Abstract
La generazione e l'analisi delle lesioni vascolari in modelli animali appropriati è una pietra miliare della ricerca sulle malattie cardiovascolari, generando importanti informazioni sulla patogenesi della formazione della lesione e l'azione di nuove terapie. L'uso di aterosclerosi inclini topi, metodi chirurgici di induzione della lesione, e modificazioni della dieta è migliorata notevolmente la comprensione dei meccanismi che contribuiscono allo sviluppo della malattia e il potenziale di nuovi trattamenti.
Classicamente, analisi delle lesioni viene effettuata ex vivo utilizzando tecniche istologiche 2-dimensionali. Questo articolo descrive l'applicazione della tomografia ottica di proiezione (OPT) per la quantificazione 3 dimensioni delle lesioni arteriose. Poiché questa tecnica è non distruttiva, può essere utilizzato in aggiunta ad analisi istologiche e immunoistochimiche standard.
Lesioni neointimale sono state indotte da filo-inserimento o legatura del mouse femorale arteery mentre lesioni aterosclerotiche sono stati generati dalla somministrazione di una dieta aterogenica a topi apoE-carente.
Le lesioni sono stati esaminati utilizzando OPT imaging emissione autofluorescenti seguita da istologica complementari e analisi immunoistochimica. OPT lesioni chiaramente distinti dalla parete vascolare sottostante. Dimensione della lesione è stato calcolato in sezioni 2-dimensionali utilizzando planimetria, consentendo calcolo del volume lesione e massima area della sezione trasversale. I dati generati usando OPT erano coerenti con misure ottenute con istologia, confermando l'accuratezza della tecnica e il suo potenziale come complemento (piuttosto che alternative) ai tradizionali metodi di analisi.
Questo lavoro dimostra il potenziale di OPT per l'imaging aterosclerotiche e neointimale lesioni. Esso fornisce un rapido, tanto necessario ex vivo tecnica per la routine quantificazione 3-dimensionale del rimodellamento vascolare.
Introduction
La formazione delle lesioni arteriose è centrale per la morbilità e la mortalità associata a malattie cardiovascolari 1. Formazione della lesione è considerata essere causata da una risposta infiammatoria illimitato arteriosa lesioni 2. Le lesioni aterosclerotiche si formano lentamente in risposta al danno cronico alla parete arteriosa mentre le lesioni restenotici sviluppano rapidamente dopo danni meccanici acuta (ad esempio, dopo l'impianto di stent). I meccanismi che contribuiscono allo sviluppo di lesioni arteriose sono stati chiariti considerevolmente l'uso di modelli animali, spesso in combinazione con relative manipolazioni genetiche 1.
Analisi della dimensione della lesione e la composizione ha classicamente dipendeva pesantemente ex vivo, istologia 2-dimensionale (anche se questo sta cambiando con lo sviluppo di metodi perfezionati per in vivo ed ex vivo rilevazione e l'analisi delle lesioni nei piccoli animali <sup> 3). L'analisi istologica delle lesioni arteriose è laborioso, che richiede tempo e fornisce informazioni limitate di struttura 3-dimensionale. Ad esempio, lesione onere è comunemente valutata misurando l'area della sezione trasversale di una lesione (sia in siti selezionati casualmente o al sito di massima occlusione). Ciò fornisce un'analisi incompleta di oneri complessivi lesione. Tutto il montaggio tecnologia di imaging dimensionale 3 fornisce una possibile soluzione a questo problema, ma sorprendentemente alcuni approcci adatti sono stati descritti. Ciò può essere dovuto prevalentemente alla dimensione delle arterie topo che sono troppo grandi per singoli fotoni microscopia confocale ma troppo piccolo per risonanza magnetica (MRI) 4 e X-ray tomografia computerizzata (CT) 5. Applicazione di ex vivo MRI e micro CT allo studio delle lesioni aterosclerotiche nei topi suggerisce offrono risoluzione limitata, anche relativamente grandi arterie. In aggiunta a questo, i tempi di acquisizione relativamente lungo necessariolimitare la velocità (e aumentare i costi di scansione) 4,6.
