Geração e quantificação 3-Dimensional de Arterial lesões em ratos por meio de tomografia óptica de Projeção

Abstract

A geração e análise de lesões vasculares em modelos animais adequados é uma pedra angular da investigação sobre as doenças cardiovasculares, gerando informações importantes sobre a patogênese da formação da lesão e da ação de novas terapias. A utilização de ratos propensos a aterosclerose, métodos cirúrgicos de indução da lesão, a modificação da dieta e melhorou dramaticamente a compreensão dos mecanismos que contribuem para o desenvolvimento da doença e o potencial de novos tratamentos.

Classicamente, a análise de lesões é realizada ex vivo utilizando técnicas histológicas 2-dimensional. Este artigo descreve a aplicação de tomografia de projecção óptica (OPT) a quantificação 3-dimensional de lesões arteriais. Como esta técnica é não destrutivo, que pode ser usado como um adjuvante para análises histológicas e imuno-histoquímicas convencionais.

Neointimais lesões foram induzidas por fio-inserção ou ligadura da arte femoral ratoery, enquanto as lesões ateroscleróticas foram gerados através da administração de uma dieta aterogénica para apoE deficientes.

As lesões foram examinadas usando OPT imagem de emissão autofluorescent seguido por histológico complementares e análise imunohistoquímica. OPT lesões claramente distinguida da parede vascular subjacente. O tamanho da lesão foi calculada em secções 2-dimensionais por planimetria, que permite o cálculo do volume da lesão e área de secção transversal máxima. Os dados gerados usando OPT foram consistentes com as medições obtidas usando histologia, confirmando a precisão da técnica e o seu potencial como um complemento (em vez de alternativa) aos métodos tradicionais de análise.

Este trabalho demonstra o potencial da OPT para a imagem latente lesões ateroscleróticas e neointimais. Ele fornece um rápido, muito necessária técnica ex vivo para a quantificação 3-dimensional rotina de remodelamento vascular.

Introduction

A formação de lesões arteriais é fundamental para a elevada morbidade e mortalidade associadas com ^uma doença cardiovascular. Formação da lesão é considerada para ser causada por uma resposta inflamatória sem restrições à lesão arterial ^2. As lesões ateroscleróticas formam lentamente em resposta à lesão crônica da parede arterial enquanto lesões reestenóticas desenvolver-se rapidamente na sequência de avaria mecânica aguda (por exemplo, após implante de stent). Os mecanismos que contribuem para o desenvolvimento de lesões arteriais foram consideravelmente clarificada através da utilização de modelos animais apropriados, muitas vezes em combinação com manipulações genéticas relevantes ^1.

Análise do tamanho e composição lesão tem classicamente dependia fortemente do ex vivo, histologia 2-dimensional (embora esta está a mudar com o desenvolvimento de métodos melhorados para a in vivo e ex vivo de detecção e análise de lesões em animais pequenos <sup> 3). A análise histológica de lesões arteriais é trabalhoso, demorado e fornece informação limitada da estrutura 3-dimensional. Por exemplo, a carga da lesão é comumente avaliado por medição da área da secção transversal de uma lesão (ou em sítios seleccionados aleatoriamente ou no local da oclusão máxima). Isso fornece uma análise incompleta de carga global lesão. Todo-mount tecnologia de imagem 3-dimensional fornece uma possível solução para este problema, mas surpreendentemente poucas possibilidades de utilização têm sido descritas. Isto pode ser devido principalmente ao tamanho das artérias do rato que são demasiado grandes para microscopia confocal de fotão único mas muito pequeno para imagiologia por ressonância magnética (MRI) ⁴ e de raios-X de tomografia computadorizada (TC) ^5. Aplicação do ex vivo MRI e micro CT para o estudo de lesões ateroscleróticas em ratinhos sugerem que eles oferecem uma resolução limitada, mesmo em relativamente grandes artérias. Adicionado a isto, os tempos relativamente longos de aquisição necessárialimitar o rendimento (e aumentar os custos de digitalização) ^4,6.

