Summary
我们描述了使用多路复用基于微球的抗体阵列分析唾液蛋白的过程。单克隆抗体共价连接到荧光染料编码的4.5微米聚合物用碳二亚胺化学性微球。修改后的微球沉积在光纤的微孔用荧光夹心免疫测定蛋白水平在唾液。
Abstract
本文中，我们描述了一种协议，用于同时测量6蛋白在唾液中使用的光纤基于微球的抗体阵列。所采用的免疫阵列技术结合基于微球的悬浮阵列制造与使用荧光显微镜的优点。如在视频协议描述的，可商购的4.5微米的聚合物微球进行编码成七种不同类型的，由两个荧光染料物理截留在微球内的浓度分化。表面含羧基的编码微球通过EDC / NHS偶联化学进行了修改，用单克隆捕获抗体。组装的蛋白质微阵列，不同类型的编码和官能化的微球混合，并随机地沉积在4.5微米的微孔，从而进行化学蚀刻在一光纤束的近端。光纤束被用来同时作为载体和用于成像的米icrospheres。一旦组装后，该微阵列用于捕获蛋白在从诊所收集唾液上清液。该检测是基于使用生物素化的检测抗体的混合物为不同的分析物与链霉亲和结合的荧光探针，R-藻红蛋白的夹心免疫测定。微阵列是在三个不同的通道，两个对微球的注册和一个用于检测信号成像，荧光显微镜。的荧光显微照片，然后解码，并在MATLAB中使用自制的算法进行分析。
Introduction
由于报道由Mark Schena并在90年代中期的同事第一芯片，这个强大的工具已被用于生物研究1的许多领域。能够同时检测多种蛋白质在诊断液，如血液的抗体微阵列，具有在临床诊断和生物标志物筛选2-10重要的应用。唾液，含有许多相同的分析物如血，一直被认为是一个优选的替代方案，因为血液唾液收集是安全的，非侵入性的，并且可以进行通过微创医疗人员11-13。目前，使用唾液样本复用蛋白分析是由几个重要的因素，其中包括目标分析物14的低浓度和不同的生物标记物15的宽浓度范围的限制。
。在此，我们证明6种蛋白的分析：人血管内皮生长因子（VEGF），干扰素γ-诱导蛋白10（IP-10），白细胞介素-8（IL-8），表皮生长因子（EGF），基质金属蛋白酶9（MMP-9），和白细胞介素-1β（IL-1β） 。该方法的性能用标准溶液构成的重组蛋白分析物和封闭缓冲液中最初验证。从不同的慢性呼吸系统疾病的患者以及健康对照真正的唾液样本进行了测试表现令人满意。该协议应当适用于其他蛋白质的分析物和其他基于微球的实验。该平台提供了相当大的优势，在分析化学领域，因为它使低浓度的几种蛋白质具有广泛的动态范围，最小的非特异性相互作用，减少样品消耗和低成本的快速，精确，可重复的和同时分析在比较的类似的酶联免疫吸附试验（ELISA）。
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Protocol
图1。 。工作流应用的光纤微球体抗体阵列唾液剖析 （1）微球的内部编码的两种荧光染料，（2）所编码的微球在外部修改与蛋白特异性的单克隆抗体，（3）复用的微球混合，和（4）随机地沉积在微孔蚀刻在光纤束的近端，（5）唾液蛋白是通过夹心免疫捕获的微球，和（6）使用荧光显微镜进行定量。
1。编码微球
- 称取钠铕（Ⅲ）thenoyltrifluoroacetonate三水（欧盟TTA，MW =869.54克/摩尔）在琥珀色玻璃瓶中，并在四氢呋喃（THF）准备一个200毫米原液。用移液枪轻轻混匀;直观地验证染料完全溶解。
- 称取香豆素30（C30，MW =347.41克/摩尔）在琥珀色玻璃瓶中，并准备一个12毫米原液在THF。用移液枪轻轻混匀，直观地验证了染料完全溶解。
- 制备700微升使用储备溶液和THF中以达到表1中列出的最终浓度为每微球型工作液。
- 确保微球（10％重量/体积）深受涡旋暂停，再换乘60微升悬浮液1.5 ml离心管中。
- 加入600微升PBS，以微球悬浮和20倍吹打混匀。离心管在10,000 rpm 3分钟，小心取出上清液。重复此过程，另2个洗球。
- 使用相同的程序，步骤1.5十二烷基硫酸钠洗涤微球沉淀3次。
- 离心微球/ THF悬浮液以10,000 rpm离心3分钟，除去上清液，并重新悬浮于600微升的沉淀工作溶液列于表1。将混合物转移至新的1.5 ml微量离心管中。
- 密封离心管封口膜，并把它放在摇床。摇在3,000 rpm孵育24小时，用一个盒子上面有铝箔覆盖安装避光。
- 离心微球悬浮液在10,000 rpm下3分钟，以形成颗粒。
- 除去上清液染料溶液，冲洗微球6X与600微升甲醇中，然后用600微升PBS含0.01％Tween-20的另一种6倍，如在步骤1.5中描述。
