Summary
אנו מתארים הליך לאפיון חלבוני רוק באמצעות מערכי נוגדנים מבוססי microsphere מרובבים. נוגדנים חד שבטיים היו קשורים קוולנטית ל4.5 מיקרומטר זעירים מפולימר ניאון בקידוד צבע באמצעות הכימיה carbodiimide. Microspheres שונה הופקד בmicrowells סיבים אופטיים כדי למדוד את רמות חלבון ברוק באמצעות immunoassays כריך הקרינה.
Abstract
בזאת, אנו מתארים פרוטוקול למדידה בו זמנית שישה חלבונים המצויים ברוק באמצעות מערך נוגדנים מבוסס microsphere סיבים אופטיים. הטכנולוגיה חיסונית המערך מועסק משלבת את היתרונות של ייצור מערך השעיה מבוסס microsphere עם השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כפי שתואר בפרוטוקול הווידאו, זעירים מפולימר 4.5 מיקרומטר זמין מסחרי היו מקודד לשבעה סוגים שונים, הנבדלים בריכוז של שני צבעי ניאון לכודים פיזי בתוך זעירים. Microspheres המקודד המכיל קבוצות carboxyl פני השטח שונו עם נוגדנים חד שבטיים ללכידה דרך הכימיה צימוד EDC / NHS. כדי להרכיב את microarray החלבון, הסוגים השונים של זעירים ממקודדים ופונקציונלית היו מעורבים ושהופקדו באופן אקראי ב4.5 מיקרומטר microwells, שנחרתו כימיים בקצה הפרוקסימלי של צרור סיבים אופטיים. צרור סיבים האופטיים שימש גם כמוביל והדמיה מ 'icrospheres. לאחר הרכבה, microarray שימש כדי ללכוד חלבונים בsupernatant הרוק שנאסף מהמרפאה. זיהוי התבסס על immunoassay כריך באמצעות תערובת של נוגדנים לזיהוי biotinylated לanalytes שונה עם בדיקה ניאון streptavidin מצומדות, R-phycoerythrin. Microarray היה צילם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלושה ערוצים שונים, שני לרישום microsphere ואחת לאות assay. Micrographs הקרינה אז היו מפוענח ונותח באמצעות אלגוריתם תוצרת בית בMATLAB.
Introduction
מאז microarray הראשון שדווח על ידי מארק Schena ועמיתים לעבודה באמצע 1990, כלי רב עוצמה זה נוצל בתחומים רבים של מחקר ביולוגי 1. microarrays נוגדנים המסוגל בו זמנית גילוי חלבונים רבים בנוזלי אבחון, כגון דם, יש יישומים חשובים באבחון קליני והקרנת סמן 2-10. רוק, המכיל רבים מאותו analytes כמו דם, כבר נחשב כחלופה עדיפה על דם בגלל אוסף רוק הוא בטוח, לא פולשנית, ויכול להתבצע על ידי אנשי צוות רפואיים מאומנים מינימאלי 11-13. נכון לעכשיו, ניתוח חלבון מרובב באמצעות דגימות רוק הוא מוגבל על ידי מספר גורמים חשובים, כוללים הריכוז הנמוך של חומר אנליטי יעד 14 וטווח הריכוז הרחב של סמנים ביולוגיים שונים 15.