Desenvolvimento de novas modalidades de imagem óptico (como tomografia de coerência óptica ^3,7 e foto-acústica tomografia ⁸⁾ oferece muito potencial para melhorar a imagem das lesões nas artérias murino. Potencial semelhante é mostrado por tomografia de projecção óptica (OPT) a qual foi desenvolvida para permitir a análise de embriões de ratinho. OPT foi concebido para amostras da imagem que variam de 0,3-10 ~ ⁹ mm de diâmetro. Transmissão de imagem grava a opacidade de uma amostra semi-translúcido para a luz visível policromática e, pode ser utilizado para a identificação de estruturas anatómicas. Emissão de registos de imagem de emissão de luz em comprimentos de onda de excitação seguinte específicos de endógena (por exemplo, colagénio, elastina) e fluoróforos exógenas na amostra. Isto também pode fornecer informação anatómica (uma vez que diferentes componentes do tecido pode diferir no tipo e densidade de espécies autofluorescentespresente). Além disso, a distribuição da imunorreactividade ou expressão do gene pode ser determinada com a utilização de sondas fluorescentes adequados ^10. Para qualquer um dos modos de imagem (transmissão ou emissão), a luz é focalizada em um dispositivo de carga acoplada para permitir a captura de imagem iterativo conforme a rotação da amostra (geralmente 400 imagens em incrementos de 0,9 °). Estes podem ser utilizados para o cálculo do volume por métodos de reconstrução tomográficos padrão (como filtrou-projecção traseira (usando um algoritmo de cone) ou reconstrução iterativo).

Este vídeo demonstra a nossa nova aplicação de OPT para análise 3-dimensional rápida, quantificável e rentável de lesões ateroscleróticas e neointimais, como descrito anteriormente em Kirkby et al. ^11. A técnica mostrou ser adequado para quantificar o tamanho da lesão em três modelos comumente utilizados: (i) da artéria femoral fio-de lesões; (Ii) ligação da artéria femoral, e (iii) a aterosclerose induzida pela dieta em apolipoprotein E deficiente (ApoE ^{- / -)} ratinhos.

Protocol

1. Indução cirúrgica de neoíntima lesões na artéria femoral do rato

1. Experiências com animais deve ser realizado em conformidade com os requisitos de ética nacionais e institucionais. Todos cirurgia deve ser realizada utilizando técnica asséptica. Indução da lesão neointimal é conseguido utilizando uma modificação da técnica descrita por Roque et al. ¹² e Sata et ai. ^13.
2. Pesar masculino C57BL6 / J ratinhos (Idade 10-12 semanas; peso de 25-30 g), em seguida, anestesiar entregando 4-5% de isoflurano em uma câmara de indução. Uma vez que a anestesia foi induzida, transferir o rato para uma esteira aquecida para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Continuar a administração de isoflurano (2-3%) por meio de uma máscara.
3. Uma vez que um nível apropriado de anestesia foi induzida (falta de resposta aos pés pitada), proporcionar uma cobertura analgésico, por administração de buprenorfina (0,1 mg / ^kg-1). Em seguida, coloque o mouse em uma posição um supinod raspar a superfície ventral do membro posterior esquerdo.
4. Realizar uma incisão para expor a musculatura do membro posterior e superior, entre a bifurcação com a artéria popliteal e da parede abdominal, usar uma dissecção romba para isolar a artéria femoral e da veia femoral do nervo. Lavar a ferida como necessário usando 1% w / v de lidocaína.
5. Coloque proximal (perto da parede abdominal) e distal (imediatamente abaixo do ramo com a artéria poplítea) ligaduras temporários (6/0) Mersilk ao redor da artéria femoral e da veia para controlar o fluxo de sangue. Em seguida, isolar a artéria poplítea (aproximadamente 2-5 mm distal para o ramo com a artéria femoral) e ligar para distal. Coloque uma segunda ligadura, desatado por baixo da artéria poplítea.
6. Fazer uma pequena incisão (arteriotomia) na artéria popliteal, imediatamente distal ao ramo com a artéria femoral, evitando a hemorragia através da aplicação de pressão à ligadura temporária proximal. Avança uma linha reta, surgiram 0.014 "fio-guia1-1,5 cm ao longo da artéria femoral na direcção da parede abdominal e deixar no lugar durante 30 segundos (Figura 1A).
7. Retirar o fio-guia e ligar a artéria poplítea acima da arteriotomia, usando a ligadura colocada para o efeito, e tomando cuidado para não obstruir a artéria femoral.
   NOTA: Para lesão induzida por ligadura. Remodelação sem lesão neointimal intraluminal pode ser induzida por ligação de as artérias femorais ou popliteal (Figura 1B e 1C). Para conseguir isso siga os passos de 1,1-1,5. No entanto, não cometa o arteriotomy mas (evitando passo 1.6) ou (i) ligar a artéria poplítea imediatamente distal à artéria femoral ou (ii) ligar a artéria femoral comum no ponto de ramificação com a artéria poplítea. Em seguida, prossiga com o passo 1.8.
8. Remover ligaduras temporários, fechar a ferida com uma sutura externa descontínua (5/0 Mersilk) e aplicar o creme EMLA (2,5% lidocaína, prilocaína 2,5%). Permitir que os animais re ganhar consciência (normalmente 5-10 min) e garantir que eles estão se movendo livremente em torno de sua gaiola (ligeira claudicação pode ser evidente na perna afetada, mas isso deve resolver ao longo dos primeiros 2-3 dias após a cirurgia) antes de voltar para os quartos segurando. Os ratos não têm que ser alojados individualmente após a cirurgia.
9. Que os animais possam recuperar para até 3 meses. Pequenas lesões começam a aparecer ~ 7 dias após a lesão de arame e vai chegar a um tamanho máximo estável após ~ 21-28 dias.

