Summary
Descriviamo una procedura per la profilatura proteine salivari utilizzo di matrici di anticorpi a base di microsfere-multiplex. Gli anticorpi monoclonali sono stati legati covalentemente a colorante fluorescente con codifica 4.5 micron microsfere polimeriche utilizzando la chimica carbodiimmide. Le microsfere modificati sono stati depositati in pozzetti in fibra ottica per misurare i livelli di proteine nella saliva mediante saggi immunologici panino fluorescenza.
Abstract
Qui, si descrive un protocollo per misurare simultaneamente sei proteine nella saliva utilizzando una matrice anticorpo basato microsfere fibra ottica. La tecnologia immuno-array impiegato unisce i vantaggi di base microsfere sospensione matrice fabbricazione con l'uso della microscopia a fluorescenza. Come descritto nel protocollo video, disponibili in commercio microsfere polimeriche 4,5 micron sono stati codificati in sette tipi diversi, differenziati per la concentrazione di due coloranti fluorescenti fisicamente intrappolati all'interno delle microsfere. Le microsfere codificati contenenti gruppi carbossilici superficiali sono stati modificati con anticorpi monoclonali di cattura attraverso EDC / NHS chimica di accoppiamento. Per assemblare il microarray di proteine, i diversi tipi di microsfere codificati e funzionalizzati sono stati mescolati e depositati in modo casuale in 4,5 micron pozzetti, che sono state incise chimicamente in corrispondenza dell'estremità prossimale di un fascio di fibre ottiche. Il fascio di fibre ottiche è stato utilizzato sia come vettore per l'imaging e la microspheres. Una volta assemblato, il microarray è stata utilizzata per catturare proteine nel supernatante saliva raccolti dalla clinica. Il rilevamento è basata su un immunodosaggio a sandwich utilizzando una miscela di anticorpi biotinilati rilevamento per diversi analiti con una sonda fluorescente streptavidina coniugata, R-ficoeritrina. Il microarray è stato ripreso al microscopio a fluorescenza in tre diversi canali, due per la registrazione microsfere e uno per il segnale di test. Le micrografie fluorescenza sono stati poi decodificati e analizzati utilizzando un algoritmo in casa in MATLAB.
Introduction
Dal primo microarray riportato da Mark Schena e colleghi nella metà degli anni 1990, questo potente strumento è stato utilizzato in molti campi della ricerca biologica 1. Microarray anticorpo in grado di rilevare simultaneamente molteplici proteine nei fluidi diagnostici, come il sangue, hanno importanti applicazioni in diagnostica clinica e biomarker di screening 2-10. Saliva, che contiene molti degli stessi analiti come sangue, è stato considerato come un'alternativa preferibile al sangue poiché la raccolta saliva è sicuro, non invasivo, e può essere effettuata da minimamente addestrato personale medico 11-13. Attualmente, l'analisi delle proteine multiplex utilizzando campioni di saliva è limitata da diversi fattori importanti, tra cui la bassa concentrazione di analita bersaglio 14 e l'ampia gamma di concentrazione di diversi biomarker 15.
.Qui, dimostriamo l'analisi di sei proteine: fattore di crescita vascolare endoteliale umana (VEGF), proteina interferone gamma-indotta 10 (IP-10), interleuchina-8 (IL-8), fattore di crescita epidermico (EGF), metallopeptidasi matrice 9 (MMP-9), interleuchina-1 beta (IL-1β) . Le prestazioni del metodo è stata inizialmente verificata utilizzando soluzioni standard costituendo proteine ricombinanti analiti e tampone di bloccaggio. Campioni di saliva reali raccolti dai pazienti di diverse malattie respiratorie croniche nonché controlli sani sono stati anche testati con prestazioni soddisfacenti. Il protocollo dovrebbe essere applicabile ad altri analiti proteici e altri saggi a base di microsfere. Questa piattaforma offre notevoli vantaggi nel campo Analytical Chemistry quanto consente rapido, preciso e riproducibile analisi simultanea di basse concentrazioni di diverse proteine con un'ampia gamma dinamica, minime interazioni non specifiche, consumi campione ridotto e basso costo rispetto ad un analogo immunoenzimatici Assay (ELISA).