Lo sviluppo di nuove modalità di imaging ottico (come tomografia a coerenza ottica 3,7 e foto-acustica tomografia 8) offre molto potenziale per migliorare l'imaging delle lesioni nelle arterie murini. Potenziale simile è dimostrato dal tomografia ottica di proiezione (OPT) che è stato sviluppato per consentire l'analisi di embrioni di topo. OPT è stato progettato per campioni immagine vanno da ~ 0,3-10 mm di diametro 9. Trasmissione di imaging registra l'opacità di un campione semi-trasparente a luce visibile e policromatica, può essere utilizzato per l'identificazione delle strutture anatomiche. Emission record di imaging emissione di luce a lunghezze d'onda di eccitazione seguenti specifiche dal endogena (ad esempio, collagene, elastina) e fluorofori esogene nel campione. Questo può anche fornire informazioni anatomiche (poiché diversi componenti del tessuto possono differire per il tipo e la densità delle specie autofluorescentipresente). Inoltre, la distribuzione di immunoreattività o espressione genica può essere determinata con l'impiego di opportune sonde fluorescenti 10. Per entrambe le modalità di imaging (trasmissione o emissione), luce viene focalizzata su un dispositivo ad accoppiamento di carica per consentire la cattura delle immagini iterativo durante la rotazione del campione (solitamente 400 immagini a incrementi di 0,9 °). Questi possono essere usati per il calcolo dei volumi da metodi di ricostruzione tomografica standard (come filtrato retroproiezione (utilizzando un algoritmo cono) o la ricostruzione iterativo).
Questo video dimostra la nostra nuova applicazione di optare per un rapido, quantificabile e conveniente analisi 3-dimensionale delle lesioni aterosclerotiche e neointimale, come descritto in precedenza in Kirkby et al. 11. La tecnica ha dimostrato di essere adatto per quantificare le dimensioni della lesione in tre modelli di uso comune: (i) femorale filo-infortunio; (Ii) legatura dell'arteria femorale, e (iii) aterosclerosi indotta dalla dieta in apolipoprotein E carente (apoE - / - mice).
Protocol
1. Induzione chirurgica di neointima lesioni dell'arteria femorale mouse
- Gli esperimenti su animali devono essere effettuate in conformità ai requisiti etici nazionali e istituzionali. Tutto l'intervento chirurgico dovrebbe essere eseguito utilizzando un'adeguata tecnica asettica. Induzione di lesioni neointima si ottiene utilizzando una modifica della tecnica descritta da Roque et al. 12 e Sata et al. 13.
- Pesare maschio C57Bl6 / J topi (età 10-12 settimane; peso 25-30 g) allora anestetizzare consegnando 4-5% isoflurano in una camera di induzione. Una volta che l'anestesia è stata indotta, trasferire il mouse per una stuoia riscaldata per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C. Continuare la somministrazione di isoflurano (2-3%) tramite una maschera.
- Dopo un adeguato livello di anestesia è stata indotta (mancanza di risposta al pinch tep), fornire una copertura analgesica mediante somministrazione di buprenorfina (0,1 mg / kg -1). Poi posizionare il mouse in posizione supina und radere la superficie ventrale della arti posteriori sinistra.
- Fare un'incisione per esporre i muscoli della hindlimb superiore e, tra la biforcazione con poplitea e la parete addominale, utilizzare smussa per isolare l'arteria femorale e la vena dal nervo femorale. Irrigare la ferita come richiesto utilizzando 1% w / v lidocaina.
- Inserire prossimale (vicino alla parete addominale) e distale (immediatamente sotto il ramo con poplitea) legature temporanee (6/0 Mersilk) intorno l'arteria femorale e la vena per controllare il flusso di sangue. Quindi isolare il poplitea (per circa 2-5 mm distale al ramo con l'arteria femorale) e legare distalmente. Posizionare un secondo, legatura sciolto sotto l'arteria poplitea.
- Eseguire una piccola incisione (arteriotomia) nell'arteria poplitea, immediatamente distale al ramo con l'arteria femorale, impedendo sanguinamento applicando pressione alla legatura temporanea prossimale. Avanza una scala, balzato 0,014 "filo guida1-1,5 cm lungo l'arteria femorale in direzione della parete addominale e lasciano posto per 30 sec (Figura 1A).
