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जनरेशन और चूहे में धमनी घावों की 3-आयामी Quantitation ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी का प्रयोग

Published: May 26, 2015 doi: 10.3791/50627
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1University/ BHF Centre for Cardiovascular Science, University of Edinburgh, The Queen's Medical Research Institute

Abstract

उपयुक्त पशु मॉडल में पीढ़ी और नाड़ी घावों का विश्लेषण घाव गठन के रोगजनन और उपन्यास के उपचारों की कार्रवाई पर महत्वपूर्ण जानकारी पैदा करने, हृदय रोग में अनुसंधान का एक आधार है। Atherosclerosis के की आशंका वाले चूहों, घाव प्रेरण की शल्य चिकित्सा पद्धतियों, और आहार संशोधन का प्रयोग नाटकीय रूप से बीमारी के विकास और नए उपचार के संभावित कि योगदान करने के तंत्र की समझ में सुधार हुआ है।

माइल्ड, घावों का विश्लेषण 2-आयामी ऊतकीय तकनीक का उपयोग कर पूर्व vivo किया जाता है। यह लेख धमनी घावों के 3 आयामी quantitation के लिए ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी (ऑप्ट) के आवेदन का वर्णन है। इस तकनीक के गैर विनाशकारी है, यह मानक ऊतकीय और immunohistochemical विश्लेषण करने के लिए एक सहायक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Neointimal घावों माउस और्विक कला का तार-प्रविष्टि या बंधाव द्वारा प्रेरित किया गयाअथेरोस्लेरोटिक घावों whilst के ery ApoE की कमी चूहों के लिए एक मेदार्बुदजनक आहार के प्रशासन द्वारा उत्पन्न किया गया।

घावों पूरक ऊतकीय और immunohistochemical विश्लेषण के बाद autofluorescent उत्सर्जन का ऑप्ट इमेजिंग का उपयोग कर जांच की गई। अंतर्निहित संवहनी दीवार से स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित घावों चुनते हैं। घाव आकार घाव मात्रा और अधिक से अधिक पार के अनुभागीय क्षेत्र की गणना, सक्रिय करने के planimetry का उपयोग कर 2-आयामी वर्गों में गणना की गई। ऑप्ट का उपयोग कर डेटा उत्पन्न तकनीक की सटीकता और विश्लेषण के पारंपरिक तरीकों के लिए (बजाय वैकल्पिक तुलना में) एक पूरक के रूप में अपनी क्षमता की पुष्टि, ऊतक विज्ञान का उपयोग कर प्राप्त माप के साथ संगत कर रहे थे।

इस काम अथेरोस्लेरोटिक और neointimal घावों इमेजिंग के लिए चुनते हैं की क्षमता को दर्शाता है। यह संवहनी remodeling के दिनचर्या 3-आयामी मात्रा का ठहराव के लिए एक तेजी से, बहुत आवश्यक पूर्व vivo तकनीक प्रदान करता है।

Introduction

धमनी घावों के गठन के हृदय रोग 1 के साथ जुड़े उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के लिए केंद्रीय है। घाव गठन चोट 2 धमनियों को एक निरंकुश भड़काऊ प्रतिक्रिया की वजह से हो जाता है। Restenotic घावों तेजी (स्टेंट आरोपण के बाद, उदाहरण के लिए) तीव्र यांत्रिक क्षति निम्नलिखित विकसित जबकि atherosclerotic घावों धमनियों की दीवार को पुरानी चोट के जवाब में धीरे धीरे के रूप में। धमनी घावों के विकास में योगदान तंत्र है कि अक्सर प्रासंगिक आनुवंशिक जोड़तोड़ 1 के साथ संयोजन में, उपयुक्त पशु मॉडल के उपयोग से काफी स्पष्ट किया गया है।

इस में vivo और पूर्व vivo का पता लगाने और छोटे जानवरों में घावों के विश्लेषण के लिए तरीकों में सुधार के विकास के साथ बदल रहा है, हालांकि घाव आकार और संरचना का विश्लेषण प्रतिष्ठित (पूर्व vivo, 2-आयामी ऊतक विज्ञान पर भारी निर्भर है <समर्थन> 3)। धमनी घावों के histological विश्लेषण श्रम गहन, समय लगता है और 3 आयामी संरचना की सीमित जानकारी प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, घाव बोझ सामान्यतः एक घाव के पार के अनुभागीय क्षेत्र को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया है (या तो बेतरतीब ढंग से चयनित स्थलों पर या अधिकतम रोड़ा की साइट पर)। इस समग्र घाव बोझ का एक अधूरा विश्लेषण प्रदान करता है। 3-आयामी इमेजिंग तकनीक इस समस्या का समाधान संभव है प्रदान करता है, लेकिन आश्चर्यजनक रूप से कुछ उपयुक्त दृष्टिकोण वर्णित किया गया है पूरे माउंट। यह चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) 4 और एक्स-रे गणना टोमोग्राफी (सीटी) 5 के लिए एकल फोटॉन confocal माइक्रोस्कोपी के लिए बहुत बड़ी है, लेकिन बहुत छोटे हैं जो माउस धमनियों का आकार करने के लिए मुख्य रूप से की वजह से हो सकता है। चूहों में अथेरोस्लेरोटिक घावों के अध्ययन के लिए पूर्व vivo एमआरआई के आवेदन और सूक्ष्म सीटी वे भी अपेक्षाकृत बड़ी धमनियों में, सीमित संकल्प प्रस्ताव पता चलता है। यह करने के लिए जोड़ा गया है, अपेक्षाकृत लंबे अधिग्रहण समय की आवश्यकताथ्रूपुट सीमा (और स्कैनिंग लागत में वृद्धि) 4,6।

