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Chemistry

बहुलक microspheres और फाइबर ऑप्टिक बंडलों का उपयोग मानव लार प्रोटीन विश्लेषण के लिए मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेंट माइक्रोएरे

Published: October 10, 2013 doi: 10.3791/50726
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 1
1Department of Chemistry, Tufts University, 2Department of Analytical Chemistry, Complutense University (Spain), 3Department of Electrical and Computer Engineering, Tufts University

Summary

हम मल्टिप्लेक्स microsphere आधारित एंटीबॉडी का उपयोग कर लार प्रोटीन की रूपरेखा के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी covalently carbodiimide रसायन विज्ञान का उपयोग फ्लोरोसेंट डाई इनकोडिंग 4.5 माइक्रोन बहुलक microspheres से जुड़े थे. संशोधित microspheres प्रतिदीप्ति सैंडविच immunoassays उपयोग कर लार में प्रोटीन का स्तर मापने के लिए फाइबर ऑप्टिक microwells में जमा थे.

Abstract

इस के साथ साथ, हम एक साथ एक फाइबर ऑप्टिक microsphere आधारित एंटीबॉडी सरणी का उपयोग कर लार में छह प्रोटीन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. नियोजित इम्युनो सरणी प्रौद्योगिकी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग के साथ microsphere आधारित निलंबन सरणी निर्माण के लाभों को जोड़ती है. वीडियो प्रोटोकॉल में वर्णित है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4.5 माइक्रोन बहुलक microspheres शारीरिक रूप से microspheres के अंदर फंसे दो फ्लोरोसेंट रंगों की एकाग्रता से भेदभाव सात विभिन्न प्रकार, में इनकोडिंग गया. सतह carboxyl समूहों युक्त इनकोडिंग microspheres EDC / एनएचएस युग्मन रसायन शास्त्र के माध्यम से मोनोक्लोनल कब्जा एंटीबॉडी के साथ संशोधित किया गया है. प्रोटीन माइक्रोएरे इकट्ठा करने के लिए, और इनकोडिंग functionalized microspheres के विभिन्न प्रकार के मिश्रित थे और बेतरतीब ढंग से रासायनिक एक फाइबर ऑप्टिक बंडल के प्रॉक्सिमल अंत में etched गया है जो 4.5 माइक्रोन microwells में जमा है. फाइबर ऑप्टिक बंडल एक वाहक के रूप में दोनों और एम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया थाicrospheres. एक बार इकट्ठे, माइक्रोएरे क्लिनिक से एकत्र लार सतह पर तैरनेवाला में प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. पता लगाने के एक streptavidin संयुग्मित फ्लोरोसेंट जांच, आर phycoerythrin साथ अलग analytes के लिए biotinylated पता लगाने के एंटीबॉडी का एक मिश्रण का उपयोग कर एक सैंडविच immunoassay पर आधारित था. माइक्रोएरे microsphere पंजीकरण और परख संकेत के लिए एक के लिए तीन अलग अलग चैनलों, दो में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ने उतारी थी. प्रतिदीप्ति micrographs तो डीकोड और matlab में एक घर का बना कलन विधि का उपयोग विश्लेषण किया गया.

Introduction

मार्क Schena और 1990 के मध्य में सहकर्मियों द्वारा रिपोर्ट पहले माइक्रोएरे के बाद से, इस शक्तिशाली उपकरण जैविक अनुसंधान 1 के कई क्षेत्रों में उपयोग किया गया है. एक साथ इस तरह के खून के रूप में नैदानिक ​​तरल पदार्थ, में कई प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम एंटीबॉडी, नैदानिक ​​निदान और biomarker स्क्रीनिंग 2-10 में महत्वपूर्ण आवेदन किया है. लार, रक्त के रूप में ही analytes की कई युक्त लार संग्रह, सुरक्षित noninvasive है क्योंकि रक्त के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में माना गया है, और न्यूनतम प्रशिक्षित चिकित्सा कर्मियों 11-13 से बाहर किया जा सकता है. वर्तमान में, लार के नमूनों का प्रयोग मल्टिप्लेक्स प्रोटीन विश्लेषण लक्ष्य analyte 14 की कम एकाग्रता और अलग बायोमार्कर 15 की व्यापक एकाग्रता रेंज सहित कई महत्वपूर्ण कारकों द्वारा सीमित है.