2. A indução de lesões ateroscleróticas na apolipoproteína E ^{- / -} Mice

1. Administrar dieta ocidental (0,2% de colesterol; Research Diets, EUA) para sexo masculino, 6 semanas de idade camundongos ApoE-null (criados em casa) durante 12 semanas.
2. As lesões ateroscleróticas são frequentemente visíveis na inspecção bruto do arco aórtico e seus ramos principais (Figura 2).

3. Analisar Arterial lesões usando Projeção Optical Tomography (OPT)

nt "> NOTA: As imagens OPT de lesões em artérias femorais de murino e amostras do arco aórtico foram obtidos usando um tomógrafo projeção óptica.

1. Eutanásia ratos por perfusão transcardíaca fixação e exsanguinação sob anestesia terminal (80 mg / Kg de pentobarbital de sódio), usando heparinizado (10 U / ml), salino tamponado com fosfato (PBS) seguido de 10% de formalina tamponada neutra.
2. Isolar artérias femorais ou o arco aórtico e seus principais ramos (artéria carótida esquerda, artéria subclávia esquerda, tronco braquiocefálico), conforme o caso, e remover o material peri-adventícia estranho. Pós-correcção em 10% de formalina tamponada S / N, antes de armazenamento em etanol a 70% até serem necessários.
3. Incorporar artérias em 1,5% baixo ponto de fusão agarose, pré-filtrada através de Whatman 113 V papel. Fixe cada amostra a um OPT montagem magnética com adesivo de cianoacrilato com o eixo da embarcação em linha com a do monte. Corte o excesso de agarose para uma forma cónica. Desidratar em metanol a 100% durante pelo menos 12 h.
4. Cvasos lear por imersão (durante 12-24 h) em uma mistura de álcool benzílico e benzoato de benzilo (1: 2 v / v).
5. Coloque amostras desmatadas em um tomógrafo calibrado. Defina a resolução de 1024 x 1024, e determinar uma ampliação ótica que permite que toda a área de interesse para ser visto. Volume de OPT isotrópico é o eixo z é reconstruída para a mesma resolução (isto é, 1,024 x 1,024 x 1,024), a dimensão do voxel ~ 200 uM. Isto pode representar uma sobre-estimativa de resolução, como não são susceptíveis de ser artefactos de reconstrução. Ajustar a posição da amostra de modo a rodar sobre o seu próprio eixo no centro do campo de vista no campo luminoso, o canal de transmissão.
6. No canal de emissão GFP1 filtro (filtro de excitação de 425 nm com 40 nm passa-banda, filtro de emissão: 475 nm passe longo), concentrar-se a amostra e ajustar o tempo de exposição para maximizar a gama dinâmica da imagem resultante (evitar o excesso de saturação). Digitalizar o navio em apenas o canal de emissão GFP1, com um passo de 0,9 ° de rotação. </ Li>
7. Em conclusão, confirme qualidade de aquisição de dados usando o software DataViewer. Remover espécime do scanner.
8. Para permitir a análise histológica subsequente, local da amostra em 100% de metanol para> 24 horas antes do processamento de cera de parafina como normal.