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Protocol
Figura 1. . Flusso di lavoro per l'applicazione matrice anticorpo microsfere fibra ottica alla saliva profiling (1) Microsfere sono codificati internamente con due coloranti fluorescenti, (2) le microsfere sono codificati esternamente modificate con anticorpi monoclonali specifici per proteine, (3) le microsfere multiplati sono mescolati, e (4) depositati in modo casuale in micropozzetti incise in corrispondenza dell'estremità prossimale di un fascio di fibre ottiche; (5) proteine salivari sono catturati da microsfere mediante immunodosaggio a sandwich, e (6) quantificati tramite microscopia a fluorescenza.
1. Microsfere Codifica
- Pesare europio sodio (III) thenoyltrifluoroacetonate triidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) in un flaconcino di vetro ambrato e preparare una soluzione stock di 200 mm in tetraidrofurano (THF). Mescolare delicatamente pipettando; verificare visivamenteil colorante è completamente sciolto.
- Pesare cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) in un flaconcino di vetro ambrato e preparare una soluzione madre di 12 mm in THF. Mescolare delicatamente pipettando, verificare visivamente il colorante è completamente sciolto.
- Preparare 700 ml di soluzione di lavoro per ogni tipo di microsfere utilizzando le soluzioni madre e THF e raggiungere la concentrazione finale elencati nella Tabella 1.
- Garantire microsfere (10% w / v) sono ben sospesi con vortex, e quindi trasferire 60 microlitri di sospensione in una provetta da 1,5 ml.
- Aggiungere 600 microlitri di PBS alla sospensione microsfere e mescolare pipettando 20x. Centrifugare la provetta a 10.000 rpm per 3 minuti e rimuovere con cura il supernatante. Ripetere questo processo un altro 2x per lavare le microsfere.
- Lavare il pellet microsfere 3x con THF utilizzando una procedura simile a passo 1.5.
- Centrifugare la sospensione di microsfere / THF a 10.000 rpm per 3 minuti, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 600 microlitriSoluzione di lavoro elencati nella tabella 1. Trasferire il composto in una nuova provetta 1,5 ml.
- Sigillare la provetta con Parafilm e metterlo su un agitatore. Agitare a 3.000 rpm ed incubare per 24 ore, proteggere dalla luce coprendo la configurazione utilizzando un box coperto con un foglio di alluminio.
- Centrifugare la sospensione di microsfere a 10.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet.
- Rimuovere il surnatante colorante, lavare le microsfere 6x con 600 microlitri metanolo e poi con 600 microlitri di PBS contenente 0,01% Tween-20 un'altra 6x, come descritto al punto 1.5.
- Conservare le microsfere codificati in 600 microlitri di PBS contenente 0,01% Tween-20 a 4 ° C fino al momento dell'uso, proteggere dalla luce.
| Nome del tipo di microsfere: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Eu-TTA (mm) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (mm) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
Tabella 1. Le concentrazioni di Eu-TTA e C30 soluzioni di lavoro.
2. Preparazione di microsfere di proteine di cattura
- Prepara il MES tampone [2 - (N-morfolino) Acido etansolfonico (MES) 0.1 M, NaCl 0,9%, SDS 0,01%, pH 5.7] e PBS / SDS (sodio fosfato 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS 0,01%, pH 7.4) in anticipo a temperatura ambiente.
- Aggiungere 200 microlitri di sospensione di microsfere codificato (contenente microsfere ~ 2 mg) in una Safe-Lock da 1,5 ml provetta. È importante utilizzare questo tipo di provetta per evitare perdite durante l'incubazione nel passaggio 2.6. <li> Lavare le microsfere con 600 microlitri tampone MES 3x come descritto al punto 1.5. Aggiungere 700 microlitri MES al pellet microsfere e mescolare bene pipettando.