.

इस के साथ साथ, हम छह प्रोटीन का विश्लेषण का प्रदर्शन: मानव संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF), इंटरफेरॉन गामा प्रेरित प्रोटीन 10 (आईपी 10), इंटरल्यूकिन -8 (आईएल -8), epidermal वृद्धि कारक (EGF), मैट्रिक्स metallopeptidase 9 (एमएमपी 9), और इंटरल्यूकिन -1 बीटा (आईएल 1β) . विधि का प्रदर्शन शुरू में पुनः संयोजक analyte प्रोटीन का गठन और अवरुद्ध बफर मानक समाधान का उपयोग कर सत्यापित किया गया था. विभिन्न जीर्ण सांस की बीमारियों के मरीजों के साथ ही स्वस्थ नियंत्रण से एकत्र रियल लार के नमूने भी संतोषजनक प्रदर्शन के साथ परीक्षण किया गया. प्रोटोकॉल अन्य प्रोटीन analytes और अन्य microsphere आधारित assays के लिए लागू किया जाना चाहिए. यह एक की तुलना में एक व्यापक गतिशील रेंज, कम से कम गैर विशिष्ट बातचीत, कम नमूना खपत, और कम लागत के साथ कई प्रोटीन की कम मात्रा का तेजी से, सही, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एक साथ विश्लेषण सक्षम बनाता है के रूप में इस मंच विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान के क्षेत्र को काफी लाभ प्रदान करता है अनुरूप एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा).

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Protocol

चित्रा 1
चित्रा 1. . लार की रूपरेखा के लिए फाइबर ऑप्टिक microsphere एंटीबॉडी सरणी को लागू करने के लिए कार्यप्रवाह (1) Microspheres आंतरिक दो फ्लोरोसेंट रंगों के साथ इनकोडिंग हैं, (2) इनकोडिंग microspheres बाह्य प्रोटीन विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ संशोधित कर रहे हैं, (3) मल्टिप्लेक्स microspheres मिश्रित कर रहे हैं, (5) लार प्रोटीन सैंडविच immunoassay के माध्यम से microspheres के द्वारा कब्जा कर रहे हैं, और (6) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग मात्रा, और (4) बेतरतीब ढंग से एक फाइबर ऑप्टिक बंडल के प्रॉक्सिमल अंत में etched microwells में जमा है.

1. Microspheres तय

  1. एक एम्बर कांच की शीशी में सोडियम युरोपियम (तृतीय) thenoyltrifluoroacetonate trihydrate (ईयू TTA, मेगावाट = 869.54 छ / mol) वजन और Tetrahydrofuran (THF) में 200 मिमी शेयर समाधान तैयार है. Pipetting द्वारा धीरे मिक्स, नेत्रहीन सत्यापितडाई पूरी तरह भंग है.
  2. एक एम्बर कांच की शीशी में कूमेरिन 30 (C30, मेगावाट = 347.41 छ / mol) वजन और THF में एक 12 मिमी शेयर समाधान तैयार है. Pipetting द्वारा धीरे मिक्स, नेत्रहीन डाई पूरी तरह भंग है सत्यापित.
  3. तालिका 1 में सूचीबद्ध अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए स्टॉक समाधान और THF का उपयोग कर प्रत्येक microsphere प्रकार के लिए काम कर समाधान के 700 μl तैयार करें.
  4. Microspheres (10% w / v) अच्छी तरह से vortexing द्वारा निलंबित कर दिया, और उसके बाद एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 60 μl निलंबन हस्तांतरण सुनिश्चित कर रहे हैं.
  5. Microsphere निलंबन के लिए 600 μl पीबीएस जोड़ें और 20x pipetting द्वारा मिश्रण. 3 मिनट के लिए 10,000 rpm पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटायें. Microspheres धोने के लिए इस प्रक्रिया को एक और 2x दोहराएँ.
  6. THF 1.5 कदम के रूप में एक समान प्रक्रिया का उपयोग करने के साथ microsphere गोली 3x धो लें.
  7. 3 मिनट के लिए 10,000 rpm पर microsphere / THF निलंबन अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला हटाने, और 600 μl में गोली फिर से निलंबितकाम कर समाधान 1 टेबल में सूचीबद्ध. एक नया 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब मिश्रण स्थानांतरण.
  8. Parafilm के साथ microcentrifuge ट्यूब सील और एक प्रकार के बरतन पर जगह है. 3,000 rpm पर हिला और 24 घंटे के लिए सेते, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक बॉक्स का उपयोग कर सेटअप कवर द्वारा प्रकाश से रक्षा करते हैं.
  9. एक गोली फार्म के लिए 3 मिनट के लिए 10,000 rpm पर microsphere निलंबन अपकेंद्रित्र.
  10. कदम 1.5 में वर्णित के रूप में सतह पर तैरनेवाला डाई समाधान निकालें, 0.01% बीच 20 अन्य 6x युक्त 600 μl पीबीएस के साथ फिर microspheres के 600 μl मेथनॉल के साथ 6X धोने और.
  11. उपयोग करें जब तक, प्रकाश से रक्षा 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.01% बीच 20 से युक्त 600 μl पीबीएस में इनकोडिंग microspheres स्टोर.
Microsphere प्रकार का नाम: 1 2 3 4 5 6 7
यूरोपीय संघ के TTA (मिमी) 100 100 10 100 10
C30 (मिमी) 1 1 6 6 1 6