- 存储编码微球在600微升PBS含0.01％吐温20在4°C，直到使用，避光。
| 微球型名称： | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| EU-TTA（MM） | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30（MM） | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
表1中。的Eu-TTA和C30浓度的工作溶液。
2。蛋白质捕获微球的制备
- 制备的MES缓冲液[2 - （N-吗啉）乙磺酸（MES）的0.1M，氯化钠0.9％，SDS 0.01％，pH值为5.7]和PBS / SDS缓冲液（磷酸钠0.01 M，氯化钠0.154 M，SDS 0.01％，pH值7.4）预先在室温下。
- 加入200μl编码微球悬浮液（含〜2毫克微球）到一个安全锁1.5 ml离心管。使用这种类型的离心管中，以避免在步骤2.6中温育过程中泄漏是很重要的。 <LI>清洗微球600微升的MES按照步骤1.5中所述缓冲3倍。加入700μl的MES在微球颗粒和吹打拌匀。
- 准备0.105克/ ml的1 - 乙基-3 - [3 - 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC，MW =191.7克/摩尔）和0.163克/毫升磺基-N-羟基硫代琥珀酰亚胺（磺基-NHS，MW =217.13克/ mol）的在MES缓冲溶液中分离管。
- 加入新鲜配制的EDC解决方案， 一滴一滴进入微球悬浮液150微升。 EDC的水解速度非常快，因此，它必须使用新鲜的溶液，以确保固定化效率。紧接在添加EDC后，加入150μl的磺基-NHS溶液的微球，通过移液混合均匀，并验证该悬浮液是均匀的。
- 盖上管，用封口膜密封，并将其放置在摇床。摇在1,500 rpm 4小时，用一个盒子上面有铝箔避光。
- 离心微球suspens离子以10,000 rpm离心3分钟，以形成沉淀物，并除去上清液。如在步骤1.5中所述，用500μL的PBS / SDS缓冲液3X冲洗微球。
- 加入200μl的PBS / SDS缓冲液的颗粒，混合微球以及后转移到300微升含60微克的捕获抗体的PBS / SDS缓冲液。它首先暂停微球的颗粒，然后加入微球悬浮液到抗体溶液中是很重要的。
- 通过摇动在1,500 rpm 4小时在摇床上孵育抗体 - 微球混合物中，用框有铝箔避光。
- 离心微球悬浮液在10,000 rpm下3分钟，以形成沉淀物，并除去上清液。用500μlStartingBlock（TBS）封闭缓冲液3次，如在步骤1.5中所述洗涤微球。
- 混合性微球用1ml TBS的封闭缓冲液孵育微球在1,500 rpm进行1小时的摇床上，用一个框科夫避光红色的有铝箔。
- 离心微球悬浮液在7,000 rpm离心3分钟，以形成沉淀物，并除去上清液。用500μLTBS封闭缓冲液，如在步骤1.5中所述洗涤沉淀3次。
- 离心微球溶液以7,000 rpm离心3分钟，以形成沉淀物，并除去上清液。加入500μlTBS封闭液并吹打混匀。
- 存储修改后的微球悬浮在4°C，直到使用，避光。
- 重复此步骤，以使其他类型使用相应抗体的微球。
3。光纤芯片组装
- 混合50μl的每种类型的蛋白捕获微球的成新的高压灭菌的离心管中。离心机股票微球池在7000 rpm下3分钟，除去上清，使剩余的体积为约100微升。
- 手工切割的光纤束至大约5厘米的长度和依次用30，15，9,6，3，1，0.5和0.05微米尺寸的金刚石研磨膜的抛光机上抛光的两端。超声处理在去离子水中2分钟，在抛光束以除去任何颗粒。
- 把小电磁搅拌棒加入0.5 ml离心管中，加入400微升的无蛋白质的PBS缓冲液中，并搅拌上磁性搅拌板30分钟以除去气泡。
- 在150秒10,16 0.025 1N HCl溶液蚀刻抛光纤维束的一端。立即浸没和超声处理的蚀刻结束在去离子水中1分钟。干燥该纤维束的压缩空气。
- 装载在纤维束上的纤维托座和阻止蚀刻端在无气泡，无蛋白的PBS缓冲液1小时。
- 关于光纤束的蚀刻端存储的微球悬浮液的存款1微升等份。保护设置从光与铝箔盒，并等待15分钟。悬浮液的量将通过蒸发减少，微球强行进入蚀刻的微孔。重复此步加载一次。
- 使用与样品溶液饱和棉签除去未被困在微孔微球。蛋白质微阵列现在可以使用了。请立刻步骤4.1唾液分析。
