Abstract
הדור והניתוח של נגעים של כלי דם במודלים של בעלי החיים מתאימים הוא אבן יסוד של מחקר למחל לב וכלי דם, יצירת מידע חשוב על פתוגנזה של היווצרות נגע והפעולה של טיפולים חדשניים. שימוש בעכברי טרשת עורקים נוטים, שיטות ניתוחיות של אינדוקציה נגע, ושינוי תזונתי השתפרו באופן דרמטי את ההבנה של המנגנונים שתורמים להתפתחות מחלה ואת הפוטנציאל של טיפולים חדשים.
קלסי, ניתוח של נגעים מתבצע לשעבר vivo תוך שימוש בטכניקות היסטולוגית 2-ממדיות. מאמר זה מתאר יישום של טומוגרפיה אופטית הקרנה (השטחים הכבושים) לכימות 3 ממדים של נגעים בעורקים. כטכניקה זו היא שאינה הרסנית, הוא יכול לשמש כתוספת לניתוחים היסטולוגית וimmunohistochemical סטנדרטיים.
נגעי Neointimal היו נגרמים על ידי חוט-הכנסה או קשירה של אמנות הירך העכברery תוך נגעים טרשתיים נוצרו על ידי ממשל של דיאטת atherogenic לעכברי apoE הלקויים.
נגעים נבחנו באמצעות הדמיה השטחים הכבושים של פליטת autofluorescent אחרי היסטולוגית משלים וניתוח immunohistochemical. Opt נגעים להבחין בבירור מקיר כלי הדם הבסיסי. גודל נגע חושבו בסעיפים 2 ממדים באמצעות planimetry, המאפשר חישוב שטח חתך מקסימאלי נפח נגעים ו. נתונים שנוצרו באמצעות השטחים הכבושים היו בקנה אחד עם מדידות שהושגו באמצעות היסטולוגיה, המאשרים את הדיוק של הטכניקה ואת הפוטנציאל שלה כהשלמה (ולא חלופי) לשיטות מסורתיות של ניתוח.
עבודה זו מדגימה את הפוטנציאל של השטחים הפלסטיניים הכבושים הדמיה טרשת עורקים וneointimal. הוא מספק טכניקה מהירה, צורך הרבה vivo לשעבר לכימות 3 ממדים השגרתיים של שיפוץ כלי דם.
Introduction
היווצרות נגעים בעורקים היא מרכזית לתחלואה הגבוהה ותמותה הקשורים במחל לב 1. היווצרות נגע נחשבת ללהיגרם על ידי תגובה דלקתית בלתי מוגבלת לפגיעה עורקת 2. טרשת עורקים יוצרת לאט בתגובה לפציעה כרונית לדפנות העורקים ואילו נגעי restenotic לפתח במהירות הבאה נזק מכאני חריף (למשל, לאחר השתלת סטנט). המנגנונים שתורמים להתפתחות נגעים בעורקים כבר הבהירו באופן משמעותי על ידי השימוש במודלים של בעלי החיים מתאימים, לעתים קרובות בשילוב עם מניפולציות גנטיות רלוונטיות 1.
ניתוח של גודל נגע והרכבו קלסי תלוי במידה רבה על vivo לשעבר, היסטולוגיה 2 ממדים (אם כי זה משתנה עם התפתחות שיטות משופרות לin vivo ואיתור vivo לשעבר וניתוח של נגעים בבעלי חיים קטנים <sup> 3). ניתוח היסטולוגית של נגעים בעורקים הוא עבודה אינטנסיבית, זמן רב ומספק מידע מוגבל למבנה 3-ממדי. לדוגמא, נטל נגע מוערך בדרך כלל על ידי מדידת שטח החתך של נגע (או באתרים שנבחרו באקראי או באתר של חסימה המרבית). זה מספק ניתוח חלקי של נטל נגע כולל. כל הר טכנולוגיית הדמיה 3 ממדים מספקת פתרון אפשרי לבעיה זו, אך כמה מפתיע גישות מתאימות תוארו. זה יכול להיות בגלל בעיקר לגודל של עורקי עכבר שהם גדולים מדי למיקרוסקופיה confocal פוטון יחיד אבל קטנים מדי עבור הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) 4 ורנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (CT) 5. יישום של vivo לשעבר MRI ו- CT מיקרו למחקר של טרשת עורקים בעכברים מרמזים שהם מציעים רזולוציה מוגבלת, אפילו בעורקים גדולים יחסית. נוסף על כך, הפעמים הרכישה ארוכות יחסית הנדרשלהגביל את התפוקה (ולהגדיל את עלויות סריקה) 4,6.