तालिका 1. यूरोपीय संघ TTA और C30 की सांद्रता समाधान काम.

2. प्रोटीन से कब्जा microspheres की तैयारी

  1. [- (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) 0.1 एम, NaCl 0.9%, एसडीएस 0.01%, पीएच 5.7 2] और पीबीएस / एसडीएस बफर (सोडियम फास्फेट 0.01 एम, NaCl 0.154 एम, एसडीएस 0.01%, पीएच एमईएस बफर तैयार 7.4) कमरे के तापमान पर अग्रिम में.
  2. एक सुरक्षित ताला 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में (~ 2 मिलीग्राम microspheres युक्त) 200 μl इनकोडिंग microsphere निलंबन जोड़ें. यह कदम 2.6 में ऊष्मायन के दौरान spillage से बचने के लिए microcentrifuge ट्यूब के इस प्रकार का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.
    3. <ली> 1.5 कदम के रूप में वर्णित 3x बफर 600 μl एमईएस के साथ microspheres धो लें. Microsphere गोली 700 μl एमईएस जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
  3. तैयार करें 0.105 मिलीग्राम / छ 1-एथिल-3 [3 dimethylaminopropyl] carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी, मेगावाट = 191.7 छ / mol) और 0.163 मिलीग्राम / छ sulfo एन hydroxysulfosuccinimide (sulfo एन एच एस, मेगावाट = 217.13 छ / mol) अलग ट्यूबों में एमईएस बफर में समाधान.
  4. हौसले microsphere निलंबन में ड्रॉप द्वारा EDC समाधान बूंद तैयार 150 μl जोड़ें. ईडीसी इस प्रकार यह स्थिरीकरण दक्षता सुनिश्चित करने के लिए ताजा बना समाधान का उपयोग करने के लिए आवश्यक है, बहुत जल्दी hydrolyzes. इसके तत्काल बाद ईडीसी के बाद इसके अलावा, microspheres के लिए 150 μl sulfo एन एच एस समाधान जोड़ने pipetting द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से और निलंबन समरूप है सत्यापित.
  5. , ट्यूब टोपी Parafilm के साथ इसे सील, और एक प्रकार के बरतन पर जगह है. , 4 घंटा के लिए 1500 rpm पर हिला एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक बॉक्स का उपयोग कर प्रकाश से रक्षा करते हैं.
  6. Microsphere suspens अपकेंद्रित्रएक गोली फार्म और सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए 3 मिनट के लिए 10,000 rpm पर आयन. कदम 1.5 में वर्णित के रूप में 500 μl पीबीएस / एसडीएस बफर 3X के साथ microspheres धो लें.
  7. , गोली के लिए 200 μl पीबीएस / एसडीएस बफर जोड़ें अच्छी तरह microspheres मिश्रण और 60 ग्राम पर कब्जा एंटीबॉडी युक्त 300 μl पीबीएस / एसडीएस बफर का हल हस्तांतरण. यह पहली बार microsphere गोली निलंबित और फिर एंटीबॉडी समाधान में microsphere निलंबन जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है.
  8. एक प्रकार के बरतन पर 4 घंटे के लिए 1500 rpm पर झटकों से एंटीबॉडी microspheres मिश्रण सेते एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक बॉक्स का उपयोग कर प्रकाश से रक्षा करते हैं.
  9. एक गोली फार्म और सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए 3 मिनट के लिए 10,000 rpm पर microsphere निलंबन अपकेंद्रित्र. 500 μl StartingBlock (टीबीएस) 1.5 कदम के रूप में वर्णित, बफर 3x अवरुद्ध साथ microspheres धो लें.
  10. अवरुद्ध बफर टीबीएस के 1 एमएल के साथ microspheres मिलाएं और एक बॉक्स कोव का उपयोग कर प्रकाश से बचाने, एक प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए 1500 rpm पर microspheres सेतेएल्यूमीनियम पन्नी के साथ लाल.
  11. एक गोली फार्म और सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए 3 मिनट के लिए 7000 rpm पर microsphere निलंबन अपकेंद्रित्र. कदम 1.5 में वर्णित के रूप में 500 μl टीबीएस, अवरुद्ध बफर के साथ गोली 3x धो लें.
  12. एक गोली फार्म और सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए 3 मिनट के लिए 7000 rpm पर microsphere समाधान अपकेंद्रित्र. अवरुद्ध बफर 500 μl टीबीएस जोड़ें और pipetting द्वारा मिश्रण.
  13. प्रकाश से रक्षा, उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संशोधित microsphere निलंबन स्टोर.
  14. इसी एंटीबॉडी का उपयोग microspheres के अन्य प्रकार बनाने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.