4. Imagem e Análise da Reconstrução

Tomográfica re-construção por filtrada retro-projeção é realizada utilizando software NRecon ou similar. Reconstruções pode ser realizada sem vigilância, em lotes.

1. Melhorar a qualidade de imagem, compensando desalinhamento e ajustar os níveis de intensidade de imagem.
2. Verifique a qualidade de reconstrução de imagem usando o software DataViewer.
3. Identificar a seção apropriada da amostra para análise. Mantenha este comprimento consistente entre navios se as dimensões da luz devem ser registados.
4. Definir o contorno das lesões por rastreio manualmente a borda adequada para 1 em cada 50 re-construídas secções transversais.
5. Verifique cada seção transversal intercaladas para garantir interpolações gerados por computador estão corretas. Ajustar manualmente a fronteira, quando necessário.
6. Definir o limite de nível de cinza de forma que apenas a lesão é selecionado e exportar os dados de medição.
7. Para cada verificação, definir uma região vertical de interesse contendo a lesão e traçar a fronteira entre a mídia e neointima (ie., A posição da lâmina elástica interna) para cada 50 ^th varredura-line. Interpolar fronteiras íntima / mídia para as linhas de varredura intercalados em software, e verificar e corrigir o ajuste quando necessário. Além disso segmento este definido o volume tridimensional a um limiar de intensidade manualmente definido para produzir um conjunto imagem binária em que pixels brancos representam neointima e pixels pretos representam luz patente.
8. Medidas tomadas incluem: volume total da lesão (volume de objeto), o volume luminal (total de volume - volume de objeto) ea distribuição de lesão e lúmen cross-seitaional área ao longo do comprimento axial do vaso estudado.

Representative Results

Varrimento preliminar da saudáveis ​​(não lesionado) artérias femorais de murino (n = 5), demonstrou que a imagem de transmissão não fornecer imagens úteis. Isto era uma consequência das artérias compensados ​​ficarem demasiado transparente (ao invés de também opaco) para imaging.However transmissão, isso é benéfico para a imagiologia de emissão como não há nenhuma absorvância / espalhamento do sinal emitido. Em contraste, as artérias femorais autofluoresce fortemente no canal de emissão, com o maior sinal de excitação a seguinte 405-445 nm (consistente com um pico de excitação de 410 nm para a elastina ^14). 2 fatias tridimensionais reconstruídos a partir dessas imagens distinguidas claramente a mídia do lúmen e adventícia e lúmen.

Em artérias femorais murinos colhidas 28 dias após arame (n = 6) ou ligation- (n = 5) lesão induzida espessamento neointimal foi evidente em projecções de emissões não tomográficos (Figura 3A). Em reconstruídos 2-dimensfatias ional, lesões neointimais concêntricos poderia ser distinguido a partir do suporte por sua emissão mais fraca (Figura 3B e Figura S1).

Imagens de emissão OPT de amostras inteiras de montagem do arco aórtico e seus principais ramos de camundongos aterosclerótica (n = 8) lesões identificadas com a distribuição anatômica antecipada (ie., Na pequena curvatura do arco aórtico, a artéria inominada, e as origens da carótida esquerda e artéria subclávia esquerda (Figura 4A). imagens transversais indicou que estes eram lesões tipicamente excêntricos e foram prontamente distinguidos dos meios de comunicação e lúmen (Figura 4B, as Figuras S2 e S3).

Artérias de processamento para análise histológica seguinte OPT confirmou a natureza não-destrutiva de OPT, com cortes corados com sucesso usando histológico (Estados Unidos Trichrome, PicrOsirius vermelho) e imuno-histoquímica (α-SMA, Mac-2) técnicas (Figuras 3C e 4C).

A medição do tamanho da lesão utilizando TPO demonstrou ser consistente com as medições obtidas usando análise de imagem de secções histológicas colhidas no mesmo artéria ^11.