(जैसे ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी 3,7 और फोटो ध्वनिक टोमोग्राफी 8) के रूप में नई ऑप्टिकल इमेजिंग तौर तरीकों का विकास murine धमनियों में घावों की इमेजिंग में सुधार के लिए ज्यादा क्षमता प्रदान करता है। इसी प्रकार के संभावित माउस भ्रूण का विश्लेषण अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था, जो ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी (ऑप्ट) द्वारा दिखाया गया है। ऑप्ट व्यास 9 में ~ 0.3-10 मिमी से लेकर छवि के नमूनों के लिए डिजाइन किया गया था। ट्रांसमिशन इमेजिंग अनेक रंगों दृश्य प्रकाश के लिए एक अर्ध-पारदर्शी नमूना की अस्पष्टता को रिकॉर्ड करता है और शारीरिक संरचनाओं की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंतर्जात से विशिष्ट तरंग दैर्ध्य (जैसे, कोलेजन, elastin) और नमूने में बहिर्जात fluorophores पर उत्तेजना निम्नलिखित प्रकाश का उत्सर्जन रिकॉर्ड इमेजिंग के उत्सर्जन। अलग ऊतक घटकों के प्रकार और autofluorescent प्रजातियों के घनत्व में अलग कर सकते हैं के बाद से यह भी (संरचनात्मक जानकारी प्रदान कर सकते हैंवर्तमान)। इसके अलावा, immunoreactivity या जीन की अभिव्यक्ति का वितरण उचित फ्लोरोसेंट जांच 10 के उपयोग के साथ निर्धारित किया जा सकता है। या तो इमेजिंग मोड (पारेषण या उत्सर्जन) के लिए, प्रकाश नमूना घूमता है (0.9 डिग्री वेतन वृद्धि पर आमतौर पर 400 चित्र) के रूप में चलने का छवि पर कब्जा करने की अनुमति के लिए एक प्रभारी युग्मित डिवाइस के लिए ध्यान केंद्रित किया है। ये (जैसे एक शंकु कलन विधि का उपयोग फ़िल्टर्ड वापस प्रक्षेपण () या चलने का पुनर्निर्माण के रूप में) मानक tomographic पुनर्निर्माण के तरीकों की मात्रा की गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

पहले से Kirkby एट अल। 11 में वर्णित के रूप में इस वीडियो अथेरोस्लेरोटिक और neointimal घावों की, तेजी से मात्रात्मक और लागत प्रभावी 3-आयामी विश्लेषण के लिए चुनते हैं की हमारी उपन्यास आवेदन को दर्शाता है। तकनीक तीन आमतौर पर इस्तेमाल किया मॉडल में घाव आकार को बढ़ाता के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया था: (मैं) और्विक धमनी तार-चोट; Apolipoprotei (ii) और्विक धमनी बंधाव, और (iii) आहार प्रेरित है atherosclerosisएन ई की कमी (ApoE - / -) चूहों।

Protocol

माउस और्विक धमनी में Neointimal घावों के 1. सर्जिकल प्रेरण

  1. जानवरों का उपयोग प्रयोगों राष्ट्रीय और संस्थागत नैतिकता आवश्यकताओं के अनुसार किया जाना चाहिए। सभी सर्जरी उपयुक्त सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए। Neointimal घावों की प्रेरण रोक एट अल। 12 और SATA एट अल। 13 से वर्णित तकनीक का एक संशोधन का उपयोग कर हासिल की है।
  2. पुरुष C57BL6 / जम्मू चूहों का वजन (आयु 10-12 सप्ताह, वजन 25-30 ग्राम) तो एक प्रेरण कक्ष में 4-5 isoflurane% देने से चतनाशून्य। संज्ञाहरण प्रेरित किया गया है, 37 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक गर्म चटाई करने के लिए माउस को हस्तांतरण। एक मुखौटा के माध्यम से isoflurane (2-3%) के प्रशासन के लिए आगे बढ़ें।
  3. संज्ञाहरण की एक उचित स्तर (पैर की अंगुली चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी) प्रेरित किया गया है, buprenorphine के प्रशासन द्वारा एनाल्जेसिक कवर प्रदान (0.1 मिलीग्राम / किग्रा -1)। फिर एक लापरवाह स्थिति में एक माउस जगहछोड़ दिया hindlimb के उदर सतह दाढ़ी चाहते हैं।
  4. घुटने की चक्की धमनी और पेट की दीवार के साथ विभाजन के बीच, और्विक तंत्रिका से और्विक धमनी और शिरा को अलग-थलग करने के लिए कुंद विच्छेदन का उपयोग करें, ऊपरी hindlimb की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए एक चीरा और। / वी lignocaine डब्ल्यू 1% का उपयोग करने की आवश्यकता के रूप में घाव की सिंचाई।
  5. (घुटने की चक्की धमनी के साथ तुरंत शाखा से नीचे) (पेट की दीवार के पास) और बाहर का समीपस्थ और्विक धमनी और रक्त के प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए नस के आसपास अस्थायी संयुक्ताक्षर (6/0 Mersilk) रखें। तब (और्विक धमनी के साथ शाखा के लिए बाहर का लगभग 2-5 मिमी के लिए) घुटने की चक्की धमनी को अलग करने और distally ligate। घुटने की चक्की धमनी के नीचे एक दूसरे, खुल संयुक्ताक्षर रखें।
  6. समीपस्थ अस्थायी संयुक्ताक्षर के लिए दबाव लागू करने से खून बह रहा रोकने और्विक धमनी के साथ शाखा को तुरंत बाहर का घुटने की चक्की धमनी में एक छोटा सा चीरा (arteriotomy), बनाते हैं। एक सीधे अग्रिम, 0.014 "guidewire उछलापेट की दीवार की दिशा में और्विक धमनी साथ 1-1.5 सेमी और 30 सेकंड (चित्रा 1 ए) के लिए जगह में छोड़ दें।
  7. Guidewire निकालें और उस प्रयोजन के लिए रखा संयुक्ताक्षर का उपयोग कर, और और्विक धमनी रोक देना नहीं, देखभाल करने के arteriotomy से ऊपर घुटने की चक्की धमनी ligate।
    नोट: बंधाव प्रेरित चोट के लिए। Intraluminal चोट के बिना Neointimal remodeling के और्विक या घुटने की चक्की धमनियों (चित्रा 1 बी और 1 सी) ligating द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। इस का पालन 1.1-1.5 कदमों को प्राप्त करने के लिए। हालांकि, arteriotomy नहीं बनाते हैं, लेकिन या तो (i) (कदम 1.6 से बचने) घुटने की चक्की धमनी के साथ शाखा बिंदु पर और्विक धमनी या (ii) ligate आम और्विक धमनी को तुरंत बाहर का घुटने की चक्की धमनी ligate। तो फिर कदम 1.8 के साथ आगे बढ़ना।
  8. अस्थायी संयुक्ताक्षर निकालें एक असंतत बाहरी सिवनी (5/0 Mersilk) के साथ घाव को बंद करने और EMLA क्रीम (2.5% lidocaine, 2.5% prilocaine) लागू होते हैं। जानवरों फिर से करने की अनुमति दें चेतना (आमतौर पर 5-10 मिनट) हासिल है और वे अपने पिंजरे के आसपास स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ रहे हैं सुनिश्चित (मामूली लंगड़ापन प्रभावित पैर में स्पष्ट हो सकता है लेकिन इस सर्जरी के बाद पहले 2-3 दिनों से अधिक का समाधान करना चाहिए) कमरे धारण करने के लिए लौटने से पहले। चूहे सर्जरी के बाद अकेले रखे होने की जरूरत नहीं है।
  9. जानवरों अप करने के लिए 3 महीने के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दें। छोटे घावों 7 दिनों के तार की चोट के बाद ~ प्रकट करने के लिए शुरू हो जाएगा और 21-28 दिनों ~ के बाद एक स्थिर अधिकतम आकार तक पहुंच जाएगा।