3. फाइबर ऑप्टिक माइक्रोएरे विधानसभा

  1. एक नई autoclaved microcentrifuge ट्यूब में प्रोटीन कब्जा microspheres के प्रत्येक प्रकार के 50 μl मिलाएं. अपकेंद्रित्र शेयर microspheres 3 मिनट के लिए 7000 rpm पर पूल, और शेष मात्रा लगभग 100 μl है कि इतनी सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  2. हाथ कट फाइबर ऑप्टिक लंबाई में लगभग 5 सेमी बंडलों औरक्रमिक रूप से फिल्मों lapping 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0.5, और 0.05 मीटर आकार के हीरे का उपयोग कर एक चमकाने मशीन पर दोनों सिरों पॉलिश. किसी भी कणों को दूर करने के लिए 2 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में पॉलिश बंडल Sonicate.
  3. एक 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में एक छोटे चुंबकीय सरगर्मी बार रखो, प्रोटीन से मुक्त पीबीएस के 400 μl बफर और हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए 30 मिनट के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी प्लेट पर हलचल जोड़ें.
  4. 150 सेकंड 10,16 के लिए एक 0.025 एन एचसीएल समाधान में पॉलिश फाइबर बंडल के एक छोर खोदना. तुरंत डूब और 1 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में etched अंत sonicate. संपीड़ित हवा के साथ फाइबर बंडलों सूखी.
  5. एक फाइबर धारक पर फाइबर बंडल माउंट और 1 घंटे के लिए बुलबुला मुक्त, प्रोटीन से मुक्त पीबीएस बफर में etched अंत ब्लॉक.
  6. फाइबर ऑप्टिक बंडल के etched अंत पर संग्रहीत microsphere निलंबन की जमा 1 μl विभाज्य. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक बॉक्स के साथ प्रकाश से सेटअप की रक्षा, और 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. निलंबन की मात्रा होगावाष्पीकरण की कमी और etched microwells में microspheres के लिए मजबूर. इस लदान कदम एक बार और दोहराएँ.
  7. Microwells में नहीं फंस रहे हैं कि microspheres दूर करने के लिए नमूना समाधान के साथ संतृप्त एक झाड़ू का प्रयोग करें. प्रोटीन माइक्रोएरे अब इस्तेमाल के लिए तैयार है. लार विश्लेषण के लिए 4.1 कदम के लिए तुरंत जाओ.