פיתוח של שיטות הדמיה אופטית חדשות (כגון טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית 3,7 ותמונה-אקוסטי טומוגרפיה 8) מציע הרבה פוטנציאל לשיפור הדמיה של נגעים בעורקים בעכברים. פוטנציאל דומה מוצג על ידי טומוגרפיה אופטית הקרנה (השטחים הכבושים) שפותח על מנת לאפשר ניתוח של עוברי עכברים. השטחים הכבושים נועד דגימות תמונה הנעות בין 0.3-10 ~ מ"מ קוטר 9. הדמיה הילוכים מתעדת את האטימות של מדגם שקוף למחצה לאור הנראה צבעוני ו, יכול לשמש לזיהוי של מבנים אנטומיים. פליטת פליטה רשומות הדמיה של האור הבא עירור באורכי גל ספציפי מאנדוגני (למשל, קולגן, אלסטין) וfluorophores אקסוגניים במדגם. זה יכול גם לספק מידע אנטומי (מאז רכיבי רקמות שונים יכולים להיות שונים בסוג והצפיפות של מיני autofluorescentהווה). בנוסף, חלוקת immunoreactivity או ביטוי גנים ניתן לקבוע תוך השימוש בבדיקות ניאון מתאים 10. לכל אחד ממצבי ההדמיה (שידור או פליטה), אור למכשיר תשלום מצמידים ממוקד כדי לאפשר לכידת תמונת איטרטיבי כמסתובב מדגם (בדרך כלל 400 תמונות במרווחים של 0.9 מעלות). אלה יכולים לשמש לחישוב הנפח בשיטות סטנדרטית טומוגרפיה שיקום (כגון מסונן גב-הקרנה (באמצעות אלגוריתם קונוס) או שחזור איטרטיבי).
וידאו זה מדגים יישום הרומן שלנו של השטחים הכבושים לניתוח 3 ממדים מהירים, כימות וחסכונית של נגעים טרשתיים וneointimal, כפי שתואר לעיל בet al קירקבי. 11. הטכניקה הוצגה להיות מתאים לכימות גודל נגע בשלושה דגמים נפוצים: חוט-פגיעת עורק הירך (i); (Ii) קשירת עורק הירך, (iii) טרשת עורקים נגרם דיאטה ובapolipoprotein E הלקוי (apoE - / -) עכברים.
Protocol
1. אינדוקציה כירורגי של Neointimal פצעים בעורק הירך העכבר
- ניסויים בבעלי חיים צריכים להתבצע בהתאם לדרישות אתיקה לאומית ומוסדית. כל הניתוח צריכה להתבצע באמצעות טכניקת aseptic מתאימה. אינדוקציה של נגעי neointimal מושגת באמצעות שינוי של הטכניקה שתוארה על ידי Roque et al. 12 והאח Sata אל. 13.
- שוקלים זכר עכברי C57BL6 / J (גיל 10-12 שבועות; ז משקל 25-30) ולאחר מכן לטשטש על ידי אספקת isoflurane 4-5% בתא אינדוקציה. ברגע שהרדמה כבר מושרה, להעביר את העכבר למזרן מחומם כדי לשמור על טמפרטורת גוף על 37 מעלות צלזיוס. המשך ממשל של isoflurane (2-3%) באמצעות מסכה.
- ברגע שרמה מתאימה של הרדמה כבר מושרה (חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן), לספק כיסוי משכך כאבים על ידי ממשל של עצירות (0.1 מ"ג / קילוגרם -1). לאחר מכן מניח את העכבר במצב שכיבהd לגלח את פני השטח הגחון של hindlimb עזבה.
- עושה חתך כדי לחשוף את השרירים של hindlimb העליונה ו, בין ההסתעפות עם עורק popliteal ודופן הבטן, להשתמש נתיחה בוטה כדי לבודד את עורק הירך ווריד מעצב הירך. להשקות את הפצע כנדרש באמצעות 1% w / lignocaine נ.
- הנח הפרוקסימלי (קרוב לדופן הבטן) ודיסטלי (מייד מתחת לסניף עם עורק popliteal) חיבורי אותיות זמניות (6/0 Mersilk) סביב העורק לוריד כדי לשלוט בזרימת דם הירך. אז לבודד את עורק הרגל (כ 2-5 מ"מ דיסטלי לסניף עם עורק הירך) ולקשור distally. הנח מייתר שני, התיר מתחת לעורק popliteal.
- לעשות חתך קטן (arteriotomy) בעורק popliteal, מייד דיסטלי לסניף עם עורק הירך, מניעת דימום על ידי הפעלה לחץ על המייתר הזמני הפרוקסימלי. לקדם ישר, צץ 0.014 "guidewire1-1.5 סנטימטר לאורך עורק הירך לכיוון דופן הבטן ולהשאיר במקום למשך 30 שניות (איור 1 א).
- הסר את guidewire ולקשור את עורק הרגל מעל arteriotomy, באמצעות המייתר הניח למטרה זו, ונזהר שלא לחסום את עורק הירך.
