Summary
We beschrijven een werkwijze voor het profileren speekseleiwitten met multiplex-microsfeer gebaseerde antilichaam arrays. Monoklonale antilichamen werden covalent gebonden aan fluorescerende kleurstof gecodeerd 4,5 urn polymere microsferen middels carbodiimide chemie. De gewijzigde microsferen werden afgezet in glasvezel-microwells eiwit niveaus in het speeksel te meten met behulp van fluorescentie sandwich immunoassays.
Abstract
Hierin beschrijven we een protocol voor het gelijktijdig meten van zes eiwitten in het speeksel met een vezeloptische-microsfeer gebaseerde antilichaam array. De immuno-array-technologie die combineert de voordelen van op microsfeer gebaseerde suspensie matrix productie met gebruik van fluorescentiemicroscopie. Zoals beschreven in de video-protocol, werden commercieel verkrijgbaar 4,5 urn polymeermicrosferen gecodeerd in zeven verschillende soorten, onderscheiden door de concentratie van twee fluorescente kleurstoffen fysiek opgesloten in de microsferen. De gecodeerde microsferen die oppervlak carboxylgroepen werden gewijzigd met monoklonale antilichamen capture via EDC / NHS koppeling chemie. Om het eiwit microarray assembleren, de verschillende soorten van gecodeerde en gefunctionaliseerde microbolletjes werden gemengd en willekeurig gestort in 4,5 urn microputjes, die chemisch werden geëtst op het proximale einde van een vezeloptische bundel. De vezeloptische bundel werd gebruikt als zowel een drager en voor het afbeelden van de microspheres. Afgewerkt, werd de microarray gebruikt om eiwitten te vangen in het speeksel supernatant verzameld uit de kliniek. De detectie is gebaseerd op een sandwich immunoassay met een mengsel van gebiotinyleerde detectie antilichamen voor verschillende analyten met een streptavidine-geconjugeerde fluorescente probe, R-fycoerythrine. De microarray werd afgebeeld door fluorescentiemicroscopie in drie verschillende kanalen, twee voor microsfeer registratie en een voor de test signalen. De fluorescentie microfoto's werden vervolgens gedecodeerd en met een zelfgemaakte algoritme in MATLAB geanalyseerd.
Introduction
Sinds de eerste microarray gemeld door Mark Schena en collega's in het midden van de jaren 1990, heeft deze krachtige tool is gebruikt op vele terreinen van biologisch onderzoek 1. Antilichaam microarrays kan tegelijkertijd detecteren van meerdere eiwitten in diagnostische fluïda, zoals bloed, hebben belangrijke toepassingen in de klinische diagnostiek en biomarker screening 2-10. Speeksel, die veel van dezelfde analyten zoals bloed, wordt beschouwd als een beter alternatief voor bloed doordat speekselinzameling veilig, niet-invasieve, en kan door minimaal geschoold medisch personeel 11-13 worden uitgevoerd. Momenteel wordt gemultiplexte eiwitanalyse met speeksel door verscheidene belangrijke factoren, zoals de lage concentratie van doelanalyt 14 en breed concentratiegebied van verschillende biomarkers 15.
.Hierin tonen we de analyse van zes eiwit: humane vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), interferon-gamma geïnduceerde proteïne 10 (IP-10), interleukine-8 (IL-8), epidermale groeifactor (EGF), matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) en interleukine-1 bèta (IL-1β) . De prestaties van de werkwijze werd aanvankelijk gecontroleerd met standaardoplossingen vormen analyt recombinante eiwitten en blokkeerbuffer. Real speeksel monsters verzameld van patiënten met verschillende chronische aandoeningen van de luchtwegen en gezonde controles werden ook getest met bevredigende prestaties. Het protocol moet van toepassing zijn op andere eiwit analyten en andere-microbolletjes gebaseerde testen zijn. Dit platform biedt aanzienlijke voordelen op het gebied van analytische chemie zoals maakt een snelle, nauwkeurige en reproduceerbare gelijktijdige analyse van lage concentraties van verscheidene eiwitten met een breed dynamisch bereik, minimale niet-specifieke interacties, verminderd monster en lage kosten in vergelijking met een analoog Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figuur 1. . Workflow voor toepassing vezeloptische microsfeer antilichaam array speeksel profilering (1) Microsferen worden intern gecodeerd met twee fluorescerende kleurstoffen, (2) de gecodeerde microbolletjes uitwendig gemodificeerd met eiwit-specifieke monoklonale antilichamen, (3) de gemultiplexte microsferen worden gemengd, en (4) willekeurig gestort in microputjes geëtst op het proximale uiteinde van een vezel-optische bundel, (5) speekseleiwitten weergegeven door microbolletjes door sandwich immunoassay en (6) gekwantificeerd middels fluorescentiemicroscopie.