.בזאת, אנחנו מדגימים את הניתוח של שישה חלבונים: גורם אנושי אנדותל כלי דם צמיחה (VEGF), חלבון מושרה אינטרפרון גאמא 10, metallopeptidase מטריצה 9 (MMP-9), ובטא interleukin-1 (IP-10, interleukin-8 (IL-8), גורם הגדילה באפידרמיס) (EGF) (IL-1β) . הביצועים של השיטה בתחילה אומת באמצעות פתרונות סטנדרטיים המהווים חלבוני אנליטי רקומביננטי וחסימת מאגר. דגימות רוק אמיתיות שנאספו מחולים במחלות נשימה כרוניות שונות, כמו גם ביקורת בריאה נבדקו גם עם ביצועים משביעי רצון. הפרוטוקול צריך להיות ישים analytes חלבון אחר ומבוסס מבחני microsphere אחרים. פלטפורמה זו מציעה יתרונות משמעותיים בתחום הכימיה אנליטית כפי שהיא מאפשרת ניתוח סימולטני מהיר, מדויק, ושחזור של ריכוזים נמוכים של כמה חלבונים עם מגוון רחב דינמי, אינטראקציות לא ספציפיים מינימליות, צריכת מדגם מופחתת, ועלות נמוכה בהשוואה ל Assay הצמוד אנזימים מקבילים immunosorbent (ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
איור 1. . זרימת עבודה ליישום מערך נוגדני microsphere סיבים אופטיים לאפיון רוק (1) מיקרוסכמות מקודדות באופן פנימי עם שני צבעי ניאון, (2) זעירים המקודדים משתנים חיצוני עם נוגדנים חד שבטיים חלבון ספציפי; (3) זעירים מהריבוב מעורבב, ו (4) שהופקד באופן אקראי בmicrowells חרוט בקצה הפרוקסימלי של צרור סיבים אופטיים; (5) חלבוני רוק הם נתפסו על ידי זעירים דרך immunoassay כריך, ו( 6) לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
1. קידוד מיקרוסכמות
- שוקל אירופיום נתרן (III) thenoyltrifluoroacetonate trihydrate (EU-TTA, MW = 869.54 g / mol) בבקבוקון זכוכית בצבע ענבר ולהכין פתרון מניות 200 מ"מ בtetrahydrofuran (THF). מערבבים בעדינות על ידי pipetting; חזותי לאמתהצבע הוא נמס לגמרי.
- שוקל coumarin 30 (C30, MW = 347.41 g / mol) בבקבוקון זכוכית בצבע ענבר ולהכין פתרון מניות 12 מ"מ בTHF. מערבבים בעדינות על ידי pipetting; ויזואלית לאמת את הצבע הוא נמס לגמרי.
- הכן 700 μl של פתרון עובד לכל סוג microsphere באמצעות פתרונות המניות וTHF להגיע ריכוז סופי מפורט בטבלה 1.
- ודא זעירים (10% w / v) מושעים גם על ידי vortexing, ולאחר מכן להעביר 60 השעיה μl לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר.
- הוספת 600 μl PBS להשעיה microsphere ומערבבים על ידי pipetting 20x. צנטריפוגות הצינור ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant בזהירות. חזור על תהליך זה 2x אחר לשטוף זעירים.
- לשטוף 3x גלולה microsphere עם THF באמצעות הליך דומה כצעד 1.5.
- צנטריפוגה ההשעיה microsphere / THF ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות, להסיר את supernatant, מחדש להשעות גלולה ב 600 μlפתרון עובד מפורט בטבלה 1. מעבירים את התערובת לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר חדש.
- לאטום צינור microcentrifuge עם Parafilm ולמקם אותו על שייקר. לנער ב3,000 סל"ד ו דגירה של 24 שעות, להגן מפני אור על ידי כיסוי ההתקנה באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
- צנטריפוגה ההשעיה microsphere ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות לצורה כדורית.
- הסר את פתרון צבע supernatant, לשטוף זעירים מ6X עם 600 מתנול μl ולאחר מכן עם 600 μl PBS המכיל Tween-20 0.01% נוספים 6x, כמתואר בשלב 1.5.
- אחסן את microspheres המקודד ב600 μl PBS המכיל Tween-20 0.01% על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, להגן מפני אור.
| שם סוג microsphere: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Eu-TTA (מ"מ) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (מ"מ) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
טבלת 1. ריכוזים של האיחוד האירופי-TTA וC30 עובדים פתרונות.
2. הכנת מיקרוסכמות חלבון ללכוד
- הכן MES חיץ [2 - חומצה (N-morpholino) ethanesulfonic (MES) 0.1 M, NaCl 0.9%, SDS 0.01%, pH 5.7] וחיץ PBS / SDS (סודיום פוספט 0.01 M, NaCl 0.154 M, SDS 0.01%, ה-pH 7.4) מראש בטמפרטורת חדר.
- הוסף 200 μl השעיה מקודדת microsphere (המכילה זעירים ~ 2 מ"ג) לתוך צינור 1.5 microcentrifuge מיליליטר בטוח-Lock. חשוב להשתמש בסוג זה של צינור microcentrifuge כדי למנוע דליפה במהלך הדגירה בשלב 2.6. <li> לשטוף זעירים עם MES 600 μl חיץ 3x כמתואר בשלב 1.5. הוסף 700 MES μl לגלולת microsphere ומערבבים היטב על ידי pipetting.