4。唾液样本分析使用微芯片
- 加入200μl样品溶液（100微升唾液上清液稀释StartingBlock T20（PBS）等体积的封闭液。唾液上清液中收集协议先前已公布的10）。入0.5ml的灭菌离心管中。沾在纤维进入溶液中加载的蛋白质微阵列孵育在摇床上以600rpm搅拌2小时，用的是盒覆盖有铝箔避光。
- 准备20毫升洗涤缓冲液，加入200μl的10％BSA溶液和200μl的10％Tween-20的成19.6毫升PBS，英里x深受轻轻晃动。
- 浸蛋白质微阵列到含有200μl的洗涤缓冲液的新高压灭菌的离心管中，并摇动以600rpm持续2分钟。重复此洗3次。
- 孵育微阵列中含有抗-VEGF，IP-10，IL-8，EGF，MMP-9的5μg/ ml的检测抗体鸡尾酒的100微升溶液中，在StartingBlock T20 IL-1β的生物素化的检测抗体（PBS）封闭缓冲液30分钟，在室温下在摇床上以600rpm，从光利用箱用铝箔覆盖保护。
- 按照步骤4.3中所述用洗涤缓冲液清洗芯片3倍。
- 孵育微阵列在200μl的PBS中20μg/ ml的链霉亲和R-藻红蛋白缀合物（SAPE）的溶液在600rpm的摇床上10分钟，用盒子覆盖有铝箔避光。
- 按照步骤4.3中所述用洗涤缓冲液洗芯片5倍。
- 清洁纤维（ 即 ，端部远离的远端从微球），捆绑用无水乙醇饱和棉签。
- 干燥压缩空气的光纤的两端。通过纤维的前端安装的光纤上的落射荧光显微镜和图像。
- 获取对应的Eu-TTA，C30，和SAPE荧光发射强度的微球的图像。光过滤器的设置和曝光时间的Eu-TTA，C30，和SAPE的荧光成像被描述在表2中。
| 渠道 | EU-TTA | C30 | SAPE |
| 激励 | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| 分光镜 | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| 发射器 | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| 曝光时间 | 1秒 | 0.3秒 | 1秒 |
表2。参数用于微阵列的三个荧光图像。
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Representative Results
从三个通道表示光纤束的一小部分的荧光图像示于图2A-C。使用MATLAB写的一个算法这些图像进行分析（如在讨论部分更详细地描述）。该分析采用从铕-TTA编码图像（ 图2A）中的信息和C30的编码图像（ 图2B）来解码的微球，并计算信号的图像（ 图2C）在不同的微球的荧光强度。与相关蛋白的标准中获得的校准曲线，计算蛋白的唾液样品中的浓度。
图2。 （一）EU-TTA编码图像，（B）C30编码图像，（C）SAPE信号图像，（D）解码结果s重叠的信号图像上;不同类型的微球是标记有不同的颜色和形状。
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Discussion
研究者应该格外注意以下步骤：为更好的解码精度，有必要验证微球均匀地悬浮在所有孵育和微球编码过程中的洗涤步骤。此外，经编码的微球需要在整个实验中，以避光。下列正确的编码和储存程序中，我们发现，总体解码准确率为99％以上。该编码微球应保存在4℃保存，避免冷冻和避光。在适当的储存条件下，编码微球是稳定超过六个月。在编码和修改步骤，需要格外小心，以减少微球的损失。例如，除去上清液时不妨碍微球颗粒。另外，包括吐温20和SDS的缓冲液是必不可少的更好的微球粒化。
有些ØF中的常见故障排除过程是：（1）只使用新鲜制备的EDC溶液和EDC溶液应溶液，（2）高压灭菌管中，应使用与微球溶液应在每次孵育步骤之前被转移到新管中，（ 3）在每个洗涤步骤中，尽量除去上清液尽可能地，（4）修改后的微球应贮存于4℃， 避免冷冻和避光，在适当的储存条件下，修饰的微球可以被存储为3个月以上，没有检测到信号损失。
用于分析的荧光图像在MATLAB算法简述如下。相关的代码可以在补充材料中找到。一个用户定义的强度范围为铕TTA图像内的像素的第一过滤。不同的区域进行了检查用大小过滤器，除去包含由光引起的衰减“空”中心区域和地方微球是目前被分类到观察名单以备将来处理。所有的监视列表中的微球进一步过滤与相应的C30图像的响应。对于一个特定的微球的所有像素的信号进行平均。此微球的兴趣的信号强度进行了计算平均的观察名单全部微球的强度。为了使统计结果更具有代表性，须最少每一种类型的25微球。以最小化非特异性信号，并降低不同实验之间的变化，对于所有类型的微球的信号由来自控制微球中减去该信号被归一化。