1. Microsferen Encoding
- Weeg natrium europium (III) thenoyltrifluoroacetonate trihydraat (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) in een amberkleurig glazen flesje en stelt een 200 mM voorraadoplossing in tetrahydrofuran (THF). Meng voorzichtig door pipetteren; visueel controlerende kleurstof volledig is opgelost.
- Weeg coumarine 30 (C30, MW = 347,41 g / mol) in een amberkleurige glazen flacon en bereiden een 12 mM voorraad oplossing in THF. Meng voorzichtig door pipetteren; visueel controleren of de kleurstof volledig is opgelost.
- Bereid 700 ui werkoplossing voor elke microsfeer met de voorraadoplossingen en THF eindconcentratie in tabel 1 bereikt.
- Zorg microsferen (10% w / v) goed gesuspendeerd door vortexen, en breng 60 pl suspensie tot een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg 600 ul PBS om microsferensuspensie en meng door pipetteren 20x. Centrifugeer de buis bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten en verwijder voorzichtig de supernatant. Herhaal dit proces nog 2x om de microsferen te wassen.
- Was de pellet van microsferen 3x THF met behulp van een soortgelijke werkwijze als stap 1.5.
- Centrifugeer de microbolletjes / THF suspensie bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 600 uiwerkoplossing vermeld in tabel 1. het mengsel in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Dicht de microcentrifugebuis met Parafilm en plaats deze op een shaker. Schudden bij 3.000 tpm en incubeer gedurende 24 uur, bescherming tegen licht door het bedekken van de setup met een doos bedekt met aluminiumfolie.
- Centrifugeer de microsferensuspensie bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten om een pellet te vormen.
- Verwijder de kleurstof bovenstaande oplossing, was de microsferen 6x met 600 ul methanol en daarna met 600 ul PBS die 0,01% Tween-20 andere 6x, zoals beschreven in stap 1.5.
- Bewaar de gecodeerde microbolletjes in 600 ul PBS die 0,01% Tween-20 bij 4 ° C tot gebruik, te beschermen tegen licht.
| Type Microsphere naam: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Eu-TTA (mM) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (MM) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
Tabel 1. Concentraties van Eu-TTA en C30 werkende oplossingen.
2. Voorbereiding van de eiwit-capture microsferen
- Bereid MES buffer [2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, 0,01% SDS, pH 5,7] en PBS / SDS-buffer (0,01 M natriumfosfaat, NaCl 0,154 M, 0,01% SDS, pH 7.4) vooraf bij kamertemperatuur.
- Voeg 200 ul gecodeerd microsferensuspensie (met ~ 2 mg microsferen) in een Safe-Lock 1,5 ml microcentrifugebuis. Het is belangrijk om dit soort microcentrifugebuis om morsen tijdens de incubatie in stap 2.6 voorkomen. <li> Was de microsferen met 600 ul MES buffer 3x zoals beschreven in stap 1.5. Voeg 700 ul MES aan de microsferen pellet en meng goed door pipetteren.
- Bereid 0.105 g / ml 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC, MW = 191,7 g / mol) en 0,163 g / ml sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS, MW = 217,13 g / mol) oplossingen MES buffer in afzonderlijke buisjes.