अपोलीपोप्रोटीन ई में atherosclerotic घावों की 2. प्रेरण - / - चूहे

  1. 12 हफ्तों के लिए पुरुष, 6 सप्ताह (घर में पैदा) पुराने ApoE-अशक्त चूहों को, पश्चिमी आहार (रिसर्च आहार, संयुक्त राज्य अमेरिका में 0.2% कोलेस्ट्रॉल) प्रशासन।
  2. Atherosclerotic घावों अक्सर महाधमनी चाप और उसके प्रमुख शाखाओं (चित्रा 2) के सकल निरीक्षण पर दिखाई दे रहे हैं।

3. विश्लेषण धमनी घावों का उपयोग कर ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी (ऑप्ट)

NT "> नोट: murine ऊरु धमनियों और महाधमनी चाप नमूनों में घावों की ऑप्ट छवियों एक ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमग्राफ़ का उपयोग कर प्राप्त किया गया।

  1. 10% तटस्थ बफर formalin द्वारा पीछा heparinised (10 यू / एमएल) फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग कर, टर्मिनल संज्ञाहरण (80 मिलीग्राम / किग्रा सोडियम pentobarbital) के तहत transcardiac छिड़काव निर्धारण और exsanguination द्वारा चूहों euthanize।
  2. के रूप में उपयुक्त ऊरु धमनियों या महाधमनी चाप और उसके प्रमुख शाखाओं (छोड़ दिया मन्या धमनी, बाएं अवजत्रुकी धमनी, प्रगंडशीर्षी ट्रंक), अलग, और बाहरी पेरी-adventitial सामग्री को हटा दें। जब तक जरूरत 70% इथेनॉल में भंडारण से पहले 10% बफर formalin हे / एन में पोस्ट-ठीक,।
  3. 1.5% कम पिघलने बिंदु agarose में शामिल करें धमनियों, वाटमान 113 वी पेपर के माध्यम से पहले से फ़िल्टर। एक चुंबकीय चुनते करने के लिए प्रत्येक नमूना अटैच पर्वत की उस के साथ लाइन में पोत अक्ष के साथ cyanoacrylate चिपकने वाला के साथ माउंट। एक शंक्वाकार आकार करने के लिए अतिरिक्त agarose ट्रिम। कम से कम 12 घंटे के लिए 100% मेथनॉल में निर्जलीकरण।
  4. सीबेंजाइल अल्कोहल और लोबान बेंजोएट का एक मिश्रण में (12-24 घंटे के लिए) विसर्जन द्वारा लेअर वाहिकाओं (1: 2 वी / वी)।
  5. एक calibrated टोमग्राफ़ में मंजूरी दे दी नमूने रखें। 1024 X 1024 के लिए प्रस्ताव तैयार है, और ब्याज के पूरे क्षेत्र में देखा जा करने की अनुमति देता है कि एक ऑप्टिकल बढ़ाई निर्धारित करते हैं। ऑप्ट मात्रा Z अक्ष ही संकल्प को खंगाला है isotropic है (यानी, 1024 X 1024 एक्स 1024), voxel आकार ~ 200 माइक्रोन। पुनर्निर्माण कलाकृतियों होने की संभावना के रूप में वहाँ इस संकल्प की एक से अधिक अनुमान प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। यह उज्ज्वल क्षेत्र, संचरण चैनल में देखने के क्षेत्र के केंद्र में अपनी ही धुरी पर घूमता है इतना है कि नमूना स्थिति को समायोजित करें।
  6. GFP1 फिल्टर उत्सर्जन चैनल (उत्तेजना फिल्टर 425 एनएम बैंड पास एनएम 40 के साथ; उत्सर्जन फिल्टर: 475 एनएम लंबे पास) में, नमूना ध्यान केंद्रित करने और परिणामस्वरूप छवि के गतिशील रेंज को अधिकतम करने के लिए जोखिम समय समायोजित (अधिक संतृप्ति बचने के लिए)। एक 0.9 डिग्री रोटेशन कदम के साथ, केवल GFP1 उत्सर्जन चैनल में पोत स्कैन करें। </ ली>
  7. पूरा होने पर, DataViewer सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डाटा अधिग्रहण की गुणवत्ता की पुष्टि करें। स्कैनर से नमूना निकालें।
  8. प्रसंस्करण के रूप में सामान्य मोम आयल करने से पहले बाद में histological विश्लेषण,> 24 घंटा के लिए 100% मेथनॉल में जगह नमूना अनुमति देने के लिए।