- הכן 0.105 גר '/ מיליליטר 1-אתיל-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide הידרוכלוריד (EDC, MW = 191.7 g / mol) ו0.163 sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide גר' / מיליליטר (sulfo-NHS, MW = 217.13 g / mol) פתרונות במאגר MES בצינורות נפרדים.
- הוסף 150 μl מוכן טרי טיפת פתרון EDC אחרת טיפה לתוך ההשעיה microsphere. EDC hydrolyzes מהר מאוד, ולכן הוא חיוני לשימוש פתרון טרי על מנת להבטיח את יעילות הקיבוע. מייד לאחר התוספת של EDC, להוסיף פתרון sulfo-NHS 150 μl לזעיר, ומערבב היטב על ידי pipetting ולאמת את ההשעיה היא הומוגנית.
- שווי הצינור, לאטום אותו עם Parafilm, ולמקם אותו על שייקר. לנער ב1,500 סל"ד 4 שעות, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
- צנטריפוגה suspens microsphereיון ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות כדי ליצור גלולה ולהסיר את supernatant. שטוף זעירים עם 3x חיץ 500 μl PBS / SDS כפי שמתואר בשלב 1.5.
- הוסף 200 μl חיץ PBS / SDS לגלולה, ומערבב היטב זעירים ולהעביר את הפתרון ל300 μl חיץ PBS / SDS המכיל 60 נוגדנים ללכוד מיקרוגרם. חשוב להשעות את גלולה microsphere הראשונה ולאחר מכן להוסיף את ההשעיה microsphere לתוך תמיסת הנוגדן.
- דגירה את תערובת נוגדנים זעירים על ידי הטלטול ב1,500 סל"ד במשך 4 שעות על שייקר, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
- צנטריפוגה ההשעיה microsphere ב 10,000 סל"ד במשך 3 דקות כדי ליצור גלולה ולהסיר את supernatant. שטוף זעירים עם StartingBlock μl 500 (TBS) חסימת 3x חיץ, כמתואר בשלב 1.5.
- מערבבים זעירים עם 1 מיליליטר של TBS חיץ חסימת דגירה זעירים ב1,500 סל"ד עבור שעה 1 על שייקר, להגן מפני אור באמצעות מפרצון תיבהאדום עם רדיד אלומיניום.
- צנטריפוגה ההשעיה microsphere ב7,000 סל"ד למשך 3 דקות כדי ליצור גלולה ולהסיר את supernatant. לשטוף 3x גלולה עם 500 TBS μl חסימת חיץ, כמתואר בשלב 1.5.
- צנטריפוגה פתרון microsphere ב7,000 סל"ד למשך 3 דקות כדי ליצור גלולה ולהסיר את supernatant. הוסף 500 TBS μl חסימת חיץ ומערבבים על ידי pipetting.
- אחסן את ההשעיה microsphere הותאם על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש, להגן מפני אור.
- חזור על תהליך זה כדי להפוך סוגים אחרים של זעירים באמצעות נוגדנים מתאימים.
3. Microarray עצרת סיבים אופטיים
- מערבבים 50 μl של כל סוג של החלבון זעירים מללכוד לתוך צינור microcentrifuge autoclaved חדש. צנטריפוגה המניה זעירים מהברכה ב7,000 סל"ד למשך 3 דקות, ולהסיר את supernatant, כך שהנפח הנותר הוא כ 100 μl.
- חבילות יד לחתוך סיבים אופטיים לכ 5 סנטימטר באורך ורצף ללטש את שני הקצוות במכונת ליטוש באמצעות 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0.5, ו0.05 יהלומים מיקרומטר בגודל מלחך סרטים. Sonicate החבילה המלוטשת במי deionized במשך 2 דקות כדי להסיר את כל חלקיקים.
- שים הבר ערבוב מגנטי קטן לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מיליליטר, להוסיף 400 μl של PBS ללא חלבון חיץ ומערבבים על צלחת ערבוב מגנטית ל30 דקות כדי להסיר בועות אוויר.