- Preparare 0,105 g / ml 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimide cloridrato (EDC, PM = 191,7 g / mol) e 0,163 g / ml solfo-N-Idrossisulfosuccinimide (solfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluzioni tampone MES in tubi separati.
- Aggiungere 150 ml preparati al momento EDC soluzione goccia a goccia nella sospensione di microsfere. L'EDC idrolizza molto rapidamente, quindi è indispensabile utilizzare una soluzione appena fatto per garantire l'efficienza immobilizzazione. Subito dopo l'aggiunta della CED, aggiungere 150 microlitri soluzione solfo-NHS alle microsfere, mescolare bene pipettando e verificare la sospensione è omogenea.
- Chiudere la provetta, sigillarlo con Parafilm, e metterlo su un agitatore. Agitare a 1.500 rpm per 4 ore, proteggere dalla luce utilizzando una casella coperta con un foglio di alluminio.
- Centrifugare le microsfere suspensione a 10.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet e rimuovere il surnatante. Lavare le microsfere con 500 microlitri di PBS / SDS 3x tampone come descritto nel punto 1.5.
- Aggiungere 200 microlitri tampone PBS / SDS al pellet, mescolare bene le microsfere e trasferire la soluzione a 300 ml PBS / SDS contenente 60 mcg anticorpi di cattura. E 'importante sospendere il pellet microsfere e poi aggiungere la sospensione di microsfere nella soluzione di anticorpi.
- Incubare la miscela di anticorpi-microsfere agitando a 1.500 rpm per 4 ore su un agitatore, proteggere dalla luce utilizzando una casella coperta con un foglio di alluminio.
- Centrifugare la sospensione di microsfere a 10.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet e rimuovere il surnatante. Lavare le microsfere con 500 microlitri StartingBlock (TBS) bloccando 3x tampone, come descritto al punto 1.5.
- Mescolare microsfere di 1 ml di TBS blocco del buffer e incubare microsfere a 1.500 rpm per 1 ora su un agitatore, proteggere dalla luce usando una caletta boxrosso con un foglio di alluminio.
- Centrifugare la sospensione di microsfere a 7.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet e rimuovere il surnatante. Lavare il 3x pellet con 500 microlitri TBS tampone di bloccaggio, come descritto al punto 1.5.
- Centrifugare microsfere a 7.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet e rimuovere il surnatante. Aggiungere 500 microlitri TBS tampone bloccante e mescolare pipettaggio.
- Conservare la sospensione di microsfere modificato a 4 ° C fino al momento dell'uso, proteggere dalla luce.
- Ripetere questa procedura per fare altri tipi di microsfere utilizzando anticorpi corrispondenti.
3. Fibra ottica Microarray Assemblea
- Mescolare 50 ml di ogni tipo di microsfere di proteine di cattura in una nuova provetta autoclave. Centrifugare le microsfere di archivi piscina a 7.000 rpm per 3 minuti e rimuovere il surnatante in modo che il volume rimanente è di circa 100 ml.
- Tagliate a mano fasci di fibre ottiche a circa 5 cm di lunghezza esequenzialmente lucidare entrambe le estremità su una macchina di lucidatura utilizzando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 e 0,05 micron diamante dimensioni lappatura film. Sonicare il fascio lucido in acqua deionizzata per 2 minuti per rimuovere eventuali particelle.
- Mettere una piccola barretta magnetica in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga, aggiungere 400 ml di PBS privo di proteine tampone e agitare su un piatto agitazione magnetica per 30 minuti per eliminare le bolle d'aria.
- Etch una estremità del fascio di fibre lucidato in una soluzione 0,025 N HCl per 150 sec 10,16. Immergere Immediatamente e sonicare fine inciso in acqua deionizzata per 1 min. Asciugare i fasci di fibre con aria compressa.