4. Microspheres माइक्रोएरे का प्रयोग लार के नमूने विश्लेषण

  1. 200 μl नमूना समाधान (बफर अवरुद्ध. लार सतह पर तैरनेवाला के लिए संग्रह प्रोटोकॉल पहले 10 प्रकाशित किया गया है StartingBlock ट्वेंटी 20 (पीबीएस) के बराबर मात्रा के साथ पतला 100 μl लार सतह पर तैरनेवाला) जोड़ें. एक 0.5 मिलीलीटर autoclaved microcentrifuge ट्यूब में. समाधान में फाइबर पर लोड प्रोटीन माइक्रोएरे डुबकी और 2 घंटे के लिए 600 rpm पर हिलनेवाला पर सेते हैं, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक बॉक्स का उपयोग कर प्रकाश से रक्षा करते हैं.
  2. 10% बीच 20 19.6 मिलीलीटर पीबीएस, एमआई में 200 μl 10% BSA समाधान और 200 μl जोड़कर 20 मिलीलीटर धोने बफर तैयारएक्स अच्छी तरह से धीरे झटकों से.
  3. 200 μl धो बफर युक्त एक नई autoclaved microcentrifuge ट्यूब में प्रोटीन माइक्रोएरे डुबकी और 2 मिनट के लिए 600 rpm पर मिलाते हैं. इस 3X धो दोहराएँ.
  4. विरोधी VEGF, आईपी 10, आईएल -8, EGF, एमएमपी 9 में से 5 ग्राम / मिलीलीटर युक्त पहचान प्रतिरक्षी कॉकटेल के 100 μl समाधान में माइक्रोएरे सेते हैं, StartingBlock टी -20 में आईएल 1β biotinylated पता लगाने एंटीबॉडी (पीबीएस) बफर अवरुद्ध 600 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक बॉक्स का उपयोग कर प्रकाश से रक्षा करते हैं.
  5. 4.3 चरण में वर्णित के रूप में धोने बफर के साथ माइक्रोएरे 3x धो लें.
  6. , 10 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर 600 rpm पर पीबीएस में 20 माइक्रोग्राम / एमएल streptavidin आर phycoerythrin संयुग्म (SAPE) समाधान के 200 μl में माइक्रोएरे सेते एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर एक बॉक्स का उपयोग कर प्रकाश से रक्षा करते हैं.
  7. 4.3 चरण में वर्णित के रूप में धोने बफर के साथ माइक्रोएरे 5x धो लें.
  8. फाइबर दूर (यानी, अंत के बाहर का अंत साफmicrospheres से) पूर्ण इथेनॉल के साथ संतृप्त एक झाड़ू के साथ बंडल.
  9. संपीड़ित हवा के साथ फाइबर के दोनों सिरों से सूखी. फाइबर के बाहर का अंत के माध्यम से एक epifluorescent खुर्दबीन और छवि पर फाइबर माउंट.
  10. यूरोपीय संघ TTA, C30, और SAPE प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तीव्रता को इसी microsphere छवियों मोल. यूरोपीय संघ TTA, C30, और SAPE की प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल फिल्टर सेटअप और जोखिम बार तालिका 2 में चित्रित कर रहे हैं.
चैनल यूरोपीय संघ के TTA C30 SAPE
उत्तेजक 365/10x 350/50x 546/10x
Beamsplitter 525DCLP 400DCLP 560LP
Emitter 620/60m 460/50m 580/30m
एक्सपोजर समय 1 सेकंड 0.3 सेकंड 1 सेकंड

तालिका 2. माइक्रोएरे के तीन फ्लोरोसेंट छवियों के लिए पैरामीटर.

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Representative Results

फाइबर ऑप्टिक बंडल के एक छोटे खंड दिखा तीन चैनलों से प्रतिदीप्ति छवियों आंकड़े 2A सी में दिखाया गया. (चर्चा अनुभाग में अधिक विस्तार में वर्णित है) इन छवियों Matlab में लिखा एक कलन विधि का उपयोग विश्लेषण किया गया. विश्लेषण microspheres डिकोड करने के लिए यूरोपीय संघ TTA एन्कोडिंग छवि (2A चित्रा) से जानकारी और C30 एन्कोडिंग छवि (चित्रा 2 बी) दोनों को रोजगार, और संकेत छवि (चित्रा -2) में विभिन्न microspheres की प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना की गई. सहसंबद्ध प्रोटीन मानकों से प्राप्त अंशांकन घटता के साथ, लार के नमूने में प्रोटीन की सांद्रता गणना की गई.