Planimetricos medições de área de lesão obtidos por OPT e histologia correlacionada de perto por regressão linear para o arame (R ² = 0,92) e induzida por ligadura (R ² = 0,89) lesões neointimais e placas ateroscleróticas (R ² = 0,85). Um benefício importante de OPT é a sua capacidade para permitir a análise a 3 dimensões. Através do desenvolvimento de quantificação volumétrica de lesões com esta técnica, nós fomos capazes de gravar volumes de lesão no arame (0,1100 ± 0,0091 milímetro ^3; n = 6) e artérias femorais com lesão de ligação (0,0200 ± 0,0089 milímetro ^3; n = 5) e também em artérias ateroscleróticas braquiocefálicas (0.180 ± 0,018 milímetros ^3; n = 8). As medições foram altamente reprodutíveis (coeficiente de variação de 5,4%, 11,4% e 4,8%, respectivamente, n = 4) de todos os tipos de lesão. Lesões neointimal em vasos de feridas fios eram maiores (p <0,0001) do que os produzidos por ligação, de acordo com o grau mais elevado de danos infligidos pelo antigo.

Os dados gerados também pode ser expressa como perfis de lesão (Figura 5) e processado para avaliação dinâmica e qualitativa (ver figuras S1 - S3). Esta abordagem demonstrou claramente a extensão da formação da lesão, em resposta a diferentes procedimentos de ferimento e em destaque a distribuição desigual da formação da lesão em vasos lesionados.

Figura 1: Os métodos para iniciar a formação da lesão na artéria femoral murino & #.160, (A) inserção retrógrada de uma angioplastia fio guia no interior da artéria femoral, por meio de uma arteriotomia da artéria popliteal estimula a formação da lesão em resposta ao estiramento lesão e remoção do endotélio. O fluxo sanguíneo é restabelecida através da secção lesada do navio. (B) proliferação da neoíntima na ausência de estiramento intraluminal, desnudação ou interrupção do fluxo de sangue pode ser induzida por ligação quer a femoral ou da artéria popliteal imediatamente distai em relação à bifurcação da artéria femoral. (C) Um desnudando não resposta mais grave lesão / proliferação pode ser induzida através da ligação de ambas as artérias femorais e poplíteos através do ponto de ramificação da artéria femoral comum. Esta técnica também vai bloquear o fluxo de sangue na porção distai da artéria femoral.

Figura 2:. Característica deposição do ateroma no arco da aorta do rato A aterosclerose propenso (Apolipopotein E ratinhos deficientes) alimentados com uma dieta ocidental níveis elevados de colesterol durante 12 semanas desenvolver um padrão característico de deposição lesão no arco aórtico e seus ramos principais. Como demonstrado, as lesões são visíveis (setas), por inspecção bruto sob um microscópio de dissecação, no arco aórtico, a artéria inominada, e no óstio da artéria carótida esquerda e a artéria subclávia esquerda.

Figura 3:. A formação da lesão seguinte ligadura da artéria femoral esquerda (A) imagens de emissão de fluorescência não-tomográficos (invertido para aumentar a clareza - regiões escuras correspondem a emissão mais forte) permitir a identificação do espessamento da íntima (arrowhe vermelhoPublicidades). (B) regiões distintas vasculares e do lúmen podem ser distinguidos em reconstruções tomográficas. (C) A análise histológica (Estados Unidos trichrome) enfatiza a clara semelhança com imagens obtidas utilizando OPT. Barras de escala em (AC) estão a 200 mm. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹ barras de escala em (AC) são 200 m.

Figura 4:. De imagem do ateroma no arco da aorta de ratos propensos a aterosclerose (A) de ateroma (setas vermelhas) é prontamente aparente em imagens não-tomográficos (invertido de modo que as regiões mais escuras indicam emissão mais forte, melhorando assim a clareza) do arco aórtico, em locais como previsto ateroma-bearing por inspeção sob microscopia de luz (veja a Figura 2). (B) Este padrão de distribuição é confirmada no cr tomográficaOSS-seções. (C) histológico (Estados Unidos trichrome) coloração demonstra uma estreita semelhança com cortes tomográficos, e imuno-histoquímica utilizando vários anticorpos diferentes enfatiza a natureza complementar de OPT com abordagens tradicionais para a análise da lesão. Barras de escala em (A-B) são um milímetro; A barra de escala em (C) é de 250 um. RSA, artéria subclávia direita; RCA, artéria carótida direita; LCA, artéria carótida esquerda; LSA, artéria subclávia esquerda; BCA, artéria inominada; AAo, aorta ascendente; Dão, aorta descendente. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