- לחרוט קצה אחד של צרור סיבים המלוטש בפתרון 0.025 N HCl ל150 שניות 10,16. מייד לצלול וsonicate הסוף חרוט במים deionized דקות 1. ייבש את צרורות סיבים עם אוויר דחוס.
- הר צרור סיבים על בעל סיבים ולחסום את הקצה חרוט ב, PBS החיץ נטול חלבון ללא בועה במשך שעה 1.
- aliquot μl הפקדת 1 של ההשעיה microsphere מאוחסן על הקצה חרוט של צרור הסיבים אופטיים. הגן על ההתקנה מהאור עם תיבה בנייר אלומיניום, ולחכות ל15 דקות. הנפח של ההשעיה תהיהלהקטין על ידי אידוי ולאלץ זעירים לתוך microwells חרוט. חזור על שלב טעינה זה עוד פעם אחת.
- השתמש במטלית ספוגה בתמיסת מדגם להסיר זעירים שאינם לכודים בmicrowells. Microarray החלבון מוכן לשימוש כעת. תלך מייד לשלב 4.1 לניתוח רוק.
4. ניתוח דגימת רוק באמצעות Microarray מיקרוסכמות
- הוסף 200 פתרון מדגם μl (100 supernatant רוק μl מדולל עם נפח שווה של StartingBlock T20 (PBS) חסימת חיץ. פרוטוקול האוסף לsupernatant רוק כבר פורסם בעבר 10). לתוך צינור microcentrifuge autoclaved 0.5 מיליליטר. טובלים את microarray החלבון טעון בסיבים לתוך התמיסה ולדגור על שייקר ב600 סל"ד במשך 2 שעות, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
- הכן 20 מיליליטר לשטוף חיץ על ידי הוספת 200 μl 10% פתרון BSA ו200 μl 10% 20-Tween ל19.6 מיליליטר PBS, mix גם בעדינות על ידי רועד.
- טובלים את microarray החלבון לתוך צינור microcentrifuge autoclaved חדש המכיל 200 לשטוף חיץ μl ולנער ב600 סל"ד במשך 2 דקות. חזור על לשטוף 3x זה.
- דגירה microarray ב100 פתרון μl של קוקטייל של נוגדנים לזיהוי המכיל 5 מיקרוגרם / מיליליטר של אנטי VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, נוגדני זיהוי biotinylated IL-1β בStartingBlock T20 (PBS) חסימת חיץ ל30 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר ב600 סל"ד, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
- לשטוף 3x microarray עם לשטוף חיץ כמתואר בשלב 4.3.
- דגירה microarray ב200 μl של מיקרוגרם / המצומד R-phycoerythrin streptavidin מיליליטר (SAPE) פתרון 20 PBS ב 600 סל"ד על שייקר ל10 דקות, להגן מפני אור באמצעות תיבה מכוסות בנייר אלומיניום.
- שטוף את 5x microarray עם לשטוף חיץ כמתואר בשלב 4.3.
- נקה את הקצה הדיסטלי של הסיבים (כלומר, הסוף משםמהזעיר מ) צרור עם ספוגית רוויה עם אתנול מוחלט.
- ייבש את שני הקצוות של הסיבים עם אוויר דחוס. הר את הסיבים במיקרוסקופ epifluorescent ותדמית באמצעות הקצה הדיסטלי של הסיבים.
- לרכוש תמונות microsphere המקבילות לאיחוד האירופי-TTA, C30, ועוצמות פליטת הקרינה SAPE. התקנת מסננים אופטיים וזמני חשיפה לדימות פלואורסצנטי של האיחוד האירופי-TTA, C30, וSAPE מתוארים בטבלה 2.
| ערוץ | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| Exciter | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| Beamsplitter | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| פולט | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| זמן חשיפה | 1 שניות | 0.3 שניות | 1 שניות |
טבלה 2. פרמטרים לשלוש תמונות הניאון של microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות הקרינה משלושה ערוצים מראים קטע קטן של צרור סיבים האופטיים מוצגות איורים 2A-C. תמונות אלה נותחו באמצעות אלגוריתם שנכתב ב MATLAB (כפי שמתוארת בפירוט רב יותר בסעיף הדיון). הניתוח מעסיק גם מידע מתמונת Eu-TTA הקידוד (איור 2 א) ואת תמונת קידוד C30 (איור 2) כדי לפענח זעירים, ועוצמות הקרינה של microspheres שונה בתמונה האות (איור 2C) חושבו. עם עקומות הכיול המתקבלות מסטנדרטים חלבון מתואמים, הריכוזים של חלבונים בדגימות רוק חושבו.