चित्रा 2
चित्रा 2. (ए) यूरोपीय संघ TTA एन्कोडिंग छवि, (बी) C30 एन्कोडिंग छवि, (सी) SAPE संकेत छवि, (डी) डिकोडिंग परिणामmicrospheres के विभिन्न प्रकार के विभिन्न रंग और आकार के साथ लेबल रहे थे; के संकेत छवि पर छा.

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Discussion

शोधकर्ताओं निम्नलिखित कदम को अतिरिक्त ध्यान देना चाहिए: बेहतर डिकोडिंग सटीकता के लिए, यह microspheres एक ही ढंग से सभी ऊष्मायन में निलंबित कर दिया गया सत्यापित और microspheres एन्कोडिंग प्रक्रिया के दौरान कदम धोने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, इनकोडिंग microspheres पूरे प्रयोग के दौरान प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए. उचित एन्कोडिंग और भंडारण प्रक्रियाओं के बाद, हम समग्र डिकोडिंग सटीकता 99% से ऊपर था. इनकोडिंग microspheres सी. ठंड से बचें और प्रकाश से बचाने के 4 डिग्री पर संग्रहित किया जाना चाहिए. उचित भंडारण शर्तों के तहत, इनकोडिंग microspheres अधिक से अधिक छह महीने के लिए स्थिर रहे हैं. चरम देखभाल microspheres के नुकसान को कम करने के लिए एन्कोडिंग और संशोधन चरणों के दौरान आवश्यक है. सतह पर तैरनेवाला हटाने जब उदाहरण के लिए, microsphere गोली परेशान नहीं है. इसके अलावा, बफ़र्स में बीच 20 और एसडीएस सहित बेहतर microsphere pelleting के लिए आवश्यक है.

कुछ ओएफ आम समस्या निवारण प्रक्रियाओं हैं: (1) (, केवल हौसले से तैयार EDC समाधान का उपयोग करें और EDC समाधान dropwise जोड़ा जाना चाहिए, (2) autoclaved ट्यूबों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए और microsphere समाधान प्रत्येक ऊष्मायन कदम से पहले एक नया ट्यूब में स्थानांतरित किया जाना चाहिए 3) प्रत्येक धोने के कदम के दौरान, सतह पर तैरनेवाला जितना संभव हो दूर करने की कोशिश (4) संशोधित microspheres 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए, ठंड से बचने और प्रकाश से बचाने के लिए. उचित भंडारण शर्तों के तहत, संशोधित microspheres के लिए भंडारित किया जा सकता है कोई detectable संकेत हानि के साथ अधिक से अधिक 3 महीने.

प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल MATLAB एल्गोरिथ्म नीचे संक्षेप में वर्णन किया गया है. प्रासंगिक कोड पूरक सामग्री में पाया जा सकता है. यूरोपीय संघ TTA छवि के लिए एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित तीव्रता सीमा के भीतर पिक्सल पहला छान रहे हैं. विभिन्न क्षेत्रों, एक आकार फिल्टर के साथ जांच की गई प्रकाश क्षीणन की वजह से एक "खोखला" केंद्र युक्त क्षेत्रों हटा दिया गया और क्षेत्रों जहांmicrospheres मौजूद हैं भविष्य के प्रसंस्करण के लिए एक घड़ी की सूची में हल किया गया. घड़ी की सूची से सभी microspheres आगे इसी C30 छवि में प्रतिक्रियाओं के साथ फ़िल्टर किया गया. एक विशेष microsphere के सभी पिक्सल के लिए संकेत औसत थे. ब्याज की इस microsphere के सिग्नल की शक्ति घड़ी सूची में सभी microspheres की तीव्रता औसत से गणना की गई. परिणामों के सांख्यिकीय अधिक प्रतिनिधि बनाने के लिये प्रत्येक प्रकार के 25 microspheres की एक न्यूनतम आवश्यकता थी. अविशिष्ट संकेत को कम करने और विभिन्न प्रयोगों के बीच भिन्नता को कम करने के लिए, सभी microsphere प्रकार के संकेतों को नियंत्रित microspheres से संकेत घटाकर सामान्यीकृत थे.

