Summary
Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.
Abstract
Relata-se um protocolo para medir simultaneamente seis proteínas na saliva usando uma baseada em microesfera variedade de anticorpos de fibra óptica. A tecnologia de imuno-matriz empregada combina as vantagens de suspensão à base de fabrico de microesferas de matriz com a utilização de microscopia de fluorescência. Tal como descrito no protocolo de vídeo, microesferas de polímero 4,5 mM disponíveis comercialmente foram codificados em sete tipos diferentes, diferenciadas por a concentração de dois corantes fluorescentes aprisionados fisicamente dentro das microesferas. As microesferas codificados contendo grupos carboxilo de superfície foram modificados com anticorpos de captura monoclonais através de EDC / NHS acoplamento química. Para montar o microarray de proteínas, os diferentes tipos de microesferas codificados e funcionalizados foram misturadas e depositadas aleatoriamente em 4,5 mM microcavidades, que foram quimicamente gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas. O feixe de fibras ópticas, foi usado como um portador para a imagem latente e o microspheres. Depois de montada, a micromatriz foi utilizado para capturar as proteínas no sobrenadante da saliva recolhida a partir da clínica. A detecção foi baseada num imunoensaio de sanduíche utilizando uma mistura de anticorpos de detecção de bioestanhados para diferentes analitos com uma sonda fluorescente de estreptavidina conjugada com R-ficoeritrina. O microarray foram visualizados por meio de microscopia de fluorescência, em três canais diferentes, dois para o registo de microesferas e um para o sinal de ensaio. As micrografias de fluorescência foram decodificados e analisados por meio de um algoritmo de caseiro em MATLAB.
Introduction
Desde o primeiro microarray relatado por Mark Schena e colegas de trabalho em meados de 1990, esta poderosa ferramenta tem sido utilizada em muitos campos da pesquisa biológica 1. Microarrays de anticorpo capaz de detectar simultaneamente várias proteínas em fluidos de diagnóstico, tais como o sangue, tem aplicações importantes no diagnóstico clínico e biomarcador rastreio 2-10. Saliva, que contém muitos dos mesmos analitos como sangue, tem sido considerada como uma alternativa preferível ao sangue porque recolha de saliva é seguro, não invasivo, e pode ser levada a cabo por pessoal médico minimamente treinados 11-13. Actualmente, a análise da proteína multiplexado utilizando amostras de saliva é limitada por vários factores importantes, incluindo a baixa concentração do analito alvo 14 e o largo intervalo de concentração de diferentes biomarcadores 15.
.Aqui, nós demonstramos a análise de seis proteínas: fator de crescimento endotelial vascular humano (VEGF), proteína induzida por interferão gama, 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crescimento epidérmico (EGF), metalopeptidase matriz 9 (MMP-9), e interleucina-1 beta (IL-1β) . O desempenho do método foi inicialmente verificado utilizando soluções padrão constituindo proteínas recombinantes de analitos e tampão de bloqueio. Amostras de saliva reais coletadas de pacientes de diferentes doenças respiratórias crônicas, bem como controles saudáveis também foram testados com desempenho satisfatório. O protocolo deve ser aplicável a outros analitos de proteína e outros ensaios baseados em microesferas. Esta plataforma oferece vantagens consideráveis para o campo Analytical Chemistry, uma vez que permite a análise simultânea rápido, preciso e reprodutível de baixas concentrações de várias proteínas com uma gama ampla dinâmica, as interações não-específicas mínimas, reduziu o consumo de amostra, e de baixo custo em comparação com um análogo Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
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Protocol
Figura 1. . Fluxo de trabalho para aplicar matriz anticorpo microesfera de fibra óptica para a saliva de perfis (1) As microesferas são internamente codificado com dois corantes fluorescentes, (2) as microesferas codificados são externamente modificada com anticorpos monoclonais específicos para a proteína, (3) as microesferas multiplexados são misturados, e (4) depositado aleatoriamente em micropoços gravado na extremidade proximal de um feixe de fibras ópticas, (5) as proteínas salivares são capturados por microesferas através de imunoensaio de sanduíche, e (6) quantificados por microscopia de fluorescência.
1. Microesferas Encoding
- Pesar európio de sódio (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 200 mM em tetra-hidrofurano (THF). Misture delicadamente por pipetagem; verificar visualmenteo corante esteja completamente dissolvido.
- Pesar cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) num frasco de vidro âmbar e preparar uma solução de estoque 12 mM em THF. Misturar suavemente por pipetagem; visualmente verificar o corante esteja completamente dissolvido.
- Prepare a 700 ul de solução de trabalho para cada tipo de microesfera utilizando as soluções de reserva e de THF para atingir uma concentração final na Tabela 1.
- Certifique-se de microsferas (10% w / v) são bem suspensas por vórtice, e depois transferir a suspensão de 60 mL para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Adicionar 600 mL PBS a suspensão de microesferas e misture pipetando 20x. Centrifuga-se o tubo a 10.000 rpm durante 3 min e remover cuidadosamente o sobrenadante. Repetir este processo mais 2x para lavar as microsferas.