- Rimuovere il filo guida e legare poplitea sopra la arteriotomy, utilizzando la legatura posizionato a tale scopo, e avendo cura di non occludere l'arteria femorale.
NOTA: per lesioni legatura-indotta. Rimodellamento neointimale senza pregiudizio intraluminale può essere indotta legando le arterie femorali o poplitea (Figura 1B e 1C). Per raggiungere questo seguire i passaggi 1,1-1,5. Tuttavia, non fanno l'arteriotomia ma (evitando passo 1.6) o (i) legare poplitea immediatamente distale dell'arteria femorale o (ii) legare l'arteria femorale comune al punto di diramazione con poplitea. Quindi procedere con passo 1.8. - Rimuovi legature temporanei, chiudere la ferita con una sutura esterna discontinua (5/0 Mersilk) e applicare la crema EMLA (2,5% lidocaina, 2,5% prilocaina). Lasciare gli animali di ri prendere coscienza (di solito 5-10 min) e assicurarsi che si muovono liberamente intorno loro gabbia (lieve zoppia può essere evidente ad una gamba colpita, ma questo dovrebbe risolvere nei primi 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico), prima di tornare a tenere le camere. I topi non devono essere sistemate da sole dopo l'intervento chirurgico.
- Lasciare gli animali di recuperare fino a 3 mesi. Piccole lesioni cominceranno a comparire ~ 7 giorni dopo la lesione filo e raggiungono una dimensione massima stabile dopo ~ 21-28 giorni.
2. Induzione di aterosclerotica lesioni nel Apolipoproteina E - / - Mice
- Somministrare dieta occidentale (0,2% di colesterolo, diete di ricerca, Stati Uniti d'America) a maschio, 6 settimane di età topi ApoE-null (allevati in casa) per 12 settimane.
- Lesioni aterosclerotiche sono spesso visibili sul ispezione lordo dell'arco aortico e suoi rami principali (Figura 2).
3. Analizzare arteriosa lesioni con proiezione Optical Tomography (OPT)
nt "> NOTA: le immagini OPT di lesioni nelle arterie femorali murini e campioni dell'arco aortico sono stati ottenuti utilizzando una proiezione tomografo ottico.- Euthanize topi transcardiac perfusione fissazione e dissanguamento sotto anestesia terminale (80 mg / kg pentobarbital sodico), utilizzando eparinizzata (10 U / ml) di tampone fosfato salino (PBS), seguita da 10% formalina tamponata neutra.
- Isolare le arterie femorali o dell'arco aortico e dei suoi rami principali (sinistra arteria carotide, arteria succlavia sinistra, tronco brachiocefalico), a seconda dei casi, e rimuovere il materiale peri-avventiziale estranea. Post-fix in 10% formalina tamponata O / N, prima della memorizzazione in etanolo al 70% fino a quando necessario.
- Arterie incorporare nel 1,5% bassa punto di fusione agarosio, pre-filtrati attraverso Whatman 113 V carta. Collegare ogni campione in una OPT supporto magnetico con adesivo cianoacrilato con l'asse del vaso, in linea con quello del monte. Tagliare l'eccesso di agarosio a una forma conica. Disidratare in metanolo 100% per almeno 12 ore.
- Cvasi Lear di immersione (per 12-24 ore) in una miscela di alcool benzilico e benzil benzoato (1: 2 v / v).
- Mettere i campioni liquidati in un tomografo calibrata. Impostare la risoluzione a 1.024 x 1.024, e determinare un ingrandimento ottico che permette l'intera area di interesse da vedere. Volume OPT è isotropo l'asse Z viene ricostruita per la stessa risoluzione (ad esempio, 1.024 x 1.024 x 1.024), la dimensione voxel ~ 200 micron. Ciò può rappresentare una sovrastima di risoluzione in quanto vi sono probabilità di essere artefatti di ricostruzione. Regolare la posizione del campione in modo che ruoti sul proprio asse nel centro del campo di vista in campo chiaro, canale di trasmissione.