- Montare il fascio di fibre su un supporto in fibra e bloccare l'estremità inciso in, privo di proteine PBS senza bolle per 1 ora.
- Cassetta 1 microlitri aliquota della sospensione microsfere memorizzato sull'estremità incisa del fascio di fibre ottiche. Proteggere il setup dalla luce con una scatola con un foglio di alluminio, e attendere 15 min. Il volume della sospensionediminuisce per evaporazione e costringere le microsfere nei pozzetti incisi. Ripetere questa fase di carico ancora una volta.
- Usare un tampone imbevuto di soluzione campione per rimuovere microsfere che non sono intrappolati nei pozzetti. Il microarray di proteine è ora pronto per l'uso. Andare subito al punto 4.1 per l'analisi della saliva.
4. Analisi Saliva Esempio di utilizzo di microsfere Microarray
- Aggiungere 200 microlitri soluzione campione (100 microlitri surnatante saliva diluita con un volume uguale di StartingBlock T20 (PBS) tampone di bloccaggio. Il protocollo di raccolta per saliva supernatante è stato pubblicato in precedenza 10). in 0,5 ml autoclavato provetta. Immergere il microarray proteina caricata sulla fibra nella soluzione e incubare l'agitatore a 600 rpm per 2 ore, al riparo dalla luce utilizzando una casella coperto con un foglio di alluminio.
- Preparare 20 ml di tampone di lavaggio aggiungendo 200 microlitri soluzione BSA 10% e 200 ml 10% Tween-20 in 19,6 ml di PBS, mix bene da scuotendo delicatamente.
- Immergere il microarray di proteine in una nuova provetta autoclavato contenente 200 microlitri di tampone di lavaggio e agitare a 600 rpm per 2 min. Ripetere questo lavaggio 3x.
- Incubare il microarray in soluzione 100 ml di un cocktail anticorpo contenente 5 mg / ml di anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, anticorpi biotinilati rilevazione IL-1β in StartingBlock T20 (PBS) tampone di bloccaggio per 30 minuti a temperatura ambiente su shaker a 600 rpm camera, proteggere dalla luce utilizzando una casella coperto con un foglio di alluminio.
- Lavare 3x microarray con tampone di lavaggio come descritto al punto 4.3.
- Incubare il microarray in 200 ml di mcg / ml streptavidina R-ficoeritrina coniugato (SAPE) soluzione 20 in PBS a 600 rpm l'agitatore per 10 min, proteggere dalla luce utilizzando una casella coperto con un foglio di alluminio.
- Lavare il 5x microarray con tampone di lavaggio come descritto al punto 4.3.
- Pulire l'estremità distale della fibra (cioè, l'estremità di distanzadalle microsfere) combinare con un tampone imbevuto di etanolo assoluto.
- Asciugare entrambe le estremità della fibra con aria compressa. Montare la fibra su un microscopio epifluorescente e immagine attraverso l'estremità distale della fibra.
- Acquisire le immagini microsfere corrispondenti a Eu-TTA, C30, e SAPE intensità di emissione di fluorescenza. Impostazione filtri ottici e tempi di esposizione per imaging di fluorescenza di Eu-TTA, C30, e SAPE sono rappresentati nella tabella 2.
| Canale | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| Exciter | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| Beamsplitter | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| Emettitore | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| Tempo di esposizione | 1 sec | 0,3 sec | 1 sec |
Tabella 2. Parametri per le tre immagini fluorescenti del microarray.
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Representative Results
Immagini di fluorescenza da tre canali che mostrano una piccola sezione del fascio di fibre ottiche sono mostrati nelle figure 2A-C. Queste immagini sono stati analizzati utilizzando un algoritmo scritto in MATLAB (come descritto in maggior dettaglio nella sezione Discussione). L'analisi impiega sia informazioni dall'immagine codifica Eu-TTA (Figura 2A) e l'immagine di codifica C30 (Figura 2B) per decodificare le microsfere, e sono state calcolate le intensità di fluorescenza di diverse microsfere l'immagine del segnale (Figura 2C) in. Con le curve di calibrazione ottenute dagli standard proteiche correlate, sono state calcolate le concentrazioni di proteine in campioni di saliva.