Figura 5: Análise de perfis de lesão e lúmen indica variando extensão da proliferação neointimal em resposta a diferentes métodos de lesão arterial tomografia projeção óptica permite lesão e lúmen atravessar measuremen seccionais.ts a ser registada em função distância ao longo da artéria femoral. Isto demonstra claramente que, em comparação com uma artéria não lesionado (A), a ligadura parcial (B) produz lesões pequenas, relativamente discretas, ao passo que a ligação total (C) produz oclusão completa no local de ligação, mas a lesão não se estende até ao longo da artéria . Lesão de arame intraluminal (D) produz uma lesão que tapa quase completamente a porção distai da amostra e se estende ao longo de todo o comprimento da secção da artéria digitalizada. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

Figura S1. Animadas reconstrução de imagens transversais obtidos a partir de uma artéria femoral do rato após lesão ligadura. Este tipo de imagem animada é útil tanto para análise qualitativa e quantitativa. À medida que a animação se move do proximal às secções distais da artéria do desenvolvimento gradual de uma neoíntima oclusiva, discoernible do lúmen e da mídia, é facilmente perceptível. Ramos laterais podem ser facilmente identificado e não existe oclusão luminal evidente e remodelação para fora da artéria com o aumento no tamanho das lesões. A oclusão completa da embarcação ocorre uma vez que o local de ligação é alcançada. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

.. Figura S2 reconstrução animadas de imagens transversais de um arco aórtico de um rato aterosclerose propensas A animação começa com secções transversais da ascendente (da esquerda - que aparece em primeiro lugar) e descendente (à direita) aorta. Pequenas lesões aparecem na aorta ascendente como as de verificação se move na direcção do arco aórtico. As imagens, em seguida, mover-se através do arco para mostrar os óstios fortemente lesionado do braquiocefálico (à esquerda), carótida esquerda (no meio) e subclávia esquerda (direita) artérias. Como a verificação se move distalmente ao longo desses ramos das lesões e reduzir gradualmente desaparecer, pela primeira vez no subcartéria Lavian, em seguida, na carótida e, finalmente, na artéria inominada. Curiosamente, a lesão nos movimentos artéria inominada para o divisor de fluxo como este navio se divide em artérias carótida direita e subclávia direita. Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

Figura S3. Animadas, imagem-rendido volume de um arco da aorta de um murganho propenso a aterosclerose. A tomografia de projecção óptica permite a geração de imagens 3-dimensionais, neste caso, demonstrando distribuição lesão no arco aórtico de um apolipoproteína E do rato deficiente. (A) ateroma está presente nos locais esperados (ao longo da artéria inominada, no óstio das artérias carótidas e subclávia esquerda e na curvatura menor do arco aórtico). (B) Segmentação e prestação de lesão (mostrado em vermelho) tendo secções transversais enfatiza a distribuição das placas quando sobreposta à imagem original.Adaptado de Kirkby et al. ¹¹

Discussion

Análise 3-dimensional tem um grande potencial para a substituição ou adição às técnicas histológicas 2-dimensionais que ainda sustentam a maioria das investigações de formação de lesão arterial. Aqui OPT é mostrado em pequenas artérias murinos (com artérias femorais murinos provavelmente representam os navios mais pequenos que podem ser analisadas com sucesso utilizando esta técnica). É, no entanto, também se podem utilizar com artérias (e lesões) a partir de outras espécies, incluindo as pequenas e médias vasos humanos de tamanho; o nosso grupo tem utilizado com sucesso a técnica de análise lesões em aorta de coelho (Bezuidenhout et ai;. não publicado). OPT promete uma análise mais rápida e uma maior informação estrutural em comparação com a histologia tradicional e tem a vantagem de não prevenir a posterior análise da amostra utilizando técnicas tanto histológicos e imuno-histoquímico.