- Nel canale di emissione filtri GFP1 (filtro di eccitazione 425 nm con 40 nm passa-banda, filtro di emissione: 475 nm passaggio lungo), concentrare il campione e regolare il tempo di esposizione per massimizzare la gamma dinamica dell'immagine risultante (evitare sovrasaturazione). Scansione la nave in solo il canale di emissione GFP1, con passo 0,9 ° di rotazione. </ Li>
- Al termine, verificare la qualità di acquisizione dati utilizzando il software DataViewer. Rimuovere esemplare dallo scanner.
- Per consentire la successiva analisi istologica, posto del campione in 100% di metanolo per> 24 ore prima della lavorazione di paraffina come normale.
4. Immagine ricostruzione e analisi
Tomografica ricostruzione da filtrato retroproiezione viene eseguita utilizzando il software NRecon o simili. Ricostruzioni possono essere eseguite senza sorveglianza, in lotti.
- Migliorare la qualità delle immagini compensando disallineamento e regolazione dei livelli di intensità dell'immagine.
- Controllare la qualità della ricostruzione delle immagini utilizzando il software DataViewer.
- Identificare la sezione del campione per l'analisi. Mantenere questa lunghezza coerente tra navi, se le dimensioni del lume devono essere registrati.
- Definire il contorno delle lesioni tracciando il bordo manualmente appropriato per 1 ogni 50 sezioni ricostruite.
- Controllare ogni sezione interleaved per assicurare interpolazioni generati al computer siano corrette. Regolare manualmente il confine, se necessario.
- Impostare la soglia dei livelli di grigio in modo da selezionare solo la lesione ed esportare i dati di misura.
- Per ogni scansione, definire una regione di interesse verticale contenente la lesione e tracciare il confine tra media e neointima (ie., La posizione della lamina elastica interna) per ogni linea di scansione 50 °. Interpolare confini intima / media per le linee di scansione intercalati nel software, e verificare e correggere l'adattamento dove richiesto. Ulteriori segmento questo definito tre dimensioni dello spazio e ad una soglia di intensità manualmente definita per produrre una serie di immagini binaria in cui i pixel bianchi rappresentano neointima e pixel neri rappresentano lume di brevetto.
- Le misurazioni effettuate sono: il volume totale della lesione (volume in esame), il volume del lume (volume totale - volume in esame) e la distribuzione di lesione e lumen cross-settaArea ional lungo la lunghezza assiale del recipiente studiata.
Representative Results
Scansione preliminare sani (unlesioned) murine arterie femorali (n = 5) ha dimostrato che l'imaging trasmissione non ha fornito immagini utili. Questa è una conseguenza delle arterie eliminato diventino troppo trasparente (piuttosto che troppo opaco) per imaging.However trasmissione, questo è vantaggioso per l'imaging di emissione non c'è assorbanza / dispersione del segnale emesso. Al contrario, le arterie femorali autofluorescenza fortemente nel canale di emissione, con la massima segnale seguente di eccitazione a 405-445 nm (coerente con un picco di eccitazione 410 nm per elastina 14). Fette 2 dimensioni ricostruiti da queste immagini chiaramente distinti i media dal lume e avventizia e lumen.
In arterie femorali murini raccolte 28 giorni dopo wire (n = 6) o ligation- (n = 5) lesioni indotte neointimale ispessimento era evidente in proiezioni delle emissioni non tomografiche (Figura 3A). In ricostruite 2-dimensfette ionale, lesioni neointimale concentrici potevano essere distinti da parte dei media per la loro emissione più debole (Figura 3B e Figura S1).
Immagini di emissione OPT di intere campioni montaggio dell'arco aortico e dei suoi rami principali di topi aterosclerotica (n = 8) lesioni identificate con la distribuzione anatomica atteso (cioè., In piccola curvatura dell'arco aortico, l'arteria anonima, e le origini della carotide sinistra e succlavia arterie di sinistra (Figura 4A). immagini trasversali hanno indicato che si trattava in genere di lesioni eccentriche ed erano facilmente distinguibili dai media e lume (figura 4B, figure S2 e S3).
Arterie di processo per l'analisi istologica dopo OPT confermato la natura non-distruttiva di OPT, con sezioni colorate con successo utilizzando istologica (Stati Uniti Trichrome, PICRTecniche osirius rosso) e immunoistochimica (α-SMA, Mac-2) (Figure 3C e 4C).