הערה: לפגיעה הנגרמת על-קשירה. שיפוץ Neointimal ללא פגיעת intraluminal יכול להיגרם על ידי ligating עורקי הירך או popliteal (איור 1 ו1C). כדי להשיג בצע את הפעולות הבאות 1.1-1.5. עם זאת, לא עושה arteriotomy אבל (הימנעות שלב 1.6) או (ט) ולקשור את עורק הרגל מייד דיסטלי לעורק הירך או (ii) ולקשור את עורק הירך המשותף בנקודת הסניף עם עורק popliteal. לאחר מכן להמשיך עם צעד 1.8. - הסר חיבורי אותיות זמניות, לסגור את הפצע עם תפר חיצוני רציף (5/0 Mersilk) ולהחיל קרם אמלה (לידוקאין 2.5%, prilocaine 2.5%). הרשה בעלי החיים מחדש להשיג תודעה (בדרך כלל 5-10 דקות) ולוודא שהם נעים בחופשיות סביב הכלוב שלהם (צליעה קלה עשויה להיות ברורה ברגל הפגועה, אבל זה צריך לפתור על 2-3 הימים הראשונים לאחר ניתוח) לפני ההחזרה למחזיק חדרים. עכברים לא צריכים להיות מאוחסנות ביחידים לאחר ניתוח.
- לאפשר את בעלי החיים כדי להתאושש עד 3 חודשים. נגעים קטנים יתחילו להופיע ~ 7 ימים לאחר פציעת חוט ויגיעו לגודלו מרבי יציב לאחר ~ 21-28 ימים.
2. אינדוקציה של טרשת עורקים פצעים בE אפוליפופרוטאין - / - עכברים
- לנהל דיאטה מערבית (0.2% כולסטרול; דיאטות מחקר, ארה"ב) לזכר, 6 בשבוע עכברים ישנים ApoE-null (גדלו בבית) למשך 12 שבועות.
- טרשת עורקים הן בדרך כלל נראה בבדיקת ברוטו של קשת אב העורקים וענפיו הגדולים (איור 2).
3. ניתוח עורקי פצעים הקרנה אופטית באמצעות טומוגרפיה (השטחים הכבושים)
NT "> הערה: תמונות הכבושים של נגעים בעורקי הירך עכברי ודגימות קשת אב העורקים התקבלו באמצעות סורק אופטי הקרנה.- להרדים עכברים על ידי קיבוע זלוף transcardiac וexsanguination בהרדמה מסוף (80 מ"ג / נתרן pentobarbital קילוגרם), באמצעות heparinised נאגר מלוח (10 U / ml) פוספט (PBS) ואחריו 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין.
- לבודד עורקי הירך או קשת אב העורקים וענפיו הגדולים (עורק תרדמה שמאלי, עורק subclavian שמאל, תא מטען brachiocephalic), לפי העניין, ולהסיר חומר פרי adventitial זר. לאחר תיקון ב 10% O נאגר פורמלין / N, לפני האחסון ב -70% אתנול עד צורך.
- עורקים להטביע בשיעור של 1.5% נקודת התכה נמוכה agarose, מסוננים מראש דרך Whatman 113 V נייר. צרף כל דגימה לשטחים הפלסטיניים הכבושים מגנטיים הר עם דבק cyanoacrylate עם ציר הכלי בקנה אחד עם זה של ההר. חתוך agarose העודף לצורה חרוטית. ליבש במתנול 100% עבור שעות לפחות 12.
- גכלי ליר על ידי טבילה (12-24 שעות) בתערובת של אלכוהול בנזיל ונזיל בנזואט (1: 2 V / V).
- הנח דגימות פינו בטומוגרפי מכויל. הגדר את רזולוציית ל1,024 x 1,024, ולקבוע הגדלה אופטית שמאפשרת לכל תחום עניין של לראות. נפח השטחים הכבושים הוא איזוטרופי Z- הציר משוחזר לאותה הרזולוציה (כלומר, 1,024 x 1,024 x 1,024), גודל voxel ~ 200 מיקרומטר. זה עשוי לייצג על-הערכה של החלטה כשם צפויים להיות חפצי שיקום. התאם את עמדת מדגם, כך שהוא מסתובב על הציר שלו במרכז שדה הראייה בשדה הבהיר, ערוץ שידור.
- בערוץ פליטת מסנן GFP1 (מסנן עירור 425 ננומטר עם 40 ננומטר להקה עוברת; מסנן פליטה: 475 מסירה ארוכה ננומטר), להתמקד הדגימה ולהתאים את זמן חשיפה למקסם את הטווח הדינמי של תמונה וכתוצאה מכך (להימנע over-רוויה). סרוק את הכלי בערוץ פליטת GFP1 בלבד, בצעד 0.9 מעלות סיבוב. </ Li>
- בסיום, לאשר איכות נתונים רכישה באמצעות תוכנת DataViewer. הסר דגימה מהסורק.
- כדי לאפשר ניתוח היסטולוגית שלאחר מכן, מדגם מקום במתנול 100% ל> 24 שעות לפני עיבוד לפרפין כנורמלי.
4. תמונת שחזור וניתוח
טומוגרפיה הבנייה מחדש על ידי מסונן גב-הקרנה מתבצעת באמצעות תוכנת NRecon או דומה. ניתן לבצע שחזורים ללא השגחה, בקבוצות.
- לשפר את איכות תמונה על ידי פיצוי לחוסר תיאום והתאמת רמות עוצמת תמונה.