- Lava-se a pelete 3x com microesferas de THF utilizando um procedimento semelhante ao passo 1.5.
- Centrifugar a suspensão de microsferas / THF a 10.000 rpm, durante 3 min, remover o sobrenadante, e re-suspender o sedimento em 600 ulSolução de trabalho de listados na Tabela 1. Transferir a mistura para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml.
- Selar o tubo de microcentrífuga com Parafilm e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 3.000 rpm e incubar por 24 horas, proteger da luz, cobrindo a instalação usando uma caixa coberta com papel alumínio.
- Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete.
- Remover a solução de corante sobrenadante, lavar as microesferas 6X com 600 ul de metanol e em seguida com 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20, um outro 6x, tal como descrito na etapa 1.5.
- Armazenar as microesferas codificadas em 600 ul de PBS contendo 0,01% de Tween-20 a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz.
| Nome do tipo de microesfera: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Eu-TTA (mM) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (mM) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
Tabela 1. As concentrações de Eu-TTA e C30 soluções de trabalho.
2. Preparação de microesferas de captura de Proteína
- Preparar tampão MES [2 - (N-morfolino) etanossulfónico (MES) 0,1 M, NaCl a 0,9%, SDS a 0,01%, pH 5,7] e tampão PBS / SDS (fosfato de sódio 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS a 0,01%, pH 7,4) com antecedência à temperatura ambiente.
- Adicionar 200 mL de suspensão de microesferas codificadas (contendo ~ 2 mg de microesferas) em um Safe-Lock 1,5 ml tubo de microcentrífuga. É importante a utilização deste tipo de tubo de microcentrífuga para evitar o derrame durante a incubação no passo 2.6. <li> Lavar as microesferas com 600 ul de tampão MES 3x como descrito na etapa 1.5. Adicionar 700 ul de MES para o pellet de microsferas e misturar bem por pipetagem.
- Prepare a 0,105 g / ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, MW = 191,7 g / mol) e 0,163 g / ml de sulfo-N-hidroxissulf (sulfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluções em tampão MES em tubos separados.
- Adicionar 150 ul de solução recém-preparada de EDC, gota a gota, à suspensão de microesferas. O EDC hidrolisa muito rapidamente, pelo que é essencial para utilizar feita recentemente solução para assegurar a eficiência de imobilização. Imediatamente após a adição de EDC, adicionar 150 ul de solução de sulfo-NHS para as microesferas, misturar bem por pipetagem e verificar se a suspensão homogénea.
- Tampe o tubo, selá-lo com Parafilm, e colocá-lo em uma coqueteleira. Agite a 1.500 rpm, durante 4 horas, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio.
- Centrifugar as suspens microesferasion a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul de PBS / SDS 3x tampão como descrito no passo 1.5.
- Adicionar 200 ul de tampão PBS / SDS ao precipitado, as microesferas misturar bem e transferir a solução para 300 ul de tampão PBS / SDS contendo 60 ug de anticorpos de captura. É importante para suspender o sedimento de microsferas primeiro e, em seguida, adicionar a suspensão de microesferas para a solução de anticorpo.
- Incubar a mistura de anticorpos-microesferas agitando a 1.500 rpm, durante 4 horas em um shaker, proteger da luz usando uma caixa coberta com papel alumínio.
- Centrifugar a suspensão de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar uma pelete e remover o sobrenadante. Lave as microesferas com 500 ul StartingBlock (TBS) bloqueando 3x tampão, como descrito no passo 1.5.
- Misturar microesferas com 1 ml de TBS tampão de bloqueio e incubar microesferas a 1.500 rpm durante 1 hora, num agitador, proteger da luz usando um enseada caixavermelho com folha de alumínio.
- Centrifugar a suspensão de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Lava-se a pelete 3x com 500 ul de TBS tampão de bloqueio, como descrito no passo 1.5.
- Centrifugar a solução de microesferas a 7.000 rpm, durante 3 minutos, para formar um sedimento e remove-se o sobrenadante. Adicionar 500 mL de TBS tampão de bloqueio e misture por pipetagem.
- Armazenar a suspensão de microesferas modificadas a 4 ° C até à sua utilização, proteger da luz.
- Repita este procedimento para fazer outros tipos de microesferas utilizando anticorpos correspondentes.
3. Assembléia Microarray de fibra óptica
- Misturar 50 ul de cada tipo de micro-esferas de captura de proteína para um novo tubo de microcentrifugação esterilizado. Centrifugue as microesferas imagens reunir a 7.000 rpm, durante 3 min, e remover o sobrenadante, de modo que o volume remanescente é de aproximadamente 100 ul.
- Feixes de fibra óptica cortados à mão a cerca de 5 cm de comprimento esequencialmente polir ambas as extremidades de uma máquina de polimento, utilizando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5, e 0,05 mM de diamante de tamanho de polimento filmes. Sonicar o pacote polido em água deionizada por 2 min para remover quaisquer partículas.