Misurazione della dimensione della lesione con OPT ha dimostrato di essere coerente con le misurazioni ottenute con l'analisi delle immagini di sezioni istologiche prese dalla stessa arteria 11.
Misure planimetrica dell'area della lesione ottenuti da OPT e istologia correlati da vicino da regressione lineare per wire (R 2 = 0,92) e legatura-indotta (R 2 = 0,89) lesioni neointimale e placche aterosclerotiche (R 2 = 0,85). Un importante vantaggio di OPT è la sua capacità di consentire l'analisi 3-dimensionale. Con lo sviluppo di quantificazione volumetrica delle lesioni con questa tecnica, siamo stati in grado di registrare i volumi delle lesioni a wire (0,1100 ± 0,0091 millimetri 3; n = 6) e le arterie femorali legatura-feriti (0,0200 ± 0,0089 millimetri 3; n = 5) e anche nelle arterie brachiocefalici aterosclerotiche (0.180 ± 0,018 millimetri 3; n = 8). Misurazioni erano altamente riproducibili (coefficienti di variazione 5,4%, 11,4% e 4,8%, rispettivamente, n = 4) per ogni tipo di lesione. Lesioni neointimale nei vasi filo-feriti erano più grandi (p <0,0001) rispetto a quelli prodotti da legatura, in linea con il maggior grado di danni inflitti dal primo.
I dati generati potrebbero anche essere espressi come profili lesione (Figura 5) e rese per dinamica, valutazione qualitativa (vedi figure S1 - S3). Questo approccio ha dimostrato chiaramente la portata della formazione della lesione in risposta a diverse procedure di lesioni e ha evidenziato la distribuzione non uniforme di formazione della lesione nei vasi feriti.
Figura 1: Metodi per avviare la formazione di lesione murino femorale & #.160; (A) inserimento retrograda di un filo guida per angioplastica nell'arteria femorale, mediante un arteriotomia nell'arteria poplitea stimola formazione di lesione in risposta ad allungare lesioni e rimozione dell'endotelio. Il flusso di sangue viene ripristinato sopra la sezione ferito della nave. (B) proliferazione neointimale in assenza di intraluminale tratto, denudamento o interruzione del flusso di sangue può essere indotta da legatura o femorale o poplitea immediatamente distale all'arteria biforcazione femorale. (C) Un più grave non denudazione risposta infortunio / proliferazione può essere indotta legando entrambe le arterie femorali e poplitei attraverso il punto di diramazione dell'arteria femorale comune. Questa tecnica consente di bloccare il flusso di sangue nella porzione distale dell'arteria femorale.
Figura 2:. Deposito Caratteristica ateroma nell'arco del mouse aortico Atherosclerosis prona (Apolipopotein E topi deficienti) nutriti con una dieta occidentale ricca in colesterolo per 12 settimane a sviluppare un modello caratteristico di lesione deposizione nel aortico e dei suoi rami principali. Come dimostrato, le lesioni sono visibili (frecce), mediante ispezione lorda sotto un microscopio da dissezione, nell'arco aortico, l'arteria anonima, e gli osti della carotide sinistra e sinistra succlavia.
Figura 3:. Formazione di lesioni a seguito legatura dell'arteria femorale sinistro (A) le immagini di emissione di fluorescenza non tomografiche (invertito per aumentare la chiarezza - zone buie corrispondono a forte emissione) consentire l'identificazione di ispessimento intimale (arrowhe rossoannunci). (B) le regioni vascolari distinti e il lume si possono distinguere in ricostruzioni tomografiche. (C) L'analisi istologica (Stati Uniti tricromica) sottolinea la chiara somiglianza con le immagini ottenute con OPT. Bar Scala a (AC) 200 mm. Adattato da Kirkby et al. 11 bar Scala a (AC) sono 200 micron.