- בדוק את איכות שחזור תמונה באמצעות תוכנת DataViewer.
- זהה את הסעיף המתאים של המדגם לניתוח. שמור אורך זה עולה בקנה אחד בין כלי אם ממדי luminal הם שיירשמו.
- להגדיר את קווי המתאר של הנגעים על ידי התחקות ידנית הגבול המתאים ל1 בכל 50 חתכים-נבנה מחדש.
- בדוק כל חתך משולבים על מנת להבטיח שחדירי מחשב שנוצר הם נכונים. באופן ידני להתאים את הגבול במידת צורך.
- הגדר את סף הרמה-האפורה, כך שרק הנגע נבחר ולייצא את נתוני המדידה.
- עבור כל סריקה, להגדיר אזור אנכי של עניין המכיל את הנגע ולעקוב אחר הגבול בין התקשורת וneointima (כלומר., העמדה של lamina האלסטיות הפנימי) עבור כל סריקת אונליין ה -50. לשרבב גבולות אינטימה / תקשורת לקווי סריקה רציף בתוכנה, ולוודא ולתקן את בכושר שבו נדרש. קטע נוסף זה הגדיר שלושה ממדי נפח לסף עוצמה ידנית מוגדר לייצר סט תמונה בינארי שבו פיקסלים לבנים מייצגים neointima ופיקסלים שחורים מייצגים לומן פטנט.
- מדידות שנלקחו כוללות: סך נפח נגעים (אובייקט נפח), נפח luminal (סה"כ נפח - אובייקט נפח) והפצה של נגע ולומן כת צולבתאזור ional לאורך הציר של כלי השיט למד.
Representative Results
סריקה ראשונית של עורקים בריאים (unlesioned) עכברי הירך (n = 5) הראתה שהדמית השידור לא ספקה תמונות שימושיות. זה היה תוצאה של העורקים פינו הופכים שקוף מדי (ולא אטום מדי) לimaging.However שידור, זה מועיל להדמיה פליטה כפי שאין הספיגה / פיזור של האות הנפלטת. לעומת זאת, עורקי הירך autofluoresce מאוד בערוץ הפליטה, עם האות הגדולה הבאים עירור ב 405-445 ננומטר (בקנה אחד עם שיא עירור 410 ננומטר לאלסטין 14). פרוסות 2 ממדים שחזרו מתמונות אלה בבירור להבחין התקשורת מהלום וadventitia ולומן.
בעורקי הירך עכברי שנקטפו 28 ימים לאחר המתכת דקה (n = 6) או ligation- (n = 5) עיבוי neointimal פגיעה הנגרמת ניכר בתחזיות פליטה הלא-טומוגרפיה (איור 3 א). ב2-dimens המשוחזרפרוסות ional, יכולים להבחין בין תקשורת נגעי neointimal קונצנטריים על ידי הפליטה החלשה שלהם (איור 3 ואיור S1).
תמונות פליטה הפלסטיניים הכבושים של דגימות הר שלמות של קשת אב העורקים והענפים העיקריים שלה מעכברי טרשת עורקים (n = 8) נגעים מזוהים עם ההפצה אנטומיים הצפויה (כלומר., בעקמומיות פחותה של קשת אב העורקים, עורק brachiocephalic, והמקורות של התרדמה על ימין ועל שמאל עורקי subclavian (איור 4 א). תמונות חתך ציינו כי אלה היו בדרך כלל נגעים אקסצנטריים והיו בקלות מכובדת מהתקשורת ולומן (איור 4, איורים S2 וS3).
עורקי עיבוד לניתוח היסטולוגית הבאים הכבושים אישרו את הטבע ההרסני של השטחים הפלסטיניים הכבושים, עם קטעים בהצלחה המוכתמים באמצעות היסטולוגית (ארצות הברית Trichrome, Picrטכניקות osirius) וimmunohistochemical האדומים (α-SMA, מק-2) (3C דמויות ו4C).
מדידה של גודל נגע באמצעות הכבושים הוכחה בקנה אחד עם מדידות שהושגו באמצעות ניתוח תמונה של סעיפים היסטולוגית נלקחו מאותו העורק 11.
מדידות planimetric של אזור הנגע שהושגו על ידי השטחים הכבושים והיסטולוגיה קשורה קשר הדוק ברגרסיה לינארית למתכת דק (R 2 = 0.85) (R 2 = 0.92) ומושרה קשירה (R 2 = 0.89) נגעי neointimal ופלאק טרשת עורקים. יתרון חשוב של השטחים הפלסטיניים הכבושים הוא היכולת שלה לאפשר ניתוח 3 ממדים. על ידי פיתוח כימות נפח של נגעים עם טכניקה זו, היינו מסוגל להקליט כרכי נגע בחוט מתכת (.1100 ± .0091 מ"מ 3; n = 6) ועורקי הירך-נפצע קשירה (.0200 ± .0089 מ"מ 3; n = 5) וגם בעורקי brachiocephalic טרשת עורקים (0.180 ± 0.018 מ"מ 3; n = 8). מדידות היו מאוד לשחזור (מקדמים של 5.4% וריאציה, 11.4% ו -4.8%, בהתאמה, n = 4) לכל סוגי הנגע. נגעי Neointimal בכלי-נפצע חוט היו גדול יותר (p <0.0001) מאלה המיוצרים על ידי קשירה, עולים בקנה אחד עם מידה רבה יותר של נזקים הנגרמים על ידי לשעבר.