- Voeg 150 ul vers EDC oplossing bereid druppel voor druppel in de microsferensuspensie. De EDC hydrolyseert snel, dus is het essentieel om verse oplossing om de immobilisatie efficiëntie. Onmiddellijk na de toevoeging van EDC, voeg 150 ul sulfo-NHS oplossing voor de microbolletjes, goed mengen door pipetteren en controleer de suspensie homogeen is.
- De dop op de tube, verzegelen met Parafilm, en plaats deze op een shaker. Schudden bij 1500 rpm gedurende 4 uur, bescherming tegen licht met behulp van een doos bedekt met aluminiumfolie.
- Centrifugeer de microbolletjes Suspension bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten om een pellet te vormen en verwijder het supernatant. Was de microsferen met 500 ul PBS / SDS buffer 3x zoals beschreven in stap 1.5.
- Voeg 200 ul PBS / SDS buffer om de pellet, meng de microsferen goed en breng de oplossing tot 300 ul PBS / SDS buffer die 60 ug invangantilichamen. Het is belangrijk om eerst de pellet van microsferen te schorten en voeg de microsferensuspensie in de antilichaamoplossing.
- Incubeer de antilichaam-microsferen mengsel door schudden bij 1500 rpm gedurende 4 uur op een shaker, beschermen tegen licht met behulp van een doos bedekt met aluminiumfolie.
- Centrifugeer de microsferensuspensie bij 10.000 rpm gedurende 3 minuten om een pellet te vormen en verwijder het supernatant. Was de microsferen met 500 pi StartingBlock (TBS) blokkeringsbuffer 3x, zoals beschreven in stap 1.5.
- Meng microsferen met 1 ml TBS blokkerende buffer en incubeer microsferen bij 1.500 rpm gedurende 1 uur op een shaker, beschermen tegen licht met behulp van een doos inhamrood met aluminiumfolie.
- Centrifugeer de suspensie bij microsfeer 7000 rpm gedurende 3 minuten om een pellet te vormen en verwijder het supernatant. Was de pellet 3x met 500 ul TBS blokkerende buffer, zoals beschreven in stap 1.5.
- Centrifugeer de microsfeer oplossing bij 7000 rpm gedurende 3 minuten om een pellet te vormen en verwijder het supernatant. Voeg 500 ul TBS blokkerende buffer en meng door pipetteren.
- Sla de gewijzigde microbolletje suspensie bij 4 ° C tot gebruik, te beschermen tegen licht.
- Herhaal deze procedure om andere vormen van microsferen met overeenkomstige antilichamen.
3. Glasvezel-microarray Vergadering
- Meng 50 pi van elke soort eiwit-vangst microsferen in een autoclaaf nieuwe microcentrifugebuis. Centrifugeer de voorraad microsferen bundelen bij 7.000 rpm gedurende 3 minuten, en verwijder het supernatant zodat het resterende volume is ongeveer 100 pl.
- Hand-cut vezeloptische bundels tot ongeveer 5 cm in lengte ensequentieel poetsen beide uiteinden op een polijstmachine met behulp 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 en 0,05 micrometer-grote diamant lappen films. Ultrasone trillingen de gepolijste bundel in gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten om alle deeltjes te verwijderen.
- Zet een klein magnetisch roerstaafje in een 0,5 ml microcentrifugebuis, voeg 400 ul van eiwitvrij PBS-buffer en roer op een magnetisch roeren plaat gedurende 30 minuten om luchtbellen te verwijderen.
- Etch ene uiteinde van de gepolijste vezelbundel in een 0,025 N HCl oplossing voor 150 sec 10,16. Onmiddellijk onderdompelen en ultrasone trillingen het geëtst einde in gedeïoniseerd water gedurende 1 minuut. Droog de vezelbundels met perslucht.
- Monteer de vezel bundel op een vezelhouder en blokkeren de geëtst einde in de bubble-free, Proteïnevrije PBS-buffer gedurende 1 uur.