Figura 4:. Imaging di ateroma nell'arco aortico di aterosclerosi topi inclini (A) dell'ateroma (frecce rosse) è evidente in immagini non tomografiche (invertito in modo che le regioni più scure indicano forti emissioni, migliorando così la chiarezza) dell'arco aortico, in luoghi come previsto dell'ateroma-cuscinetto mediante ispezione al microscopio ottico (vedi figura 2). (B) Questo modello di distribuzione è confermata in cr tomograficaoss-sezioni. (C) istologica (Stati Uniti tricromica) colorazione mostra stretta somiglianza con le sezioni tomografiche e immunoistochimica utilizzando diversi anticorpi diversi enfatizza la natura complementare di OPT, con approcci tradizionali alla analisi della lesione. Bar Scala in (A-B) di 1 mm; Barra di scala a (C) è di 250 micron. RSA, succlavia destra; RCA, carotide destra; LCA, sinistra carotide; LSA, arteria succlavia sinistra; BCA, arteria anonima; AoA, aorta ascendente; DAO, aorta discendente. Adattato da Kirkby et al. 11
Figura 5: Analisi di lesioni e lumen profili indica varia entità della proliferazione neointimale in risposta a diversi metodi di lesione arteriosa proiezione ottica tomografia permette lesione e lume attraversare measuremen sezionali.ts per essere rilevate in distanza lungo l'arteria femorale. Ciò dimostra chiaramente che, a fronte di una arteria indenne (A), legatura parziale (B) produce piccole lesioni relativamente discrete, considerando legatura totale (C) produce completa occlusione in corrispondenza del sito di legatura ma lesione non si estende lontano lungo l'arteria . Lesioni filo endoluminale (D) produce una lesione che occlude quasi completamente la porzione distale del campione e si estende lungo tutta la lunghezza della sezione scansionata dell'arteria. Adattato da Kirkby et al. 11
Figura S1. Ricostruzione animata di immagini trasversali ottenute da un mouse femorale seguenti lesioni legatura. Questo tipo di immagine animata è utile sia per l'analisi qualitativa e quantitativa. Come l'animazione si muove dalla prossimale alle sezioni distali dell'arteria graduale sviluppo di una neointima occlusiva, discoernible dal lume e dei media, è evidente. Rami laterali possono essere facilmente identificate e non vi è evidente l'occlusione del lume e il rimodellamento esterno dell'arteria come la lesione aumenta di dimensioni. Completa occlusione del vaso avviene una volta che il sito di legatura viene raggiunta. Adattato da Kirkby et al. 11
.. Figura S2 ricostruzione animata di immagini in sezione trasversale di un arco aortico da un mouse aterosclerosi incline L'animazione inizia con sezioni del crescente (sinistra - che appare per primo) e discendente (destra) dell'aorta. Piccole lesioni compaiono in aorta ascendente come le mosse di scansione nella direzione dell'arco aortico. Le immagini poi si muovono attraverso l'arco di mostrare gli osti pesantemente leso del brachiocefalico (a sinistra), carotide sinistra (al centro) e succlavia sinistra (a destra) le arterie. Mentre la scansione si muove distalmente lungo questi rami le lesioni ridurre gradualmente e scompaiono, prima nel subcarteria Lavian, poi nella carotide e infine nella arteria anonima. È interessante notare che la lesione nei arteria anonima sposta sul il divisore di flusso come questo vaso si divide in carotide destra e le arterie succlavia destra. Adattato da Kirkby et al. 11
Figura S3. Animata, immagine volume rendering di un arco aortico da un mouse aterosclerosi-inclini. Proiezione ottica tomografia permette la generazione di immagini 3-dimensionale, in questo caso dimostrare distribuzione lesione aortico di apolipoproteina E topo carente. (A) Ateroma è presente nei siti previsti (tutto l'arteria anonima, nel osti delle carotidi e succlavia sinistra e in piccola curvatura dell'arco aortico). (B) Segmentazione e rendering di lesione (mostrato in rosso) recante sezioni sottolinea la distribuzione delle placche quando sovrapposto all'immagine originale.Adattato da Kirkby et al. 11
Discussion
Analisi 3 dimensioni ha un grande potenziale per la sostituzione o aggiunta alle tecniche istologiche 2-dimensionali che ancora stanno alla base della maggior parte delle ricerche di formazione della lesione arteriosa. Qui OPT è mostrato in piccole arterie murini (con le arterie femorali murini probabilmente rappresentano i piccoli vasi che possono essere analizzati con successo utilizzando questa tecnica). È, tuttavia, anche adatto per l'uso con le arterie (e lesioni) da altre specie, incluse le navi umane piccole e medie dimensioni; il nostro gruppo ha utilizzato con successo la tecnica per analizzare lesioni dell'aorta di coniglio (Bezuidenhout et al;. inedito). OPT promette analisi veloce e maggiore informazione strutturale rispetto istologia tradizionale e ha il vantaggio di non impedire successiva analisi del campione utilizzando tecniche sia istologiche e immunoistochimiche.