הנתונים שנוצרו גם יכולים לבוא לידי ביטוי בפרופילי נגע (איור 5) ושניתנו להערכה דינמית, איכותית (ראה איורים S1 - S3). גישה זו בבירור את מידת היווצרות נגע בתגובה להליכי פציעה שונות והדגישה את החלוקה אחידה של היווצרות נגע בכלי נפצעו.
איור 1: שיטות לביצוע היווצרות נגע בעורק הירך עכברי & #.160; () הכנסת מדרדר של אנגיופלסטיקה guidewire לתוך עורק הירך, באמצעות arteriotomy בעורק popliteal מגרה היווצרות נגע בתגובה לפציעה למתוח וההסרה של האנדותל. זרימת דם הוקמה מחדש על הסעיף הפצוע של כלי שיט. התפשטות Neointimal (ב) בהעדר המתיחה intraluminal, denudation או הפרעה לזרימת דם יכולה להיגרם על ידי ligating או הירך או את עורק הרגל מייד דיסטלי אל הסתעפות עורק הירך. (ג) שאינה מערטלות תגובת פציעה / התפשטות חמורה יותר יכולה להיגרם על ידי ligating שני עורקי הירך וpopliteal פני נקודת עורק הירך הנפוצה הסניף. טכניקה זו גם תחסום את זרימת דם בחלק הדיסטלי של עורק הירך.
איור 2:. בתצהיר אופייני של טרשת בקשת אב העורקים עכבר טרשת עורקים נוטה (עכברים חסרים Apolipopotein E) קבלה תזונה מערבית כולסטרול גבוה במשך 12 שבועות לפתח דפוס אופייני של תצהיר נגע בקשת אב העורקים והענפים העיקריים שלה. כפי שהודגמו, נגעים גלויים (חיצים), על ידי בדיקת ברוטו תחת מיקרוסקופ לנתח, בקשת אב העורקים, עורק brachiocephalic, ובאוסטיה של עורק התרדמה השמאלי ועורק subclavian שמאל.
איור 3:. היווצרות הנגע הבא קשירה של עורק הירך השמאלי תמונות () ללא טומוגרפיה פליטת הקרינה (הפוכות להגדיל בהירות - אזורים כהים מתאימות לפליטה חזקה) מאפשרים זיהוי של עיבוי intimal (arrowhe האדוםמודעות). (ב) אזורים של כלי דם ברורים ולומן ניתן להבחין בשחזורים טומוגרפית. הניתוח היסטולוגית (Trichrome ארצות הברית) (ג) מדגיש את הדמיון ברור עם תמונות שהושגו באמצעות השטחים הפלסטיניים הכבושים. ברים סולם ב( AC) הם 200 מ"מ. מעובד מתוך קירקבי et al. 11 ברים סולם ב( AC) הם 200 מיקרומטר.
איור 4:. הדמיה של טרשת בקשת אב העורקים של עכברים נוטים טרשת עורקים () טרשת (ראשי חץ אדומים) היא ברור ממבט בתמונות שאינן טומוגרפיה (הפוך, כך שאזורים כהים מצביעים על פליטה חזקה, ובכך לשפר את הבהירות) של קשת אב העורקים, באתרים חזה כטרשת נושאות על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ אור (ראה איור 2). (ב) דפוס זה של הפצה אושר בCR טומוגרפיהOSS סעיפים. הכתמה (C) היסטולוגית (Trichrome ארצות הברית) מראה דמיון הדוק עם חלקי טומוגרפיה, ואימונוהיסטוכימיה באמצעות מספר נוגדנים שונים מדגישה את האופי המשלים של השטחים הפלסטיניים הכבושים עם גישות מסורתיות לניתוח נגע. ברים סולם ב(-B) הם 1 מ"מ; בר סולם ב( ג) הוא 250 מיקרומטר. RSA, עורק subclavian נכון; RCA, עורק תרדמה תקין; רע"א, עורק תרדמה שמאלי; LSA, עזב עורק subclavian; BCA, עורק brachiocephalic; שלום שלום, עולה אב העורקים; DAO, יורד אב העורקים. מעובד מתוך קירקבי et al. 11
איור 5: ניתוח של פרופילי נגע ולומן מציין שונה של התפשטות neointimal מידה בתגובה לשיטות שונות של פגיעה בעורקי טומוגרפיה הקרנה אופטית מאפשרת נגע ולומן לחצות measuremen חתך.TS להיות זמם נגד מרחק לאורך עורק הירך. זה מראה בבירור כי, בהשוואה לעורק וללא כל פגע (א), קשירה חלקית (B) מייצר נגעים קטנים, יחסית בדידים, ואילו קשירה כוללת (C) מייצרת חסימה מלאה באתר של קשירה אבל הנגע לא להאריך הרבה לאורך העורק . פגיעת חוט Intraluminal (ד ') מייצרת נגע שלחסום כאן כמעט לחלוטין החלק הדיסטלי של המדגם ומשתרע לאורך כל אורכו של הקטע הסרוק של עורק. מעובד מתוך קירקבי et al. 11