4. छवि के पुनर्निर्माण और विश्लेषण

फ़िल्टर्ड वापस प्रक्षेपण से tomographic पुनः निर्माण NRecon सॉफ्टवेयर या इसी तरह का उपयोग किया जाता है। पुनर्निर्माण बैचों में, पहुंच से बाहर किया जा सकता है।

  1. Misalignment के लिए मुआवजा और छवि तीव्रता के स्तर का समायोजन करके छवि गुणवत्ता में सुधार।
  2. DataViewer सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि के पुनर्निर्माण की गुणवत्ता की जाँच करें।
  3. विश्लेषण के लिए नमूने के उपयुक्त खंड को पहचानें। Luminal आयाम दर्ज हो रहे हैं जहाजों के बीच लगातार इस लंबाई रखें।
  4. स्वयं हर 50 पुन: निर्माण किया पार वर्गों में 1 के लिए उपयुक्त सीमा अनुरेखण द्वारा घावों की रूपरेखा को परिभाषित करें।
  5. कंप्यूटर जनित अंतर्वेशन सही हैं सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक interleaved पार अनुभाग की जाँच करें। जहां आवश्यक मैन्युअल सीमा समायोजित करें।
  6. केवल घाव का चयन किया जाता है, ताकि ग्रे-स्तर दहलीज सेट और माप डेटा निर्यात।
  7. प्रत्येक स्कैन के लिए, घाव युक्त ब्याज की एक ऊर्ध्वाधर क्षेत्र को परिभाषित करने और मीडिया और neointima के बीच सीमा का पता लगाने (अर्थात।, आंतरिक लोचदार पटल की स्थिति) हर 50 वें स्कैन लाइन के लिए। सॉफ्टवेयर में interleaved लाइनों स्कैन के लिए intima / मीडिया सीमाओं अमान्य तरीके से संशोधन, और सत्यापित करने और जहां आवश्यक फिट सही। इसके अलावा खंड इस सफेद पिक्सल neointima का प्रतिनिधित्व करते हैं और काले पिक्सल पेटेंट लुमेन का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें एक द्विआधारी छवि सेट का उत्पादन करने के लिए एक मैन्युअल रूप से परिभाषित तीव्रता दहलीज करने के लिए तीन आयामी मात्रा में परिभाषित किया।
  8. माप लिया शामिल हैं: कुल घाव मात्रा (वस्तु की मात्रा), luminal मात्रा (कुल मात्रा - वस्तु मात्रा) और घाव की और क्रॉस-संप्रदाय लुमेन वितरणअध्ययन किया पोत का अक्षीय लंबाई के साथ एक पेशेवर क्षेत्र।

Representative Results

स्वस्थ (unlesioned) murine ऊरु धमनियों की प्रारंभिक स्कैनिंग (एन = 5) कि ट्रांसमिशन इमेजिंग उपयोगी छवियों प्रदान नहीं किया प्रदर्शन किया। उत्सर्जित संकेत का कोई absorbance के / बिखरने के रूप में वहाँ इस संचरण imaging.However के लिए भी पारदर्शी (बजाय भी अपारदर्शी) बनने को मंजूरी दे दी धमनियों का परिणाम था, इस उत्सर्जन इमेजिंग के लिए फायदेमंद है। इसके विपरीत, ऊरु धमनियों (14 elastin के लिए एक 410 एनएम उत्तेजना चोटी के साथ संगत) 405-445 एनएम पर उत्तेजना निम्नलिखित सबसे बड़ा संकेत के साथ, उत्सर्जन चैनल में जोरदार autofluoresce। इन छवियों से खंगाला 2-आयामी स्लाइस स्पष्ट रूप से लुमेन और बाह्यकंचुक और लुमेन से मीडिया को प्रतिष्ठित किया।

Murine ऊरु धमनियों में 28 दिनों के तार के बाद (एन = 6) या ligation- (एन = 5) प्रेरित चोट neointimal उमड़ना गैर tomographic उत्सर्जन अनुमानों में स्पष्ट किया गया (चित्रा 3) काटा। खंगाला 2-dimens मेंional स्लाइस, गाढ़ा neointimal घावों उनके कमजोर उत्सर्जन (3B चित्रा और चित्रा एस 1) द्वारा मीडिया से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

अथेरोस्लेरोटिक चूहों से ऑप्ट उत्सर्जन महाधमनी चाप के पूरे माउंट नमूनों की छवियों और उसके प्रमुख शाखाओं (एन = 8) प्रत्याशित संरचनात्मक वितरण के साथ की पहचान के घावों (अर्थात।, महाधमनी चाप, प्रगंडशीर्षी धमनी, और मूल के कम वक्रता में छोड़ दिया मन्या और बाएं अवजत्रुकी धमनियों (चित्रा -4 ए)। के पार के अनुभागीय छवियों इन (चित्रा 4 बी, S2 और S3 आंकड़े) आम तौर पर विलक्षण घावों थे और आसानी से मीडिया और लुमेन से विख्यात थे कि संकेत दिया।

ऑप्ट निम्नलिखित histological विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण धमनियों सफलतापूर्वक ऊतकीय (संयुक्त राज्य अमेरिका Trichrome, Picr का उपयोग कर दाग वर्गों के साथ, ऑप्ट के गैर विनाशकारी प्रकृति की पुष्टि कीosirius लाल) और immunohistochemical (α-SMA, मैक-2) तकनीक (आंकड़े -3 सी और 4C)।

ऑप्ट का उपयोग कर घाव आकार का मापन वही धमनी 11 से लिया histological वर्गों की छवि विश्लेषण का उपयोग कर प्राप्त माप के अनुरूप होना दिखाया गया है।

