anatomiska bilder, inte avbryts genom befintliga förfaranden för blekning ²² och kan begränsa användningen av fluorescerande prober för att bedöma RNA och distributionsproteinmönster. Användningen av kolorimetriska prober (t.ex. β-galaktosidas) visualiseras genom överföring avbildning kan övervinna denna begränsning.

Avslutningsvis har OPT stor potential för 3-dimensionell avbildning av lesioner i intima av murina artärer. Den utgör ett betydande framsteg på 2-dimensionella metoder som i allmänhet arbetsintensiva och inte på ett effektivt sätt representerar den totala skadevolymen. OPT är relativt snabb, bekväm och icke-förstörande. Ny utveckling inom bildanalys lovar att ytterligare öka kraften och användbarheten av tekniken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating Microscope	Zeiss, Germany		OPMI Pico i
Anesthetic Machine	Vet Tech, UK
Fluovac	Harvard Apparatus UK	340387
Fluosorber	Harvard Apparatus UK	340415
Bead Sterilizer	Fine Science Tools, UK	1800-45
Heated Mat	Fine Sceince Tools, UK	21061-10
Balance	Mettler Toledo	MS1602S	PB1502 or equivalent
Sutures	Ethicon, UK		5/0 Mersilk
Guidewire	Cook Inc, USA	C-PMS-251	0.014”
Suture Silk	Fine Science Tools, UK	18020-60	6/0 Mersilk
Surgical Tools	Fine Science Tools, UK	14058-09	Toughcut Iris scissors
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, UK	15000-01
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools, UK	11251-35
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools, UK	11370-31
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools, UK	13008-12
Bulldog clips	Fine Science Tools, UK	18050-35
Bioptonics 3001 Tomograph	Bioptonics, UK
Magnetic OPT Mount	Bioptonics, UK
Computer	Dell Inc, UK
Peristaltic pump	Gilson	F117606	Minipuls 3
DataViewer software	Skyscan, Belgium	v.1.4.4
NRecon software	Skyscan, Belgium	v.1.6.8
CTan software	Skyscan, Belgium	v.1.12
Isoflurane	Merial Animal Health Ltd, UK	AP/Drugs/220/96	100% Inhalation vapor, liquid
Medical Oxygen	BOC Medical, UK	UN1072
Vetergesic	Alstoe Animal Health Ltd, UK		0.3 mg/ml
1% Lignocaine	Hamlen Pharmaceuticals, UK	LD1010	10 ml ampoule
EMLA Cream	Astra Zeneca, UK
Sodium Pentobarbital	Ceva Animal Health Ltd, UK
Western Diet	Research Diets, USA	D12079B	0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline	Sigma UK	P4417
Heparin (Mucous)	Leo Laboratories, UK	PL0043/003GR	250,000 Units
Neutral Buffered Formalin	Sigma, UK	HT501128	10%
Ethanol	VWR BDH Prolabo, UK	20821.33	Absolute AnalaR
Agarose	Invitrogen, UK	16020050	Low melting point
Filter Paper	GE Healthcare, UK	113v	Whatman
Cyanoacrylate adhesive	Henkel, UK	4304	Loctite
Benzyl alcohol	Sigma, UK	B6630
Benzyl benzoate	Sigma, UK	402834
Methanol	VWR BDH Prolabo, UK	20856.296	100%