微球的信号响应可以通过抗体的固定化微球的表面上的量，这是理想的多路检测其浓度的宽范围内的蛋白质的调节。基于所述微球，吨直径不同他以形成单层的微球所需抗体的量可以通过从制造商17的方程来估计。对于一个直径为4.5微米，3微克抗体的微球，需要每1毫克微球。我们在耦合解决方案在从3微克（0.5倍）的步骤2.8至60抗体微克（10倍）测试了不同的抗体量。观察到增加的信号时更多的抗体在溶液中使用。最佳的抗体量的不同的抗体和应用程序必须通过实验来确定。 “对照微球”被加上同种型小鼠IgG抗体，这是由制造商提供的作为阴性对照在直接ELISA，并表现出无交叉反应性高达40的重组人蛋白18。来评价的耦合方法的再现性，分两批MMP-9的微球被耦合在不同的日子。微球的性能是通过使用多工器测试三维检测的10毫微克/毫升的MMP-9。结果显示（详细结果见表3）微球的不同批次间无显著差异。
| 无 | 日期 | 测试1 | 测试2 | 测试3 | 平均 | 标准 |
| 1 | 01/12/2011 | 773.8 | 690.1 | 756.8 | 740.2 | 44.2 |
| 2 | 01/26/2011 | 791.9 | 721.8 | 867.0 | 793.6 | 72.6 |
表3。再现性的偶联方法（结果以任意单位示出）。
这里介绍的复用方法能够快速，准确，重现性不同的蛋白质的分析在很宽的浓度范围内（ 表4中所列的结果）。潜在的交叉反应性，因为我们在本研究中使用的6抗体对也被测试。所有从交叉反应的信号被认为是可忽略不计（小于3％）。该方法的其它优点，相对于常规的酶联免疫吸附测定（ELISA），包括一个宽的动态范围，最小的非特异性相互作用，减少样品消耗和成本低10。唾液样品的所需的体积是低至100微升，并测定可在3.5小时内完成。当与其他悬浮阵列相比，这种方法的一个限制是，一旦微阵列被组装时，所述检测需要在少于15分钟被启动。这里所描述的方法已被用于在我们的实验室，分析从患者的炎性疾病和健康对照组（未发表数据）采集的人唾液样品。该方法应适用对于其他复杂的流体样本的蛋白质分析。类似的基于微球的蛋白阵列可以用于在其他平台上，如微流体装置。编码和固定化的方法也可以应用于与其它材料9制成的微球体。
| 血管内皮生长因子 | IP-10 | IL-8的 | 表皮生长因子 | MMP-9的 | IL-1β | |
| 测试1 | 5365.9 | 2578.4 | 6508.7 | 2584.0 | 515.5 | 1147.4 |
| 测试2 | 5787.8 | 2577.9 | 7238.9 | 2919.2 | 375.7 | 1099.2 |
| 测试3 | 4944.6 | 2883.3 | 6726.3 | 3619.3 | 406.8 | 1084.1 |
| 平均 | 5366.1 | 2679.9 | 6824.6 | 3040.8 | 432.7 | 1110.2 |
| 标准。开发 | 421.6 | 176.2 | 374.9 | 528.3 | 73.4 | 33.1 |
表4。结果（任意单位显示的结果），在相同的唾液样本三名独立测试。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（补助08UDE017788-05）的支持。 EBP也承认支持西班牙基金会科学与技术（FECYT）。作者感谢人Shonda T.盖洛德和Pratyusha Mogalisetti的手稿的批判性阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R.
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R.
- Schena, M. Protein Microarrays. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).
- Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from: http://www.rndsystems.com/Products/MAB002 (2013).