S1 איור. שחזור אנימציה של תמונות חתך המתקבלות מעורק הירך עכבר בעקבות פציעת קשירה. סוג זה של תמונת אנימציה שימושי עבור שניהם ניתוח האיכותי וכמותית. כאנימציה עוברת מהפרוקסימלי לסעיפים הדיסטלי של עורק ההתפתחות ההדרגתית של neointima אוטם, דיסקernible מהלום והתקשורת, הוא ברור ממבט ראשון. ניתן לזהות בקלות וענפים בצד יש חסימת luminal ברורה ושיפוץ חיצוני של העורק כעליות נגע בגודל. חסימה מלאה של כלי מתרחשת פעם אחת הוא הגיע לאתר של קשירה. מעובד מתוך קירקבי et al. 11
.. S2 איור שחזור אנימציה של תמונות חתך של קשת אב העורקים מעכבר טרשת עורקים נוטה האנימציה מתחילה עם חתכים של עולה (משמאל - המופיע ראשון) ואב עורקים יורדים (מימין). נגעים קטנים מופיעים באב העורקים עולים כמהלכי סריקה בכיוון של קשת אב העורקים. התמונות ולאחר מכן לעבור דרך הקשת להראות אוסטיה lesioned כבדות של brachiocephalic (משמאל), הצוואר עזב (באמצע) וsubclavian השמאל (מימין) עורקים. כסריקה נעה distally לאורך ענפים אלה הנגעים להפחית בהדרגה ונעלמים, ראשון בsubcעורק lavian, אז בתרדמה ולבסוף בעורק brachiocephalic. מעניין לציין, כי הנגע במהלכי עורק brachiocephalic על מחיצת הזרימה ככלי זה מתחלק לתרדמה תקין ועורקי subclavian הנכונים. מעובד מתוך קירקבי et al. 11
איור S3. אנימציה, תמונה שניתנו נפח של קשת אב העורקים מעכבר טרשת עורקים נוטה. טומוגרפיה הקרנה אופטית מאפשרת דור של תמונות 3-ממדיות, במקרה זה מדגים הפצת נגע בקשת אב העורקים של אפוליפופרוטאין E עכבר לקוי. () טרשת נמצאת באתרים הצפויים (לאורך עורק brachiocephalic, באוסטיה של עורקי הראש וsubclavian שמאל ובעקמומיות פחותה של קשת אב העורקים). פילוח (B) וטיוח של נגע (מוצג באדום) נושאות חתכים מדגישים את חלוקת לוחות כאשר על גבי התמונה המקורית.מעובד מתוך קירקבי et al. 11
Discussion
יש ניתוח 3 ממדי פוטנציאל גדול להחלפה או הוספה לטכניקות היסטולוגית 2 ממדים שעדיין עומדים בבסיס רוב החקירות של היווצרות נגע עורקים. הנה השטחים הכבושים מוצגים בעורקים בעכברים קטנים (עם עורקי הירך עכברי כנראה מייצגים את כלי הקטנים ביותר שניתן לנתח בהצלחה באמצעות טכניקה זו). גם היא, לעומת זאת, מתאימה לשימוש עם עורקים (ונגעים) ממינים אחרים, כוללים כלי אנושיים בגודל קטן עד בינוני; הקבוצה שלנו השתמשה בהצלחה בטכניקה זו כדי לנתח נגעים באב עורקי ארנב (Bezuidenhout et al;. לא פורסם). השטחים הכבושים מבטיחים ניתוח ומידע מבני גדל מהר יותר בהשוואה להיסטולוגיה המסורתית ויש את היתרון של לא מונע ניתוח בדיעבד של המדגם תוך שימוש בטכניקות שני היסטולוגית וimmunohistochemical.
התמונות הופקו באמצעות השטחים הכבושים נתנו פירוט אנטומי, מראה אתרים של היווצרות נגעואת גודל הנגעים באזורים אלה. העורקים המשמשים בחקירות אלה הם כנראה קרובים לגבול של החלטה לטכניקה ואיכות תמונה נפגעת לכן במידה מסוימת על ידי חפצים (כנראה כתוצאה מחוסר תיאום סיבוב, סליקה שלמה, השתקפות / שבירה בקודקודי agarose ובעיות התמקדות) . למרות זאת, את הפרטים הנדרשים (כלומר, שכבות של קיר הכלי) יישארו להבחין ולכן הטכניקה היא מאוד שימושית עבור הכימות של שכבות בודדות. אכן, תמונות יכולות לכמת במהירות וreproducibly לספק מדידות של נגע וluminal נפח בסעיפים נושאות לוחית של כלי השיט, כמו גם באזורי חתך של הנגע ולומן באתרים נבחרים במדגם. גדול (אב העורקים) והבינוני (הירך, הצוואר, subclavian) עורקים בעכברים - אלה בדרך כלל משמשים לניתוח של היווצרות נגע טרשתית וneotintimal בעכברים - היו הצלחהנותח באמצעות שיטה זו. ואכן יש לנו כיום בשימוש הפלסטיניים הכבושים כדי להדגים את ההשפעה של התערבויות תרופתיות ומניפולציה גנטית בגודל נגע טרשתי וneointimal. לדוגמא, סגר קולט אנדותלין שינה היווצרות נגע neointimal ואילו מחיקה סלקטיבית של אנדותלין B קולט מהאנדותל של כלי הדם לא עשתה 15. בעכברים נוטים טרשת עורקים, מחיקה גנטית של האנזימים 11β-HSD1 16 או 17 galectin 3 הוצגו כדי להקטין את גודל נגעים טרשתיים.