तार (2 आर = 0.92) और बंधाव प्रेरित (आर 2 = 0.89) neointimal घावों और atherosclerotic सजीले टुकड़े (आर = 0.85 2) के लिए चुनते हैं और रेखीय प्रतिगमन द्वारा बारीकी से सहसंबद्ध ऊतक विज्ञान के द्वारा प्राप्त घाव क्षेत्र की Planimetric माप। ऑप्ट के एक महत्वपूर्ण लाभ यह 3-आयामी विश्लेषण सक्षम करने की क्षमता है। इस तकनीक के साथ घावों का बड़ा मात्रा का ठहराव विकसित करके, हम तार में घाव संस्करणों रिकॉर्ड करने में सक्षम थे (0.1100 ± 0.0091 मिमी 3; एन = 6) और बंधाव घायल ऊरु धमनियों (0.0200 ± 0.0089 मिमी 3; एन = 5) और भी अथेरोस्लेरोटिक प्रगंडशीर्षी धमनियों में (0।180 ± 0.018 मिमी 3; एन = 8)। माप अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य (क्रमशः भिन्नता 5.4% के गुणांकों, 11.4% और 4.8%, एन = 4) थे घाव के सभी प्रकार के लिए। तार-घायल वाहिकाओं में Neointimal घावों पूर्व से प्रवृत्त क्षति का अधिक से अधिक डिग्री के साथ संगत बंधाव द्वारा उत्पादित उन लोगों की तुलना में बड़ा (पी <0.0001) थे।

उत्पन्न डेटा भी (आंकड़े देखने के एस 1 - S3) के घाव प्रोफाइल (चित्रा 5) के रूप में व्यक्त किया और गतिशील, गुणात्मक मूल्यांकन के लिए गाया जा सकता है। यह दृष्टिकोण स्पष्ट रूप से अलग चोट प्रक्रियाओं के जवाब में घाव के गठन की हद तक का प्रदर्शन किया और घायल वाहिकाओं में घाव गठन के असमान वितरण पर प्रकाश डाला।

चित्र 1
चित्रा 1: murine और्विक धमनी में घाव के गठन की शुरुआत के लिए तरीके & #।160; घुटने की चक्की धमनी में एक arteriotomy के माध्यम से, और्विक धमनी में guidewire एंजियोप्लास्टी की (ए) प्रतिगामी प्रविष्टि चोट और अन्तःचूचुक को हटाने के खिंचाव के जवाब में घाव निर्माण कराता है। रक्त प्रवाह पोत के घायल खंड पर फिर से स्थापित है। Intraluminal खिंचाव, अनाच्छादन या रक्त के प्रवाह को रुकावट के अभाव में (बी) Neointimal प्रसार और्विक या और्विक धमनी द्विभाजन को तुरंत बाहर का घुटने की चक्की धमनी या तो ligating द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। (सी) एक और अधिक गंभीर गैर denuding चोट / प्रसार प्रतिक्रिया आम और्विक धमनी की शाखा बिंदु के पार और्विक और घुटने की चक्की धमनियों दोनों ligating द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। इस तकनीक को भी और्विक धमनी के बाहर भाग में रक्त के प्रवाह को अवरुद्ध कर देगा।

चित्र 2
चित्रा 2:। 12 सप्ताह महाधमनी चाप और उसके प्रमुख शाखाओं में घाव बयान की एक विशेषता पैटर्न के विकास के लिए माउस महाधमनी चाप में मेदार्बुद की विशेषता बयान का खतरा Atherosclerosis (Apolipopotein ई चूहों की कमी) एक उच्च कोलेस्ट्रॉल पश्चिमी आहार खिलाया। प्रदर्शन के रूप में, घावों महाधमनी चाप, प्रगंडशीर्षी धमनी में, एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सकल निरीक्षण के द्वारा, दृश्य (तीर) कर रहे हैं, और बाईं मन्या धमनी और बाएं अवजत्रुकी धमनी की Ostia में।

चित्र तीन
चित्रा 3:। बाईं और्विक धमनी के बंधाव निम्नलिखित घाव गठन (स्पष्टता बढ़ाने के लिए उलटा - अंधेरे क्षेत्रों मजबूत उत्सर्जन के अनुरूप) (ए) गैर tomographic प्रतिदीप्ति उत्सर्जन छवियों intimal उमड़ना की पहचान की अनुमति (लाल arrowheविज्ञापन)। (बी) के विशिष्ट संवहनी क्षेत्रों और लुमेन tomographic पुनर्निर्माण में प्रतिष्ठित किया जा सकता है। (सी) histological विश्लेषण (संयुक्त राज्य अमेरिका Trichrome) ऑप्ट का उपयोग कर प्राप्त छवियों के साथ स्पष्ट समानता पर जोर दिया। (एसी) में स्केल सलाखों 200 मिमी हैं। Kirkby एट अल। (एसी) में 11 स्केल सलाखों से अनुकूलित 200 माइक्रोन कर रहे हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4:। महाधमनी चाप की (गहरा क्षेत्रों इस प्रकार की स्पष्टता में सुधार लाने, मजबूत उत्सर्जन से संकेत मिलता है कि इतना उल्टे) atherosclerosis के होने का खतरा चूहों के महाधमनी चाप में मेदार्बुद की इमेजिंग (ए) मेदार्बुद (लाल तीर), आसानी से गैर tomographic छवियों में स्पष्ट है साइटों में (देखें चित्र 2) प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत निरीक्षण के द्वारा मेदार्बुद असर के रूप में भविष्यवाणी की। (बी) के वितरण का यह पैटर्न tomographic करोड़ में इसकी पुष्टि की हैओएसएस वर्गों। (सी) Histological (संयुक्त राज्य अमेरिका Trichrome) धुंधला घाव विश्लेषण के लिए पारंपरिक तरीकों के साथ चुनते के पूरक प्रकृति कई अलग अलग एंटीबॉडी पर जोर देती का उपयोग कर करीब tomographic वर्गों के साथ समानता, और immunohistochemistry पता चलता है। (ए बी) में स्केल सलाखों 1 मिमी हैं; (सी) में स्केल बार 250 माइक्रोन है। आरएसए, सही अवजत्रुकी धमनी; आरसीए, सही मन्या धमनी; एलसीए, बाईं मन्या धमनी; एलएसए, अवजत्रुकी धमनी छोड़ दिया; बीसीए, प्रगंडशीर्षी धमनी; आओ, महाधमनी आरोही; डीएओ, महाधमनी उतरते। Kirkby एट अल से अनुकूलित। 11