As imagens produzidas utilizando OPT deu detalhes anatômicos, mostrando locais de formação de lesãoe o tamanho das lesões nestas áreas. As artérias utilizadas nestas investigações são, provavelmente, perto do limite de resolução para a técnica ea qualidade da imagem, portanto, é prejudicada a um certo grau por artefatos (provavelmente resultantes de desalinhamento rotação, compensação incompleta, reflexão / refração nos vértices de agarose e problemas de focagem) . Apesar disso, os detalhes necessários (isto é, camadas da parede do vaso) permanecem discernível e, por conseguinte, a técnica é extremamente útil para a quantificação de camadas individuais. Na verdade, as imagens pode ser quantificada de forma rápida e reprodutível para fornecer medições da lesão e do volume da luz em secções de placa de rolamento do navio, bem como áreas de secção transversal da lesão e da luz nos locais seleccionados na amostra. Grande (aorta) e médias (femoral, carótida, subclávia) artérias murino - os geralmente utilizados para a análise da formação da lesão aterosclerótica e neotintimal em ratos - foram com sucessoanalisados ​​usando este método. Na verdade, agora temos usado OPT para demonstrar o efeito de intervenções farmacológicas e manipulação genética em tamanho aterosclerótica e neointimal lesão. Por exemplo, o bloqueio do receptor da endotelina alterada enquanto que a formação da lesão da neointima eliminação selectiva do receptor da endotelina B a partir do endotélio vascular não ^15. Em ratos propensos a aterosclerose, eliminação genética das enzimas 11β-HSD1 ¹⁶ ou galectina 3 ¹⁷ foram mostrados para reduzir o tamanho das lesões ateroscleróticas.

Quantificação do volume de lesão é uma vantagem óbvia de OPT. Ele dá uma indicação mais informativo da carga total da lesão em uma artéria ⁴ do que é geralmente obtida com métodos histológicos. Analisando toda a lesão reduz o viés de seleção e erro que, inevitavelmente, ocorrer quando secções distintas de uma embarcação são escolhidos para análise. Produção de perfis longitudinais lesão é mais uma força de OPT, Enfatizada pela comparação das lesões induzidas por diferentes tipos de lesão ^13,16 (Figura 5). Por exemplo, tanto a ligadura completa e fio-inserção induzida oclusão quase total próximo à bifurcação femero-poplítea. Lesão de arame, lesões no entanto, produzidos que se estendiam ao longo de todo o comprimento da secção digitalizada, enquanto as lesões induzidas por ligadura arterial diminuiu rapidamente em tamanho e desaparecem. Este padrão é consistente com o maior grau de lesão provocada pela inserção do fio de guia de angioplastia. Gerando resultados semelhantes usando cortes histológicos é caro, consome tempo e trabalho intensivo.

As vantagens do OPT incluem a qualidade das imagens que produz e sua velocidade relativa e simplicidade (temos rotineiramente digitalizada 20 navios por dia). A qualidade de imagem é exibida superior, ou pelo menos comparável, a outros métodos para gerar imagens em 3 dimensões ex vivo (como ressonância magnética e tomografia microbiologia), yet OPT requer tempo de verificação mais curtos (tempo de integração para os nossos estudos foi tipicamente 1-2sec / imagem) e é menos caro. A preparação da amostra se estende ao longo de vários dias, mas requer pouco trabalho, os vasos pode ser preparada em lotes, e os dados podem ser adquiridos de uma sessão. Consequentemente, o rendimento é alto e não requer o uso prolongado do scanner. Importante, a natureza não-destrutiva de OPT significa que pode ser utilizado para identificar locais de interesse para análise imuno-histoquímica; reduzindo assim a quantidade de corte e coloração requerida. É possível que o desenvolvimento de ultra-sons de alta resolução irá proporcionar um método alternativo para a quantificação volumétrica de lesões em artérias deste tamanho, mas os autores não têm conhecimento de qualquer publicação que demonstram esta aplicação.