Le immagini prodotte con OPT dato dettaglio anatomico, mostrando luoghi di formazione della lesionee la dimensione delle lesioni in queste aree. Le arterie utilizzati in questi studi sono probabilmente vicino al limite di risoluzione per la tecnica e la qualità dell'immagine è quindi ridotta in una certa misura da artefatti (probabilmente derivanti da disallineamento di rotazione, compensazione incomplete, riflessione / rifrazione ai vertici agarosio e problemi di messa a fuoco) . Nonostante ciò, i dati richiesti (cioè, gli strati della parete del vaso) rimangono distinguibile e quindi la tecnica è estremamente utile per la quantificazione dei singoli strati. Infatti, le immagini potrebbero essere quantificati rapidamente e riproducibile per fornire misure di lesione e il volume del lume nelle sezioni reggitarga della nave, così come aree di sezione trasversale della lesione e lume a siti selezionati nel campione. Grande (aorta) e medie imprese (femorale, carotide, succlavia) arterie murine - quelle generalmente utilizzate per l'analisi della formazione lesione aterosclerotica e neotintimal nei topi - sono stati con successoanalizzate con questo metodo. Anzi ora abbiamo utilizzato OPT per dimostrare l'effetto di interventi farmacologici e manipolazione genetica su dimensione della lesione aterosclerotica e neointimale. Ad esempio, il blocco del recettore dell'endotelina alterato neointimale formazione della lesione, mentre l'eliminazione selettiva del recettore dell'endotelina B dal endotelio vascolare no 15. In aterosclerosi topi inclini, delezione genetica degli enzimi 11β-HSD1 16 o galectina 3 17 hanno mostrato di ridurre le dimensioni delle lesioni aterosclerotiche.
La quantificazione del volume della lesione è un vantaggio evidente di OPT. Dà un'indicazione più informativo del carico totale della lesione in un'arteria 4 che di solito è ottenuto con metodi istologici. Analizzando l'intera lesione riduce bias di selezione ed errori che inevitabilmente si verificano quando le sezioni discreti di una nave sono scelti per l'analisi. Produzione di profili longitudinali lesione è un'ulteriore forza di OPT, Sottolineato dal confronto delle lesioni indotte da diversi tipi di lesioni 13,16 (Figura 5). Ad esempio, sia la legatura completa e filo-inserimento indotta un'occlusione quasi totale in prossimità della biforcazione femero-popliteo. Lesioni Wire, lesioni tuttavia, prodotti che estese lungo tutta la lunghezza della sezione scansionata, mentre le lesioni indotte da legatura arteriosa rapidamente rimpicciolita e scompaiono. Questo modello è coerente con la misura maggiore di lesioni provocate da inserimento del filo guida per angioplastica. Generazione risultati simili utilizzando sezioni istologiche è costosa, richiede tempo e manodopera.
I vantaggi di OPT includono la qualità delle immagini che produce e la sua velocità relativa e semplicità (abbiamo routinariamente digitalizzata 20 navi al giorno). La qualità dell'immagine appare superiore, o almeno comparabili, ad altri metodi per la generazione di immagini 3-dimensionale ex vivo (ad esempio MRI e CT micro-), yet OPT richiede tempi di scansione più brevi (tempo di integrazione per i nostri studi era tipicamente 1-2sec / immagine) ed è meno costoso. Preparazione del campione si estende per diversi giorni, ma richiede poca fatica, i vasi possono essere preparati in lotti, ed i dati possono essere acquisiti in un'unica sessione. Di conseguenza, la velocità è elevata e non richiede l'uso esteso dello scanner. È importante sottolineare che la natura non distruttiva di OPT significa che può essere utilizzato per identificare i siti di interesse per l'esame immunoistochimico; riducendo così la quantità di taglio e colorazione desiderata. E 'possibile che lo sviluppo di alta risoluzione ultrasuoni fornirà un metodo alternativo per la quantificazione volumetrica delle lesioni in arterie questo formato, ma gli autori sono a conoscenza di pubblicazioni che dimostrano questa applicazione.