Figura 2. (A) immagine di codifica Eu-TTA, (B) Immagine codifica C30, (C) l'immagine del segnale SAPE, (D) risultato di decodificas si sovrapponevano l'immagine del segnale via; diversi tipi di microsfere sono stati etichettati con differenti colori e forme.
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Discussion
I ricercatori dovrebbero prestare particolare attenzione alle seguenti passi: per una migliore precisione di decodifica, è necessario verificare le microsfere sono omogeneamente sospesi in tutta incubazione e lavare passaggi durante la procedura di codifica microsfere. Inoltre, le microsfere codificati devono essere protetti dalla luce durante l'intero esperimento. Dopo le procedure di codifica e di conservazione appropriate, abbiamo scoperto che la precisione complessiva decodifica era al di sopra del 99%. Le microsfere codificati devono essere conservati a 4 ° C. Evitare il congelamento e proteggere dalla luce. In condizioni di conservazione appropriate, le microsfere codificati sono stabili per più di sei mesi. Estrema cura è richiesto durante le fasi di codifica e modifica per ridurre la perdita di microsfere. Ad esempio, non disturbare il pellet microsfere quando si rimuove il surnatante. Inoltre, tra cui Tween-20 e SDS nei buffer è essenziale per una migliore microsfere pellet.
Alcuni of le procedure di risoluzione dei problemi comuni sono: (1) utilizzare soluzione EDC preparata di fresco e solo la soluzione EDC va aggiunto goccia a goccia, (2) tubi autoclave dovrebbero essere utilizzate e la soluzione microsfere deve essere trasferito in una nuova provetta prima di ogni incubazione, ( 3) durante ogni fase di lavaggio, tenta di rimuovere il surnatante, per quanto possibile, (4) le microsfere modificati devono essere conservati a 4 ° C, evitare il congelamento e proteggere dalla luce. In condizioni di conservazione appropriate, le microsfere modificati possono essere conservati per più di 3 mesi senza perdita di segnale rilevabile.
L'algoritmo MATLAB utilizzato per analizzare le immagini di fluorescenza viene brevemente descritto di seguito. Il codice in questione può essere trovato in materiali supplementari. I pixel all'interno di un intervallo di intensità definita dall'utente per l'immagine Eu-TTA sono filtrati prima. Diverse aree sono stati controllati con un filtro, aree contenenti un centro di "vuoto" causato dalla attenuazione della luce sono stati rimossi e le aree in cuimicrosfere sono presenti sono stati ordinati in una lista di controllo per l'elaborazione futura. Tutte le microsfere dalla watch list sono stati ulteriormente filtrati con le risposte l'immagine C30 corrispondente a. I segnali per tutti i pixel di un particolare microsfere sono stati mediati. La forza di questa microsfere di interesse segnale è stato calcolato facendo la media delle intensità di tutti microsfere nell'elenco orologio. Per rendere i risultati statisticamente più rappresentativi, è stato richiesto un minimo di 25 microsfere di ogni tipo. Per minimizzare il segnale aspecifico e diminuire la variazione tra diversi esperimenti, segnali per tutti i tipi di microsfere sono stati normalizzati sottraendo il segnale dalle microsfere di controllo.