Talvez surpreendentemente, a qualidade da imagem em OPT é inferior a técnicas microscópicas (que pode, naturalmente, só podem ser realizados em amostras mais pequenas). Refinamentos propostos para Reconstruçãon de dados pode resolver esta limitação, permitindo a melhoria futura da qualidade da imagem ^19,20. Outra preocupação metodológica é que o processamento de tecidos altera características da amostra. Por exemplo, a natureza lipofílica do agente de limpeza, álcool benzílico / benzoato de benzilo (BABB), é susceptível de remover lípido de lesões ateroscleróticas, enquanto a desidratação antes podem causar encolhimento (apesar de, é claro, de desidratação e remoção de lípidos passos são também uma característica de a preparação da amostra para a incorporação em cera de parafina). BABB foi utilizado nesta investigação porque, em comparação com agentes de compensação hidrofílicos (por exemplo, glicerol ²¹⁾ que faz com que somente pequenas alterações na morfologia.

Existem várias possibilidades para um maior desenvolvimento e refinamento de OPT, nomeadamente em matéria de acompanhamento do arranjo 3-dimensional de células-chave e fatores envolvidos na remodelação arterial sinalização. A forte autofluorescência do tecido arterial, que é talvantagem n na geração de imagens anatómicas, não é extinta por métodos existentes de branqueamento ²² e pode restringir a utilização de sondas fluorescentes para avaliar padrões de RNA e proteína de distribuição. A utilização de sondas colorimétricos (por exemplo β-galactosidase) visualizadas por imagiologia de transmissão pode ultrapassar esta limitação.

Para concluir, OPT tem um grande potencial para geração de imagens em 3 dimensões das lesões na íntima das artérias murino. Ela representa um avanço considerável sobre os métodos 2-dimensionais que são geralmente de trabalho intensivo e não representam efectivamente o volume total da lesão. OPT é relativamente rápido, conveniente e não-destrutivos. Novos desenvolvimentos em análise de imagem prometem aumentar ainda mais o poder e utilidade da técnica.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operating Microscope	Zeiss, Germany		OPMI Pico i
Anesthetic Machine	Vet Tech, UK
Fluovac	Harvard Apparatus UK	340387
Fluosorber	Harvard Apparatus UK	340415
Bead Sterilizer	Fine Science Tools, UK	1800-45
Heated Mat	Fine Sceince Tools, UK	21061-10
Balance	Mettler Toledo	MS1602S	PB1502 or equivalent
Sutures	Ethicon, UK		5/0 Mersilk
Guidewire	Cook Inc, USA	C-PMS-251	0.014”
Suture Silk	Fine Science Tools, UK	18020-60	6/0 Mersilk
Surgical Tools	Fine Science Tools, UK	14058-09	Toughcut Iris scissors
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, UK	15000-01
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools, UK	11251-35
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools, UK	11370-31
Halsted-Mosquito Hemostat	Fine Science Tools, UK	13008-12
Bulldog clips	Fine Science Tools, UK	18050-35
Bioptonics 3001 Tomograph	Bioptonics, UK
Magnetic OPT Mount	Bioptonics, UK
Computer	Dell Inc, UK
Peristaltic pump	Gilson	F117606	Minipuls 3
DataViewer software	Skyscan, Belgium	v.1.4.4
NRecon software	Skyscan, Belgium	v.1.6.8
CTan software	Skyscan, Belgium	v.1.12
Isoflurane	Merial Animal Health Ltd, UK	AP/Drugs/220/96	100% Inhalation vapor, liquid
Medical Oxygen	BOC Medical, UK	UN1072
Vetergesic	Alstoe Animal Health Ltd, UK		0.3 mg/ml
1% Lignocaine	Hamlen Pharmaceuticals, UK	LD1010	10 ml ampoule
EMLA Cream	Astra Zeneca, UK
Sodium Pentobarbital	Ceva Animal Health Ltd, UK
Western Diet	Research Diets, USA	D12079B	0.2% cholesterol
Phosphate Buffered Saline	Sigma UK	P4417
Heparin (Mucous)	Leo Laboratories, UK	PL0043/003GR	250,000 Units
Neutral Buffered Formalin	Sigma, UK	HT501128	10%
Ethanol	VWR BDH Prolabo, UK	20821.33	Absolute AnalaR
Agarose	Invitrogen, UK	16020050	Low melting point
Filter Paper	GE Healthcare, UK	113v	Whatman
Cyanoacrylate adhesive	Henkel, UK	4304	Loctite
Benzyl alcohol	Sigma, UK	B6630
Benzyl benzoate	Sigma, UK	402834
Methanol	VWR BDH Prolabo, UK	20856.296	100%