चित्रा 5
चित्रा 5: घाव और लुमेन प्रोफाइल के विश्लेषण धमनी चोट के विभिन्न तरीकों के जवाब में neointimal प्रसार की हद तक बदलती इंगित करता है ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी घाव की अनुमति देता है और लुमेन अनुभागीय measuremen पार।टीएस और्विक धमनी साथ दूरी के खिलाफ साजिश रची जा सके। यह स्पष्ट रूप से कुल बंधाव (सी) बंधाव के स्थल पर पूरा रोड़ा पैदा करता है लेकिन घाव धमनी के साथ अब तक का विस्तार नहीं करता है, जबकि एक रिहाई धमनी (ए), आंशिक बंधाव (बी) के साथ तुलना में, छोटे, अपेक्षाकृत असतत घावों पैदा करता है, यह दर्शाता है कि । Intraluminal तार चोट (डी) लगभग पूरी तरह से नमूना के बाहर का भाग occludes और धमनी की स्कैन खंड की पूरी लंबाई के साथ फैली हुई है कि एक घाव पैदा करता है। Kirkby एट अल से अनुकूलित। 11

चित्रा एस 1। बंधाव चोट के बाद एक माउस और्विक धमनी से प्राप्त पार के अनुभागीय छवियों की एनिमेटेड पुनर्निर्माण। एनिमेटेड छवि के इस प्रकार दोनों गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयोगी है। एनीमेशन धमनी के बाहर वर्गों के लिए समीपस्थ से एक पूर्णावरोधक neointima के क्रमिक विकास के कदम के रूप में, डिस्कलुमेन और मीडिया से ernible, आसानी से स्पष्ट है। पक्ष शाखाओं को आसानी से पहचाना जा सकता है और स्पष्ट luminal रोड़ा और आकार में घाव के रूप में बढ़ धमनी की जावक remodeling है। बंधाव की साइट पर पहुँच जाता है एक बार पोत का पूरा रोड़ा होता है। Kirkby एट अल से अनुकूलित। 11

।। (- पहली बार दिखाई देता है, जो बाएं) और उतरते (दाएं) महाधमनी चित्रा S2 के एक atherosclerosis के प्रवण माउस से एक महाधमनी चाप के पार के अनुभागीय छवियों की एनिमेटेड पुनर्निर्माण एनीमेशन आरोही के पार वर्गों के साथ शुरू होती है। छोटे घावों महाधमनी चाप की दिशा में स्कैन चाल के रूप में आरोही महाधमनी में दिखाई देते हैं। चित्र तो प्रगंडशीर्षी (बाएं), छोड़ दिया मन्या (मध्य) और बाएं अवजत्रुकी (दाएं) धमनियों की भारी lesioned Ostia दिखाने के लिए मेहराब के माध्यम से चलते हैं। स्कैन इन शाखाओं के साथ distally कदम के रूप में घावों धीरे-धीरे subc में पहले, कम करने और गायब हो जाते हैंlavian धमनी, तो मन्या में और अंत में प्रगंडशीर्षी धमनी में। दिलचस्प है, इस पोत के रूप में प्रवाह विभक्त पर प्रगंडशीर्षी धमनी चालों में घाव सही मन्या और सही अवजत्रुकी धमनियों में बिताते हैं। Kirkby एट अल से अनुकूलित। 11

चित्रा S3। एनिमेटेड, एक atherosclerosis के प्रवण माउस से एक महाधमनी चाप की मात्रा-प्रदान की छवि। ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी एक अपोलीपोप्रोटीन ई की कमी माउस का महाधमनी चाप में घाव वितरण का प्रदर्शन इस मामले में, 3-आयामी चित्र की पीढ़ी की अनुमति देता है। (ए) मेदार्बुद (बाएं मन्या और अवजत्रुकी धमनियों की Ostia में और महाधमनी चाप की कम वक्रता में, प्रगंडशीर्षी धमनी भर में) की उम्मीद साइटों में मौजूद है। मूल छवि पर आरोपित जब पार वर्गों असर (बी) के विभाजन और (लाल रंग में दिखाया गया है) घाव का प्रतिपादन सजीले टुकड़े के वितरण पर जोर दिया।Kirkby एट अल से अनुकूलित। 11

Discussion

3-आयामी विश्लेषण की जगह या अभी भी धमनी घाव गठन की जांच के बहुमत कि पिन 2-आयामी ऊतकीय तकनीक को जोड़ने के लिए काफी क्षमता है। यहाँ अपनाएं (शायद इस तकनीक का उपयोग सफलतापूर्वक विश्लेषण किया जा सकता है कि छोटी से छोटी वाहिकाओं का प्रतिनिधित्व murine ऊरु धमनियों के साथ) छोटे murine धमनियों में दिखाया गया है। यह भी, तथापि, धमनियों (और घावों) छोटे से मध्यम आकार के मानव जहाजों सहित अन्य प्रजातियों से साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त है; हमारे समूह सफलतापूर्वक खरगोश महाधमनी में घावों का विश्लेषण करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया गया है (Bezuidenhout एट अल;। अप्रकाशित)। ऑप्ट पारंपरिक ऊतक विज्ञान के साथ तुलना में तेजी से विश्लेषण और वृद्धि की संरचनात्मक जानकारी का वादा किया है और histological और immunohistochemical दोनों तकनीकों का उपयोग करते हुए नमूने के बाद के विश्लेषण को रोकने नहीं का लाभ दिया है।