- Borg 1 ui aliquot van de opgeslagen microsferensuspensie op de geëtste einde van de vezeloptische bundel. Bescherm de setup van licht met een doos met aluminiumfolie, en wacht 15 minuten. Het volume van de suspensie zalverlagen door verdamping en de microbolletjes ver in de geëtste microputjes. Herhaal deze belasting stap nog een keer.
- Gebruik een wattenstaafje verzadigd met monster oplossing voor microsferen die niet gevangen zitten in de microwells verwijderen. Het eiwit microarray is nu klaar voor gebruik. Ga onmiddellijk naar stap 4.1 voor speeksel analyse.
4. Speekselsteekproef analyse met behulp van microsferen microarray
- Voeg 200 ul monster-oplossing (100 ul speeksel supernatant verdund met een gelijk volume van StartingBlock T20 (PBS) blokkeringsbuffer. De collectie protocol voor speeksel supernatant reeds eerder is gepubliceerd 10). in een 0,5 ml microcentrifugebuis geautoclaveerd. Dompel het eiwit microarray geladen op de vezel in de oplossing en incubeer op de schudinrichting bij 600 rpm gedurende 2 uur, bescherming tegen licht met een doos bedekt met aluminiumfolie.
- Bereid 20 ml wasbuffer door toevoeging van 200 pl 10% BSA-oplossing en 200 pl 10% Tween-20 in 19,6 ml PBS, mix goed door zachtjes te schudden.
- Dompel de proteïne microarray in een nieuwe autoclaaf microcentrifugebuis met 200 ul wasbuffer en schudden bij 600 rpm gedurende 2 minuten. Herhaal dit 3x wassen.
- Incubeer de microarray in 100 pl oplossing van een detectie-antilichaam cocktail bevattende 5 pg / ml anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, IL-1β gebiotinyleerde detectie antilichamen StartingBlock T20 (PBS) blokkeringsbuffer gedurende 30 min bij kamertemperatuur op de schudinrichting bij 600 rpm, bescherming tegen licht met een doos bedekt met aluminiumfolie.
- Was de microarray 3x met wasbuffer zoals beschreven in stap 4.3.
- Incubeer de microarray in 200 gl 20 ug / ml streptavidine R-fycoerythrine-conjugaat (SAPE) oplossing in PBS bij 600 rpm op de schudinrichting gedurende 10 minuten bescherming tegen licht met een doos bedekt met aluminiumfolie.
- Was de microarray 5x met wasbuffer zoals beschreven in stap 4.3.
- Reinig het distale uiteinde van de vezel (dwz het einde weguit de microsferen) bundelen met een wattenstaafje verzadigd met absolute ethanol.
- Droog beide uiteinden van de vezel met perslucht. Monteer de vezel op epifluorescerende microscoop en beeld door het distale uiteinde van de vezel.
- Acquire microbolletjes beelden die overeenkomen met Eu-TTA, C30, en SAPE fluorescentie-emissie-intensiteiten. Optische filters instellen en belichtingstijden voor fluorescentie beeldvorming van Eu-TTA, C30, en SAPE zijn weergegeven in tabel 2.
| Kanaal | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| Opwekker | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| Beamsplitter | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| Emitter | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| Belichtingstijd | 1 sec | 0.3 sec | 1 sec |
Tabel 2. Parameters voor de drie fluorescerende beelden van de microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescentie beelden van drie kanalen toont een klein gedeelte van de vezel-optische bundel zijn weergegeven in figuren 2A-C. Deze beelden werden geanalyseerd met een algoritme geschreven in MATLAB (zoals in meer detail beschreven in het hoofdstuk discussie). De analyse maakt gebruik van beide informatie van de Eu-TTA afbeelding codering (figuur 2A) en het C30-codering afbeelding (Figuur 2B) aan de microsferen decoderen, en de fluorescentie-intensiteiten van verschillende microsferen het signaal afbeelding (figuur 2C) in werden berekend. Met de kalibratiekromme verkregen gecorreleerde eiwitstandaarden werden de concentraties van proteïnen in speeksel monsters berekend.