microspheres के संकेत प्रतिक्रिया सांद्रता की व्यापक रेंज के साथ प्रोटीन की मल्टिप्लेक्स का पता लगाने के लिए आदर्श है जो microspheres की सतह पर स्थिर एंटीबॉडी की राशि से समायोजित किया जा सकता है. Microspheres, टी के विभिन्न व्यास के आधार परवह microspheres पर एक monolayer बनाने के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की राशि निर्माता 17 से समीकरण से अनुमान लगाया जा सकता है. 4.5 माइक्रोन की एक व्यास, एंटीबॉडी के 3 ग्राम के साथ microspheres के लिए microspheres की 1 मिलीग्राम प्रति की जरूरत है. हम एंटीबॉडी की 60 ग्राम (10x) के लिए 3 ग्राम (0.5x) से 2.8 कदम में युग्मन समाधान में विभिन्न एंटीबॉडी मात्रा का परीक्षण किया है. अधिक एंटीबॉडी समाधान में इस्तेमाल किया गया था जब बढ़ी हुई संकेतों मनाया गया. विभिन्न एंटीबॉडी और अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम एंटीबॉडी मात्रा प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. "नियंत्रण microspheres" प्रत्यक्ष एलिसा में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में निर्माता द्वारा आपूर्ति की है और ऊपर से 40 पुनः संयोजक मानव प्रोटीन 18 के साथ कोई पार जेट से पता चला है जो माउस निर्धारण आईजीजी एंटीबॉडी, के साथ मिलकर किया गया. युग्मन विधि के reproducibility मूल्यांकन, एमएमपी 9 microspheres के दो बैचों अलग अलग दिनों पर युग्मित गया. microspheres के प्रदर्शन multiplexe का उपयोग कर परीक्षण किया गया था10 एनजी / एमएल एमएमपी 9 के विकास का पता लगाने. परिणाम (विस्तृत परिणाम 3 तालिका में दिखाया गया है) microspheres के विभिन्न बैचों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखाया.

नहीं तारीख टेस्ट 1 टेस्ट 2 टेस्ट 3 औसत एसटीडी
1 2011/01/12 773.8 690.1 756.8 740.2 44.2
2 2011/01/26 791.9 721.8 867.0 793.6 72.6

तालिका 3. युग्मन तरीकों (मनमाना इकाइयों में दिखाया परिणाम) के reproducibility.

यहाँ प्रस्तुत मल्टिप्लेक्स विधि तेजी से, सही, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने में सक्षम बनाता हैएक विस्तृत एकाग्रता रेंज (4 तालिका में सूचीबद्ध परिणाम) अधिक विभिन्न प्रोटीन का विश्लेषण. हम इस अध्ययन में इस्तेमाल छह प्रतिरक्षी जोड़े के लिए संभावित पार जेट भी परीक्षण किया गया था. पार जेट से सभी संकेतों (कम से कम 3%) नगण्य होना पाया गया है. इस विधि के अन्य लाभ, एक पारंपरिक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) की तुलना में, एक व्यापक गतिशील रेंज, कम से कम गैर विशिष्ट बातचीत, कम नमूना खपत और कम लागत के 10 शामिल हैं. लार के नमूने की आवश्यक मात्रा 100 μl जितनी कम है और परख 3.5 घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है. अन्य निलंबन सरणियों के साथ तुलना में, इस दृष्टिकोण की एक सीमा माइक्रोएरे इकट्ठा किया गया था एक बार, पता लगाने के लिए कम से कम 15 मिनट में शुरू किए जाने की आवश्यकता है. यहाँ वर्णित विधि भड़काऊ रोगों और स्वस्थ नियंत्रण (अप्रकाशित डेटा) के साथ रोगियों से एकत्र मानव लार के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया है. विधि लागू किया जाना चाहिएअन्य जटिल तरल पदार्थ के नमूनों के विश्लेषण के लिए प्रोटीन. ऐसा ही एक microsphere आधारित प्रोटीन सरणी ऐसे microfluidic उपकरणों के रूप में अन्य प्लेटफार्मों पर इस्तेमाल किया जा सकता है. एन्कोडिंग और immobilized तरीकों में भी अन्य सामग्री 9 के साथ बनाया microspheres के लिए लागू किया जा सकता है.