ऑप्ट का उपयोग कर उत्पादन छवियों घाव गठन की साइटों दिखा, संरचनात्मक विस्तार दियाऔर इन क्षेत्रों में घावों का आकार। इन जांच में इस्तेमाल किया धमनियों इसलिए (शायद रोटेशन misalignment, अधूरा समाशोधन, प्रतिबिंब / अपवर्तन agarose के कोने पर और ध्यान केंद्रित समस्याओं से उत्पन्न) कलाकृतियों द्वारा एक निश्चित डिग्री करने के लिए बिगड़ा हुआ है तकनीक और छवि गुणवत्ता के लिए संकल्प की सीमा को शायद बंद कर रहे हैं । इस के बावजूद, आवश्यक विवरण (यानी, पोत दीवार की परतों) discernable बनी रहती है और इसलिए तकनीक अलग-अलग परतों की मात्रा का ठहराव के लिए अत्यंत उपयोगी है। दरअसल, छवियों नमूने में चयनित स्थलों पर पोत की पट्टिका असर वर्गों में घाव और luminal मात्रा का माप, साथ ही घाव के पार के अनुभागीय क्षेत्रों और लुमेन प्रदान करने के लिए तेजी से और reproducibly मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। बड़े (महाधमनी) और मध्यम आकार की (और्विक, मन्या, अवजत्रुकी) murine धमनियों - उन आम तौर पर चूहों में अथेरोस्लेरोटिक और neotintimal घाव गठन के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया - सफलतापूर्वक थेइस पद्धति का उपयोग का विश्लेषण किया। दरअसल हम अब अथेरोस्लेरोटिक और neointimal घाव आकार पर औषधीय हस्तक्षेप और आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए चुनते इस्तेमाल किया है। संवहनी अन्तःचूचुक से endothelin बी रिसेप्टर के चुनिंदा विलोपन 15 नहीं किया था, जबकि उदाहरण के लिए, endothelin रिसेप्टर नाकाबंदी neointimal घाव गठन ही बदल दिया। Atherosclerosis के होने का खतरा चूहों में, आनुवंशिक एंजाइमों का विलोपन 11β-HSD1 16 या galectin 3 17 अथेरोस्लेरोटिक घावों के आकार को कम करने के लिए दिखाया गया था।

घाव मात्रा की मात्रा चुनते के लिए एक स्पष्ट लाभ है। यह आमतौर पर ऊतकीय तरीकों के साथ प्राप्त किया जाता है की तुलना में एक धमनी 4 में कुल घाव बोझ का एक और अधिक सूचनात्मक संकेत देता है। पूरे घाव का विश्लेषण कर रहा एक पोत के असतत वर्गों के विश्लेषण के लिए चुना जाता है जब अनिवार्य रूप से घटित होगा कि चयन पूर्वाग्रह और त्रुटि कम कर देता है। अनुदैर्ध्य घाव प्रोफाइल के उत्पादन ऑप्ट के आगे ताकत हैचोट 13,16 के विभिन्न प्रकार (चित्रा 5) द्वारा प्रेरित घावों की तुलना द्वारा पर बल दिया। उदाहरण के लिए, पूरा बंधाव और तार-प्रविष्टि दोनों femero-घुटने की चक्की विभाजन के करीब लगभग कुल रोड़ा प्रेरित किया। वायर चोट, धमनी बंधाव द्वारा प्रेरित घावों तेजी से आकार में कम और गायब हो जाते हैं, जबकि स्कैन किया खंड की पूरी लंबाई के साथ बढ़ाया है कि हालांकि, उत्पादन घावों। यह पैटर्न एंजियोप्लास्टी guidewire की प्रविष्टि की वजह से चोट की बड़ी हद के अनुरूप है। Histological वर्गों का उपयोग करते हुए इसी तरह के परिणाम उत्पन्न महंगा है, समय लेने वाली और श्रम गहन।

ऑप्ट के फायदे (हम नियमित तौर पर प्रति दिन 20 जहाजों स्कैन किया है) यह उत्पादन छवियों की गुणवत्ता और उसके रिश्तेदार की गति और सादगी शामिल हैं। छवि गुणवत्ता 3-आयामी चित्र पैदा करने के लिए अन्य तरीकों के लिए, बेहतर है, या कम से कम तुलनीय प्रकट होता पूर्व vivo, वाई (जैसे एमआरआई और सूक्ष्म सीटी के रूप में)एट अपनाएं (हमारे अध्ययन / छवि आमतौर पर 1-2sec था के लिए एकीकरण के समय) और कम खर्चीला है कम स्कैन टाइम्स की आवश्यकता है। नमूना तैयार कई दिनों में फैली हुई है लेकिन बहुत कम श्रम, बर्तन बैचों में तैयार किया जा सकता है की आवश्यकता है, और डेटा एक सत्र में हासिल किया जा सकता है। नतीजतन, throughput के उच्च और स्कैनर की विस्तारित उपयोग की आवश्यकता नहीं है। महत्वपूर्ण बात है, चुनते के गैर विनाशकारी प्रकृति यह immunohistochemical परीक्षा के लिए ब्याज की साइटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है इसका मतलब है; इस प्रकार काटने की मात्रा को कम करने और आवश्यक धुंधला हो जाना। यह उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड के विकास धमनियों में घावों इस आकार का बड़ा मात्रा का ठहराव के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करेगा कि संभव है, लेकिन लेखकों के लिए इस आवेदन दिखाना है कि किसी भी प्रकाशन से अनजान हैं।

शायद हैरानगी, चुनते में छवि गुणवत्ता (जाहिर है, केवल छोटे नमूने पर प्रदर्शन किया जा सकता है) सूक्ष्म तकनीक से हीन है। प्रस्तावित शोधन reconstructio करने के लिएडेटा के एन छवि गुणवत्ता 19,20 के भविष्य के सुधार की अनुमति देकर इस सीमा को संबोधित कर सकते हैं। एक अन्य पद्धति चिंता ऊतक प्रसंस्करण नमूना की विशेषताओं को बदल देता है। उदाहरण के लिए क्लीयरिंग एजेंट की lipophilic प्रकृति, बेंजाइल अल्कोहल / बेंजाइल बेंजोएट (Babb), ज़ाहिर है, निर्जलीकरण और लिपिड हटाने के कदम भी की एक विशेषता है, हालांकि पूर्व निर्जलीकरण (संकोचन का कारण हो सकता है, जबकि अथेरोस्लेरोटिक घावों से लिपिड को दूर करने की संभावना है पैराफिन मोम में एम्बेड करने के लिए नमूना तैयार करने)। Babb (जैसे ग्लिसरॉल 21) यह आकृति विज्ञान में केवल छोटे परिवर्तन का कारण बनता है हाइड्रोफिलिक समाशोधन एजेंटों के साथ तुलना में, के रूप में इस जांच में इस्तेमाल किया गया था।