כימות של נפח נגעים היא יתרון ברור של השטחים הפלסטיניים הכבושים. זה נותן אינדיקציה יותר אינפורמטיבי בסך הכל נטל הנגע בעורק 4 מ בדרך כלל שהושג עם שיטות היסטולוגית. ניתוח כולו הנגע מפחית הטיית בחירה ושגיאה שבהכרח תתרחש כאשר חלקים של כלי בדידים נבחרים לניתוח. ייצור פרופילי נגע אורך הוא כוח נוסף של השטחים הכבושים, הודגש על ידי ההשוואה של נגעים הנגרמים על ידי סוגים שונים של פציעה 13,16 (איור 5). לדוגמא, שתי קשירה מלאה וחוט-הכנסה מושרה חסימה כמעט מוחלטת קרובה להסתעפות femero-popliteal. פגיעת חוט, נגעים עם זאת, מיוצרים שהשתרעו לאורך כל אורכו של הקטע שנסרק, ואילו נגעים הנגרמים על ידי קשירת עורקים הצטמצמו במהירות בגודל ונעלמים. דפוס זה עולה בקנה אחד עם נגרמת על ידי החדרת guidewire אנגיופלסטיקה מידה רבה יותר של פציעה. יצירת תוצאות דומות באמצעות סעיפים היסטולוגית היא יקרה, זמן רב ועבודה אינטנסיבית.
היתרונות של השטחים הכבושים כוללים את איכות התמונות שהיא מייצרת ומהירות היחסית ופשטות (שנסרקנו באופן שגרתי 20 כלי ליום). איכות תמונה מעולה מופיעה, או לפחות דומה, לשיטות אחרות ליצירת תמונות 3 ממדי vivo לשעבר (כגון MRI ו- CT מיקרו), yהשטחים הכבושים ואח דורשים זמנים קצרים יותר סריקה (זמן אינטגרציה ללימודים שלנו היו בדרך כלל 1-2sec / תמונה) ופחות יקר. הכנת מדגם משתרעת על פני כמה ימים, אבל דורשת עבודה קטנה, ניתן להכין כלי בקבוצות, וניתן לרכוש נתונים בפגישה אחת. כתוצאה מכך, התפוקה היא גבוהה ואינה דורשת שימוש מורחב של הסורק. חשוב לציין, אינו בעלת האופי ההרסני של השטחים הפלסטיניים הכבושים אומר שזה יכול לשמש כדי לזהות אתרים בעלי עניין לבדיקת immunohistochemical; ובכך להקטין את כמות החיתוך וצביעה הנדרשת. ייתכן שהפיתוח של אולטרה סאונד ברזולוציה הגבוהה יספק שיטה חלופית לכימות נפח של נגעים בעורקים בגודל זה, אבל המחברים אינם מודעים לכל פרסומים המדגימים יישום זה.
אולי באופן לא מפתיע, איכות תמונה בשטחים הכבושים היא נחותה טכניקות מיקרוסקופיות (שיכול, כמובן, יבוצעו רק על דגימות קטנות יותר). חידודים מוצעים לreconstruction של נתונים עשוי להתייחס מגבלה זו על ידי המאפשר שיפור עתיד של איכות תמונת 19,20. דאגה נוספת המתודולוגית היא שעיבוד רקמות משנה מאפיינים של המדגם. לדוגמא טבע lipophilic סוכן הסליקה, נזיל אלכוהול / נזיל בנזואט (באב), עשוי להסיר את השומנים מטרשת עורקים, תוך התייבשות עלולה לגרום להתכווצות לפני (אם כי, כמובן, צעדי התייבשות והסרת שומנים הם גם תכונה של הכנת מדגם להטבעה בשעווה פרפין). באב שימש בחקירה זו כ, בהשוואה לסוכני סליקה הידרופילי (למשל גליצרול 21) היא גורמת רק שינויים קטנים במורפולוגיה.