VEGF आईपी ​​10 आईएल -8 EGF एमएमपी 9 आईएल 1β
टेस्ट 1 5365.9 2578.4 6508.7 2584.0 515.5 1147.4
टेस्ट 2 5787.8 2577.9 7238.9 2919.2 375.7 1099.2
टेस्ट 3 4944.6 2883.3 6726.3 3619.3 406.8 1084.1
औसत 5366.1 2679.9 6824.6 3040.8 432.7 1110.2
एसटीडी. देव 421.6 176.2 374.9 528.3 73.4 33.1

तालिका 4. (मनमाना इकाइयों में दिखाया परिणाम) एक ही लार के नमूने पर तीन स्वतंत्र परीक्षण के लिए परिणाम.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (अनुदान 08UDE017788-05) द्वारा समर्थित किया गया. ईबीपी भी विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए स्पेनिश फाउंडेशन (FECYT) से समर्थन मानता है. लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Shonda टी. जेराल्ड और Pratyusha Mogalisetti धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eu-TTA dye Fisher Scientific AC42319-0010
THF Sigma-Aldrich 34865-100ML
Amber glass vial Fisher Scientific 03-339-23B
Coumarin 30 dye Sigma-Aldrich 546127-100MG
Microspheres Bangslabs PC05N/6698
1.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-129
PBS 10x concentrate Sigma-Aldrich P5493-1L
Water Sigma-Aldrich W4502-1L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-100ML
Tw-20 Sigma-Aldrich P7949-100 ml
BupH MES buffered saline Thermo Scientific 28390
SDS Sigma-Aldrich 05030-500ML-F
NaOH solution Fisher Scientific SS256-500
Safe-lock microcentrifuge tube VWR labshop 53511-997
EDC Thermo Scientific 22980
Sulfo-NHS Thermo Scientific 24510
Human VEGF capture antibody R&D Systems MAB293
Human IP-10 capture antibody R&D Systems MAB266
Human IL-8 capture antibody R&D Systems MAB208
Human EGF capture antibody R&D Systems MAB636
Human MMP-9 capture antibody R&D Systems MAB936
Human IL-1β capture antibody R&D Systems MAB601
Mouse IgG1 isotype control antibody R&D Systems MAB002
StartingBlock (TBS) buffer Thermo Scientific 37542
HCl standard solution 1.0 N Sigma-Aldrich 318949-500 ml
0.5 ml microcentrifuge tubes Fisher Scientific 05-408-120
Protein-free (PBS) buffer Thermo Scientific 37572
Recombinant human VEGF 165 R&D Systems 293-VE
Recombinant human IP-10 R&D Systems 266-IP
Recombinant human IL-8 R&D Systems 208-IL
Recombinant human EGF R&D Systems 236-EG
Recombinant human MMP-9 R&D Systems 911-MP
Recombinant human IL-1β R&D Systems 201-LB
StartingBlock T20 (PBS) buffer Thermo Scientific 37539
Blocker BSA in PBS Thermo Scientific 37525
Biotinylated VEGF detection antibody R&D Systems BAF293
Biotinylated IP-10 detection antibody R&D Systems BAF266
Biotinylated IL-8 detection antibody R&D Systems BAF208
Biotinylated EGF detection antibody R&D Systems BAF236
Biotinylated MMP-9 detection antibody R&D Systems BAF911
Biotinylated IL-1β detection antibody R&D Systems BAF201
Streptavidin, R-phycoerythrin Invitrogen S-21388
Ethanol (200 proof) Sigma-Aldrich E7023-500ML

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References

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रसायन विज्ञान अंक 80 प्रोटीन संवेदन माइक्रोएरे मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेंट मात्रा का ठहराव फाइबर ऑप्टिक biosensor microsphere आधारित immunoassays लार विश्लेषण microsphere एन्कोडिंग
बहुलक microspheres और फाइबर ऑप्टिक बंडलों का उपयोग मानव लार प्रोटीन विश्लेषण के लिए मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेंट माइक्रोएरे
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Nie, S., Benito-Peña, E., Zhang, H., Wu, Y., Walt, D. R. Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles. J. Vis. Exp. (80), e50726, doi:10.3791/50726 (2013).

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