Figuur 2. (A) het Eu-TTA-codering, (B) het C30-codering, (C) image SAPE signaal (D) decodeerresultaats overlapt beeld het signaal op, verschillende soorten microsferen werden gemerkt met verschillende kleuren en vormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoekers moeten extra aandacht besteden aan de volgende stappen: voor betere nauwkeurigheid decoderen, is het noodzakelijk te controleren of de microsferen werden homogeen gesuspendeerd in alle incubatie en wassen stappen tijdens de microsferen coderingsprocedure. Bovendien moeten de gecodeerde microbolletjes worden beschermd tegen licht gedurende het gehele experiment. Na juiste codering en opslagprocedures, vonden we dat algehele nauwkeurigheid decoderen was boven 99%. De gecodeerde microsferen moet worden bewaard bij 4 ° C. Vermijd bevriezen en bescherming tegen licht. Onder de juiste bewaarcondities, de gecodeerde microsferen zijn stabiel gedurende meer dan zes maanden. Uiterste zorg is vereist tijdens het coderen en modificatiestappen het verlies van microsferen te verminderen. Bijvoorbeeld, de pellet van microsferen niet storen bij het verwijderen van supernatant. Bovendien, zoals Tween-20 en SDS in de buffers is essentieel voor een betere microsfeer pelleteren.
Sommige of gemeenschappelijke probleemoplossingsprocedures zijn: (1) alleen vers bereide oplossing EDC en EDC oplossing moet druppelsgewijs toegevoegd, (2) geautoclaveerd buizen moeten worden gebruikt en de microsferen oplossing dient in een nieuwe buis voor elke incubatiestap worden overgedragen ( 3) tijdens elke wasstap, probeer het supernatant te verwijderen zoveel mogelijk, (4) de gewijzigde microsferen moet bij 4 ° C worden bewaard, bevriezing te voorkomen en bescherming tegen licht. Onder de juiste bewaaromstandigheden, kan de gewijzigde microsferen worden opgeslagen voor meer dan 3 maanden geen detecteerbaar signaal verlies.
De MATLAB algoritme gebruikt om de fluorescentie analyseren van beelden wordt hieronder kort beschreven. De relevante code is te vinden in aanvullend materiaal. Pixels binnen een door de gebruiker gedefinieerde intensiteit bereik voor het imago van de Eu-TTA worden eerst gefilterd. Verschillende gebieden werden gecontroleerd met een grootte-filter, gebieden met een "hol" centrum veroorzaakt door licht demping werden verwijderd en gebieden waarmicrobolletjes aanwezig zijn, zijn gesorteerd in een watch list voor verdere verwerking. Alle microsferen uit de watch list werden verder gefilterd met reacties in de bijbehorende afbeelding C30. De signalen van alle pixels van een bepaalde microbolletjes werden gemiddeld. De signaalsterkte van deze microsferen van de rente werd berekend door het gemiddelde van de intensiteiten van alle microsferen in de watch list. Om de resultaten statistisch representatiever te maken, een minimum van 25 microsferen van elk type nodig was. Om de niet-specifieke signaal te minimaliseren en de variatie tussen verschillende experimenten verlagen, werden signalen voor alle microbolletje genormaliseerd door het aftrekken van het signaal van het controle-microsferen.