Forse non sorprende, la qualità delle immagini in OPT è inferiore a tecniche microscopiche (che possono, naturalmente, essere svolti solo su campioni più piccoli). Perfezionamenti proposti a reconstruction di dati può risolvere questa limitazione permettendo futuro miglioramento della qualità dell'immagine 19,20. Un'altra preoccupazione metodologica è che il trattamento dei tessuti altera le caratteristiche del campione. Ad esempio la natura lipofila dell'agente di compensazione, alcool benzilico / benzil benzoato (BABB), è probabile rimuovere lipidi da lesioni aterosclerotiche, mentre prima la disidratazione può causare restringimento (anche se, naturalmente, disidratazione e rimozione dei lipidi passaggi sono anche una caratteristica di preparazione del campione per l'incorporamento in paraffina). BABB stato usato in questa inchiesta, in confronto con gli agenti di compensazione idrofili (ad esempio glicerolo 21) provoca solo piccole variazioni di morfologia.
Ci sono diverse possibilità per un ulteriore sviluppo e perfezionamento di OPT, con particolare riferimento al monitoraggio della disposizione 3 dimensioni di cellule chiave e fattori coinvolti nel rimodellamento arterioso segnalazione. La forte autofluorescenza di tessuto arterioso, che è talen vantaggio nella generazione di immagini anatomiche, non si spegne con i metodi esistenti di sbianca 22 e può limitare l'uso di sonde fluorescenti per valutare modelli di RNA e proteine distribuzione. L'uso di sonde colorimetrici (ad esempio β-galattosidasi) individuate tramite tomografia trasmissione può superare questa limitazione.
Per concludere, OPT ha un grande potenziale per l'imaging 3 dimensioni delle lesioni nell'intima delle arterie murini. Essa rappresenta un notevole progresso sui metodi 2 dimensioni, che sono generalmente alta intensità di manodopera e non rappresentano in modo efficace il volume totale della lesione. OPT è relativamente veloce, conveniente e non distruttiva. Nuove costruzioni in analisi dell'immagine promettono di aumentare ulteriormente la potenza e l'utilità della tecnica.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio presso l'Università di Edimburgo (NSK) e Carnegie Trust (LL; Henry schema Dryerre) e finanziamenti dalla British Heart Foundation (PWFH, BRW, DJW; RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25461) e Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). Gli autori sono grati a sostenere per il loro lavoro forniti dal Centro di ricerca di eccellenza premio BHF-finanziato al Centro for Cardiovascular Science.
Gli autori sono particolarmente grati per la consulenza del professor Masataka Sata (Università di Tokushima) e il dottor Igor Chersehnev (in gruppo Dr Ernane Reis 'al Mount Sinai School of Medicine) sull'istituzione dei modelli chirurgici di produzione neointimale lesione. Il video è prodotto e messo a disposizione dalla Sata et al. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) è stato particolarmente utile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating Microscope | Zeiss, Germany | OPMI Pico i | |
| Anesthetic Machine | Vet Tech, UK | ||
| Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
| Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
| Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
| Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
| Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
| Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
| Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
| Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, UK | 15000-01 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools, UK | 11251-35 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools, UK | 11370-31 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools, UK | 13008-12 | |
| Bulldog clips | Fine Science Tools, UK | 18050-35 | |
| Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | ||
| Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | ||
| Computer | Dell Inc, UK | ||
| Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
| DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
| NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
| CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
| Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapor, liquid |
| Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
| Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | 0.3 mg/ml | |
| 1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10 ml ampoule |
| EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | ||
| Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
| Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 250,000 Units |
| Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
| Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
| Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
| Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
| Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
| Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
| Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
| Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |
References
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