ישנן מספר אפשרויות לפיתוח וחידוד נוספים של השטחים הפלסטיניים הכבושים, במיוחד בכל קשור למעקב הסדר 3 ממדים של תאי מפתח ואיתות גורמים מעורבים בשיפוץ עורקים. Autofluorescence החזק של רקמת עורקים, שהוא כזהיתרון n בדור של תמונות אנטומיים, לא הרווה בשיטות קיימות של הלבנה 22 ועלול להגביל את השימוש בבדיקות ניאון כדי להעריך דפוסי RNA והפצת חלבון. השימוש בבדיקות colorimetric (למשל β-galactosidase) דמיינו ידי הדמיה שידור עשויות להתגבר על מגבלה זו.
לסיכום, יש פוטנציאל גדול לשטחים הפלסטיניים הכבושים הדמיה 3 ממדים של נגעים בעורקים של אינטימה עכברי. הוא מייצג מראש ניכר על שיטות 2-ממדיות שהן בדרך כלל עבודה אינטנסיבית ולא ביעילות מייצגות סך נפח נגעים. השטחים הכבושים הוא יחסית מהירים, נוח ולא הרסני. התפתחויות חדשות בניתוח תמונה מבטיחות להגדיל את הכח ואת השירות של הטכניקה נוספת.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תעודת סטודנט מאוניברסיטת אדינבורו (NSK) וקרנגי הנאמנות (LL; תכנית Dryerre הנרי) ומימון מקרן הלב הבריטי (PWFH, BRW, DJW; RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) וWellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08,314 / ת / 07 / ת). המחברים מודים לתמיכה בעבודתם הניתנת על ידי המרכז במימון BHF של הפרס הצטיינות במחקר למרכז ללב וכלי דם למדע.
המחברים מודים במיוחד לעצה מהפרוף Masataka Sata (אוניברסיטת טוקושימה) וד"ר איגור Chersehnev (בקבוצת ד"ר Ernane 'רייס בהר סיני בית הספר לרפואה) על הקמתה של המודלים כירורגית של נגעי ייצור neointimal. הסרטון שהופק והופץ על ידי Sata et al. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) היה שימושי במיוחד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Microscope | Zeiss, Germany | OPMI Pico i | |
| Anesthetic Machine | Vet Tech, UK | ||
| Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
| Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
| Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
| Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
| Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
| Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
| Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
| Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, UK | 15000-01 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools, UK | 11251-35 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools, UK | 11370-31 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools, UK | 13008-12 | |
| Bulldog clips | Fine Science Tools, UK | 18050-35 | |
| Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | ||
| Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | ||
| Computer | Dell Inc, UK | ||
| Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
| DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
| NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
| CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
| Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapor, liquid |
| Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
| Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | 0.3 mg/ml | |
| 1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10 ml ampoule |
| EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | ||
| Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
| Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 250,000 Units |
| Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
| Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
| Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
| Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
| Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
| Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
| Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |
References
- Luis, A. J.
- Ross, R.
- Deuse, T. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J Vis Ex. (31), (2009).
- McAteer, M. A. Quantification and 3D reconstruction of atherosclerotic plaque components in apolipoprotein E knockout mice using ex vivo high-resolution MRI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 2384-2390 (2004).
- Martinez, H. G. Microscopic Computed Tomography-Based Virtual Histology for Visualization and Morphometry of Atherosclerosis in Diabetic Apolipoprotein E Mutant Mice. Circulation. 120, 821-822 (2009).
- Langheinrich, A. C. Atherosclerotic Lesions at Micro CT: Feasibility for Analysis of Coronary Artery Wall in Autopsy Specimens. Radiology. 231, 675-681 (2004).
- Ambrosi, C. M. Virtual histology of the human heart using optical coherence tomography. J Biomed Opt. 14, 054002 (2009).
- Ku, G. Photoacoustic microscopy with 2-micron transverse resolution. J Biomed Opt. 15, 021302 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Sharpe, J.
- Kirkby, N. S. Quantitative 3-Dimensional Imaging of Murine Neointimal and Atherosclerotic Lesions by Optical Projection Tomography. PloS ONE. 6 (2), e16906 (2011).
- Roque, M. Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid, accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 335-342 (2000).
- Sata, M. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32, 2097-2104 (2000).
- Richards-Kortum, R., Sevick-Muraca, E. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis. Annu Rev Phys Chem. 47, 555-606 (1996).
- Kirkby, N. S. Non-endothelial cell endothelin-B receptors limit neointima formation following vascular injury. Cardiovascular Research. 95, 19-28 (2012).
- Kipari, T., et al. 11-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 deficiency in bone marrow-derived cells reduces atherosclerosis. FASEB J. 27 (4), 1519-1531 (2013).
- Mackinnon, A. C. Inhibition of galectin-3 reduces atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Glycobiology. 23 (6), 654-663 (2013).
- Kumar, A., Lindner, V. Remodeling with neointima formation in the mouse carotid artery after cessation of blood flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 2238-2244 (1997).
- Walls, J. R. Correction of artefacts in optical projection tomography. Phys Med Biol. 50, 4645-4665 (2005).
- Walls, J. R. Resolution improvement in emission optical projection tomography. Phys Med Biol. 52, 2775-2790 (2007).
- Bucher, D. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100, 135-143 (2000).
- Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat Methods. 4, 31-33 (2007).