Het signaal respons van de microsferen kan worden aangepast door de hoeveelheid antilichamen geïmmobiliseerd op het oppervlak van de microsferen, die ideaal is voor gemultiplexte detectie van eiwitten met een breed bereik van concentraties. Op basis van verschillende diameters van de microsferen, tHij hoeveelheid antilichaam nodig is om een monolaag te vormen op de microsferen kan worden geschat door vergelijking van de fabrikant 17. Voor microsferen met een diameter van 4,5 pm, 3 ug antilichaam is vereist per 1 mg van microsferen. We hebben verschillende hoeveelheden antilichaam getest in de koppelingsoplossing in stap 2.8 van 3 ug (0,5 x) tot 60 ug (10x) antilichaam. Verhoogde signalen waargenomen wanneer meer antilichaam werd gebruikt in de oplossing. Optimale antilichaam bedragen voor verschillende antilichamen en toepassingen moet proefondervindelijk worden bepaald. De "controle-microsferen" gekoppeld met de muis isotype IgG-antilichaam dat wordt geleverd door de fabrikant als negatieve controle in directe ELISA en werd geen kruisreactiviteit met maximaal 40 recombinante menselijke eiwitten 18. Om de reproduceerbaarheid van de koppelingswerkwijze evalueren, werden twee charges van MMP-9 gekoppelde microsferen op verschillende dagen. De prestatie van de microsferen werd getest met multiplexed detectie van 10 ng / ml MMP-9. De resultaten toonden geen significante verschillen tussen de verschillende partijen van microbolletjes (gedetailleerde resultaten worden in Tabel 3).
| Geen | Datum | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Gemiddelde | Std |
| 1 | 01/12/2011 | 773,8 | 690,1 | 756,8 | 740,2 | 44.2 |
| 2 | 01/26/2011 | 791,9 | 721,8 | 867,0 | 793,6 | 72.6 |
Tabel 3. Reproduceerbaarheid van de koppelingswerkwijzen (resultaten getoond in willekeurige eenheden).
De multiplex hier gepresenteerde methode zorgt voor een snelle, nauwkeurige en reproduceerbareanalyse van verschillende eiwitten over een breed concentratiebereik (in Tabel 4 opgesomde resultaten). De potentiële kruisreactiviteit voor de zes antilichaamparen we in deze studie werd ook getest. Alle signalen van cross-reactiviteit bleken verwaarloosbaar (minder dan 3%) te zijn. Andere voordelen van deze werkwijze, in vergelijking met een conventionele Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omvatten een breed dynamisch bereik, minimale niet-specifieke interacties, verminderd monster en goedkope 10. De vereiste hoeveelheid speeksel monster zo laag als 100 ul en de assay kan worden voltooid binnen 3,5 uur. In vergelijking met andere ophanging arrays, een beperking van deze benadering is dat zodra de microarray werd geassembleerd, de detectie moet in minder dan 15 minuten te starten. De hier beschreven methode is gebruikt in ons lab speeksel monsters van patiënten met ontstekingsziekten en gezonde controles (ongepubliceerde gegevens) te analyseren. Het oog op toepasbaarheidvoor eiwitanalyse andere complexe monsters fluïdum. Een soortgelijke microbolletjes eiwitten array worden gebruikt op andere platforms, zoals microfluïdische inrichtingen. Het coderen en geïmmobiliseerde methoden kunnen ook worden toegepast om microsferen te maken met andere materialen 9.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| Test 1 | 5365,9 | 2578,4 | 6508,7 | 2584,0 | 515,5 | 1147,4 |
| Test 2 | 5787,8 | 2577,9 | 7238,9 | 2919,2 | 375,7 | 1099,2 |
| Test 3 | 4944,6 | 2883,3 | 6726,3 | 3619,3 | 406.8 | 1084,1 |
| Gemiddelde | 5366,1 | 2679,9 | 6824,6 | 3040,8 | 432,7 | 1110,2 |
| Std. Dev | 421.6 | 176.2 | 374,9 | 528,3 | 73.4 | 33.1 |
Tabel 4. Resultaten voor de drie onafhankelijke proeven op hetzelfde speekselsteekproef (resultaten getoond in willekeurige eenheden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (subsidie 08UDE017788-05). EBP erkent ook steun van de Spaanse Stichting voor Wetenschap en Technologie (FECYT). De auteurs danken Shonda T. Gaylord en Pratyusha Mogalisetti voor kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R.
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R.
- Schena, M. Protein Microarrays. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).
- Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from: http://www.rndsystems.com/Products/MAB002 (2013).