विशेष रूप से महत्वपूर्ण कोशिकाओं के 3 आयामी व्यवस्था पर नज़र रखने और धमनी remodeling में शामिल कारकों संकेत के संबंध में ऑप्ट के आगे विकास और शोधन के लिए कई संभावनाएं हैं। इस तरह के एक है जो धमनियों के ऊतकों की मजबूत autofluorescence,संरचनात्मक छवियों की पीढ़ी में एन लाभ, विरंजन 22 के मौजूदा तरीकों से बुझती नहीं है और आरएनए और प्रोटीन वितरण पैटर्न का आकलन करने के लिए फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग को सीमित कर सकते हैं। ट्रांसमिशन इमेजिंग द्वारा कल्पना वर्णमिति जांच के उपयोग (जैसे β-galactosidase) इस सीमा को पार कर सकता है।

समाप्त करने के लिए, चुनते murine धमनियों की intima में घावों की 3 आयामी इमेजिंग के लिए महान क्षमता है। यह आम तौर पर गहन परिश्रम कर रहे हैं और प्रभावी ढंग से कुल घाव मात्रा का प्रतिनिधित्व नहीं करते जो 2-आयामी तरीकों पर एक काफी पहले का प्रतिनिधित्व करता है। ऑप्ट अपेक्षाकृत तेज, सुविधाजनक और गैर विनाशकारी है। छवि विश्लेषण में नए घटनाक्रम के आगे तकनीक की शक्ति और उपयोगिता को बढ़ाने के लिए वादा करता हूँ।

Acknowledgments

(; हेनरी Dryerre योजना एलएल) और धन ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन से (PWFH, BRW, DJW, इस काम के एडिनबर्ग विश्वविद्यालय (एन एस) और कार्नेगी ट्रस्ट से Studentships द्वारा समर्थित किया गया आरजी / 05/008; पी जी / 05/007; पीजी / 08/068/25461) और वेलकम ट्रस्ट (JRS, BRW, DJW, 08,314 / जेड / 07 / जेड)। लेखकों कार्डियोवास्कुलर विज्ञान के लिए केंद्र सरकार को अनुसंधान उत्कृष्टता पुरस्कार के BHF वित्त पोषित केंद्र द्वारा प्रदान की उनके काम के लिए समर्थन करने के लिए आभारी हैं।

लेखकों neointimal घाव उत्पादन की शल्य चिकित्सा के मॉडल की स्थापना पर प्रोफेसर Masataka SATA (Tokushima विश्वविद्यालय) और (मेडिसिन के माउंट सिनाई स्कूल में डॉ Ernane रेइस 'समूह में) डा इगोर Chersehnev से सलाह के लिए विशेष रूप से आभारी हैं। वीडियो का उत्पादन और SATA एट अल द्वारा उपलब्ध कराया। (http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) विशेष रूप से उपयोगी था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Operating Microscope Zeiss, Germany OPMI Pico i
Anesthetic Machine Vet Tech, UK
Fluovac Harvard Apparatus UK 340387
Fluosorber Harvard Apparatus UK 340415
Bead Sterilizer Fine Science Tools, UK 1800-45
Heated Mat Fine Sceince Tools, UK 21061-10
Balance Mettler Toledo MS1602S PB1502 or equivalent
Sutures Ethicon, UK 5/0 Mersilk
Guidewire Cook Inc, USA C-PMS-251 0.014”
Suture Silk Fine Science Tools, UK 18020-60 6/0 Mersilk
Surgical Tools Fine Science Tools, UK 14058-09 Toughcut Iris scissors
Cohan-Vannas Spring Scissors Fine Science Tools, UK 15000-01
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools, UK 11251-35
Moria Iris Forceps Fine Science Tools, UK 11370-31
Halsted-Mosquito Hemostat Fine Science Tools, UK 13008-12
Bulldog clips Fine Science Tools, UK 18050-35
Bioptonics 3001 Tomograph  Bioptonics, UK
Magnetic OPT Mount Bioptonics, UK
Computer Dell Inc, UK
Peristaltic pump Gilson F117606 Minipuls 3
DataViewer software  Skyscan, Belgium v.1.4.4
NRecon software  Skyscan, Belgium v.1.6.8
CTan software Skyscan, Belgium v.1.12
Isoflurane Merial Animal Health Ltd, UK AP/Drugs/220/96 100% Inhalation vapor, liquid
Medical Oxygen BOC Medical, UK UN1072
Vetergesic Alstoe Animal Health Ltd, UK 0.3 mg/ml
1% Lignocaine Hamlen Pharmaceuticals, UK LD1010 10 ml ampoule
EMLA Cream Astra Zeneca, UK
Sodium Pentobarbital Ceva Animal Health Ltd, UK
Western Diet Research Diets, USA D12079B 0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline Sigma UK P4417
Heparin (Mucous) Leo Laboratories, UK PL0043/003GR 250,000 Units
Neutral Buffered Formalin Sigma, UK HT501128 10%
Ethanol VWR BDH Prolabo, UK 20821.33 Absolute AnalaR 
Agarose Invitrogen, UK 16020050 Low melting point
Filter Paper GE Healthcare, UK 113v Whatman
Cyanoacrylate adhesive Henkel, UK 4304 Loctite
Benzyl alcohol Sigma, UK B6630
Benzyl benzoate Sigma, UK 402834
Methanol VWR BDH Prolabo, UK 20856.296 100%

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References

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चिकित्सा अंक 99 neointima माउस और्विक धमनी atherosclerosis प्रगंडशीर्षी ट्रंक ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी
जनरेशन और चूहे में धमनी घावों की 3-आयामी Quantitation ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी का प्रयोग
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Kirkby, N. S., Low, L., Wu, J., Miller, E., Seckl, J. R., Walker, B. R., Webb, D. J., Hadoke, P. W. F. Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography. J. Vis. Exp. (99), e50627, doi:10.3791/50627 (2015).

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