איור 2. (א) תמונת קידוד Eu-TTA, תמונת קידוד C30, תמונת אות SAPE (C), תוצאת פענוח (ד) (ב)של חפיפה על תמונת האות; סוגים שונים של microspheres תויגו עם צבעים וצורות שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חוקרים צריכים לשים לב במיוחד לשלבים הבאים: לדיוק פענוח טוב יותר, יש צורך לאמת את microspheres הושעו הומוגנית בכל הדגירה ולשטוף צעדים במהלך הליך הקידוד זעירים. בנוסף, זעירים מהמקודדים צריכים להיות מוגן מפני אור לאורך כל הניסוי. לאחר תהליכי קידוד והאחסון נאותים, מצאנו כי דיוק פענוח כולל היה מעל 99%. יש לאחסן זעירים ממקודד ב 4 ° C. הימנע מהקפאה ולהגן מפני אור. בתנאי אחסון נאותים, זעירים מהמקודדים הם יציבים במשך יותר משישה חודשים. זהירות רבה נדרשת במהלך שלבי קידוד ושינוי כדי לצמצם את אובדן זעירים. לדוגמא, לא להפריע גלולה microsphere בעת הסרת supernatant. בנוסף, כוללים Tween-20 וSDS במאגרים חיוני לpelleting microsphere טוב יותר.
o חלקו הליכי פתרון הבעיות הנפוצים הם: (1) שימוש פתרון EDC רק מוכן טרי ופתרון EDC יש להוסיף dropwise, (2) יש להשתמש בצינורות autoclaved ופתרון microsphere יש להעביר לתוך צינור חדש לפני כל שלב דגירה, ( 3) במהלך כל שלב לשטוף, נסה להסיר את supernatant ככל האפשר, (4) זעירים שונה צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, להימנע מההקפאה ולהגן מפני אור. בתנאי אחסון נאותים, זעירים שונה יכולה להיות מאוחסן במשך יותר מ -3 חודשים ללא איבוד אות לזיהוי.
אלגוריתם MATLAB משמש כדי לנתח את תמונות הקרינה מתואר בקצרה להלן. ניתן למצוא את הקוד הרלוונטי בחומרים משלימים. פיקסלים בטווח עוצמת משתמש מוגדר לתמונת האיחוד האירופי-TTA מסוננים ראשון. אזורים שונים נבדקו עם גודל מסנן, אזורים המכילים מרכז "חלול" שנגרם על ידי הנחתה אור הוסרו ואזורים שבםזעירים מנוכחים מוינו לרשימת מעקב לעיבוד עתידי. כל זעירים מרשימת המעקב סוננו עוד יותר עם תגובות בתמונה C30 המתאימה. האותות לכל הפיקסלים של microsphere מסוים היו ממוצעים. עוצמת האות של microsphere זה של ריבית מחושבת על ידי חישוב ממוצע של כל העוצמות זעירים ברשימת המעקב. כדי להפוך את התוצאות סטטיסטית מייצגות יותר, נדרש מינימום של 25 זעירים מכל סוג. כדי למזער את האות ספציפיות ולהקטין את השונות בין ניסויים שונים, אותות לכל סוגי microsphere היו מנורמלים על ידי הפחתת האות מזעירה מכלל השליטה.