La risposta delle microsfere segnale può essere regolato dalla quantità di anticorpi immobilizzati sulla superficie di microsfere, l'ideale per il rilevamento multiplex di proteine con un'ampia gamma di concentrazioni. Sulla base di diversi diametri delle microsfere, tegli quantità di anticorpo necessaria per formare un monostrato delle microsfere può essere stimata dall'equazione del fornitore 17. Per microsfere con un diametro di 4,5 micron, 3 mg di anticorpo è necessaria per 1 mg di microsfere. Abbiamo testato diverse quantità di anticorpi nella soluzione d'attacco nel passaggio 2,8 da 3 mg (0,5 x) a 60 mg (10x) di anticorpo. Segnali di stato osservato un aumento quando più anticorpo è stato utilizzato nella soluzione. Quantità ottimali di anticorpo per diversi anticorpi e le applicazioni devono essere determinati sperimentalmente. Le microsfere "controllo" sono stati accoppiati con il mouse IgG isotipo dell'anticorpo, che viene fornito dal produttore come controllo negativo in ELISA diretto e non ha mostrato reattività crociata con fino a 40 proteine umane ricombinanti 18. Per valutare la riproducibilità del metodo di accoppiamento, due lotti di MMP-9 microsfere sono accoppiati in giorni diversi. Le prestazioni delle microsfere è stata testata utilizzando multiplexed rilevamento di 10 ng / ml MMP-9. I risultati hanno mostrato differenze significative tra i diversi lotti di microsfere (risultati dettagliati sono riportati nella Tabella 3).
| No | Data | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Media | Std |
| 1 | 01/12/2011 | 773,8 | 690,1 | 756,8 | 740,2 | 44.2 |
| 2 | 2011/01/26 | 791,9 | 721,8 | 867,0 | 793,6 | 72.6 |
Tabella 3. Riproducibilità dei metodi di accoppiamento (risultati riportati in unità arbitrarie).
Il metodo multiplex qui presentato consente veloce, accurato e riproducibileanalisi di proteine differenti in un ampio intervallo di concentrazioni (risultati riportati nella Tabella 4). Il potenziale reattività crociata per le sei coppie di anticorpi abbiamo utilizzato in questo studio è stato anche testato. Tutti i segnali di reattività crociata sono risultati essere trascurabile (meno del 3%). Altri vantaggi di questo metodo, rispetto a un tradizionale Immunoenzimatico Assay (ELISA), comprendono una vasta gamma dinamica, minime interazioni non specifiche, consumi campione ridotto e basso costo 10. Il volume necessario di campione di saliva è a partire da 100 microlitri e il test può essere completato entro 3.5 ore. Quando confrontato con altri array portante, un limite di questo approccio è che una volta che il microarray è stato assemblato, il rilevamento deve essere avviato in meno di 15 min. Il metodo qui descritto è stato utilizzato nel nostro laboratorio per analizzare campioni di saliva umana raccolti da pazienti con malattie infiammatorie e controlli sani (dati non pubblicati). Il metodo dovrebbe essere applicabileper l'analisi delle proteine di altri campioni fluidi complessi. Una matrice proteica a base di microsfere-simile può essere utilizzato anche su altre piattaforme come dispositivi microfluidici. La codifica e metodi immobilizzate possono essere applicate anche a microsfere con altri materiali 9.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| Test 1 | 5.365,9 | 2.578,4 | 6.508,7 | 2.584,0 | 515,5 | 1.147,4 |
| Test 2 | 5.787,8 | 2.577,9 | 7.238,9 | 2.919,2 | 375,7 | 1.099,2 |
| Test 3 | 4.944,6 | 2.883,3 | 6.726,3 | 3.619,3 | 406,8 | 1.084,1 |
| Media | 5.366,1 | 2.679,9 | 6.824,6 | 3.040,8 | 432,7 | 1.110,2 |
| Std. Dev | 421,6 | 176,2 | 374,9 | 528,3 | 73.4 | 33.1 |
Tabella 4. Risultati per i tre test indipendenti sullo stesso campione di saliva (risultati riportati in unità arbitrarie).
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (sovvenzioni 08UDE017788-05). EBP riconosce anche il sostegno della Fondazione spagnola per la Scienza e la Tecnologia (FECYT). Gli autori ringraziano Shonda T. Gaylord e Pratyusha Mogalisetti per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
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