תגובת האות של זעירים יכולה להיות מותאמת על ידי כמות הנוגדנים משותקת על פני השטח של זעירים, אשר הינה אידיאלי עבור גילוי ריבוב של חלבונים עם טווח רחב של ריכוזים. בהתבסס על קטרים שונים של זעירים, לאהוא כמות הנוגדנים הנדרשים ליצירת monolayer על זעירים יכול להיות מוערכת על ידי המשוואה מהיצרן 17. לזעיר בקוטר של 4.5 מיקרומטר, 3 מיקרוגרם של נוגדנים נחוצים לכל 1 מ"ג של זעירים. אנחנו צריכים לבדוק את כמויות נוגדנים שונות בפתרון הצימוד בשלב 2.8 מ3 מיקרוגרם (0.5x) ל60 מיקרוגרם (10x) של נוגדן. אותות מוגבר נצפו כאשר יותר נוגדנים היו בשימוש בפתרון. כמויות נוגדן אופטימליות לנוגדנים ויישומים שונים חייבים להיקבע באופן ניסיוני. "זעירים מהשליטה" היו בשילוב עם נוגדני IgG אלוטיפ העכבר, אשר סופקו על ידי היצרן כביקורת השלילית בELISA הישיר ולא הראה תגובתיות צולבת עם עד 40 חלבונים אנושיים רקומביננטי 18. כדי להעריך את שחזור של שיטת הצימוד, שתי קבוצות של MMP-9 זעירים היו מצמידים בימים שונים. הביצועים של זעירים נבדקו על ידי שימוש multiplexeגילוי ד של 10 ng / ml MMP-9. התוצאות לא הראו הבדלים משמעותיים בין קבוצות שונות של זעירים (תוצאות מפורטות מוצגות בלוח 3).
| לא | תאריך | מבחן 1 | מבחן 2 | מבחן 3 | ממוצע | Std |
| 1 | 01/12/2011 | 773.8 | 690.1 | 756.8 | 740.2 | 44.2 |
| 2 | 01/26/2011 | 791.9 | 721.8 | 867.0 | 793.6 | 72.6 |
לוח 3. שחזור של שיטות הצימוד (תוצאות מוצגות ביחידות שרירותיות).
שיטת הריבוב מוצגת כאן מאפשרת מהירה, מדויקת, ולשעתקניתוח של חלבונים שונים על פני טווח ריכוז רחב (תוצאות מפורטות בטבלה 4). תגובתיות הצולבת הפוטנציאל לששת זוגות הנוגדן ששמשנו במחקר זה נבדק גם. כל האותות מתגובתיות צולבת נמצאו להיות זניחים (פחות מ -3%). יתרונות נוספים של שיטה זו, בהשוואה לAssay קונבנציונלי צמוד אנזים immunosorbent (ELISA), כוללים מגוון רחב דינמי, אינטראקציות לא ספציפיות מינימליות, צריכת מדגם מופחתת ועלות נמוכה 10. הנפח הנדרש של דגימת רוק הוא נמוך כמו 100 μl וassay יכול להסתיים בתוך 3.5 שעה. בהשוואה למערכי השעיה אחרים, מגבלה אחת של גישה זו היא שברגע microarray הורכב, זיהוי צריכה להיות נכתבו בפחות מ 15 דקות. השיטה המתוארת כאן נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לנתח דגימות רוק אדם שנאספו מחולים עם מחלות דלקתיות וביקורת בריאה (נתונים שלא פורסמו). השיטה צריכה להיות ישימהלניתוח חלבונים של דגימות נוזל מורכבות אחרות. מערך חלבונים המבוסס על microsphere דומה ניתן להשתמש בפלטפורמות אחרות כגון התקני microfluidic. הקידוד והשיטות משותקים גם יכולים להיות מיושמים על זעירים שנעשה עם חומרים אחרים 9.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| מבחן 1 | 5365.9 | 2578.4 | 6508.7 | 2584.0 | 515.5 | 1147.4 |
| מבחן 2 | 5787.8 | 2577.9 | 7238.9 | 2919.2 | 375.7 | 1099.2 |
| מבחן 3 | 4944.6 | 2883.3 | 6726.3 | 3619.3 | 406.8 | 1084.1 |
| ממוצע | 5366.1 | 2679.9 | 6824.6 | 3040.8 | 432.7 | 1110.2 |
| Std. Dev | 421.6 | 176.2 | 374.9 | 528.3 | 73.4 | 33.1 |
לוח 4. תוצאות עבור שלוש בדיקות עצמאיות על אותה דגימת הרוק (תוצאות מוצגות ביחידות שרירותיות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק 08UDE017788-05). EBP גם מכיר תמיכת הקרן הספרדית למדע וטכנולוגיה (FECYT). המחברים מודים שונדה ט גיילורד וPratyusha Mogalisetti לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R.
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R.
- Schena, M. Protein Microarrays. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).
- Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from: http://www.rndsystems.com/Products/MAB002 (2013).