- Colocar uma pequena barra de agitação magnética para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, adicionar 400 mL de PBS isento de proteína padrão e agite sobre uma placa de agitação magnética durante 30 min para remover as bolhas de ar.
- Etch uma das extremidades do feixe de fibras polido em uma solução 0,025 N de HCl durante 150 segundos 10,16. Imediatamente submergir e sonicate final gravado em água deionizada por 1 min. Secam-se os feixes de fibras, com ar comprimido.
- Montagem do feixe de fibras sobre um suporte de fibra e bloquear a extremidade gravadas no, tampão PBS livre de proteína livre de bolhas durante 1 hora.
- Depósito 1 ul alíquota da suspensão de microesferas armazenado na extremidade entalhada do feixe de fibras ópticas. Proteja a instalação da luz com uma caixa com papel alumínio e aguarde 15 min. O volume da suspensão serádiminuir por evaporação e forçar as microesferas para os micropoços gravadas. Repetir esta etapa de carregamento mais uma vez.
- Utilize um cotonete saturado com solução de amostra para remover microesferas que não estão presas nos micropoços. O microarray proteína já está pronto para usar. Vá imediatamente para o passo 4.1 para a análise de saliva.
4. Análise Saliva Amostra Utilizando Microesferas Microarray
- Adicionar solução de amostra de 200 ul (100 ul de sobrenadante de saliva diluída com igual volume de StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio. Do protocolo de recolha de saliva sobrenadante foi publicada previamente 10). para um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml autoclavado. Mergulhar o microarray de proteína carregada sobre a fibra para dentro da solução e incubar num agitador a 600 rpm durante 2 h, protegido da luz utilizando uma caixa coberta com folha de alumínio.
- Preparar 20 ml de tampão de lavagem através da adição de 200 ul de solução de BSA a 10% e 200 ul de 10% de Tween-20 em 19,6 ml de PBS, mix bem agitando suavemente.
- Mergulhe o microarray de proteínas em um novo tubo de microcentrífuga autoclavada contendo 200 tampão de lavagem e agitar a 600 rpm por 2 min. Repita esta lavagem 3x.
- Incubar o microarray em solução de 100 mL de um cocktail de anticorpos de detecção que contém 5 ug / ml de anti-VEGF, IP-10, IL-8, FEG, MMP-9, anticorpos de detecção de IL-1β biotinilados em StartingBlock T20 (PBS), tampão de bloqueio durante 30 min à temperatura ambiente no agitador a 600 rpm, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio.
- Lavar 3x com tampão de lavagem de microarray, tal como descrito na etapa 4.3.
- Incubar o microarray em 200 ul de ug / ml de conjugado de R-ficoeritrina estreptavidina (SAPE) solução a 20 em PBS, a 600 rpm no agitador durante 10 minutos, proteger da luz usando uma caixa coberta com folha de alumínio.
- Lava-se a 5x com tampão de lavagem de microarray como descrito na etapa 4.3.
- Limpar a extremidade distal da fibra (isto é, na extremidade opostaa partir das microesferas) junte com um cotonete saturado com etanol absoluto.
- Seca-se ambas as extremidades da fibra com o ar comprimido. Montar a fibra num microscópio de epifluorescência e imagem através da extremidade distal da fibra.
- Adquirir imagens de microesferas correspondentes ao Eu-TTA, C30 e Sapé intensidades de emissão de fluorescência. Filtros ópticos configuração e tempo de exposição para imagens de fluorescência de Eu-TTA, C30 e SAPE estão representados na Tabela 2.
| Canal | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| Excitador | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| Refletor | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| Emitter | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| Tempo de exposição | 1 seg | 0,3 seg | 1 seg |
Tabela 2. Parâmetros para as três imagens fluorescentes de microarray.
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Representative Results
As imagens de fluorescência a partir de três canais, mostrando uma pequena parte do feixe de fibras ópticas, são mostrados nas Figuras 2A-C. Estas imagens foram analisadas utilizando um algoritmo escrito em Matlab (como descrito em mais detalhe na secção Discussão). A análise utiliza tanto a informação de codificação de imagem do Eu-ATT (Figura 2A) e da imagem de codificação C30 (Figura 2B) para descodificar as microesferas, e as intensidades de fluorescência de diferentes microesferas na imagem de sinal (Figura 2C) foram calculados. Com as curvas de calibração obtidas a partir de padrões de proteína correlacionados, as concentrações de proteínas em amostras de saliva foram calculados.
Figura 2. (A) imagem de codificação Eu-TTA, (B) imagem codificação C30, (C) imagem do sinal SAPE, (D) resultado de decodificaçãos sobreposto à imagem do sinal de; diferentes tipos de microesferas foram marcados com cores e formas diferentes.
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Discussion
Os investigadores devem prestar atenção extra para os seguintes passos: para uma melhor precisão de decodificação, é necessário verificar as microesferas foram homogeneamente suspensa em todos incubação e lavagem etapas durante o processo de microesferas de codificação. Além disso, as microesferas codificados devem ser protegidos da luz durante todo o experimento. Após os procedimentos de codificação e armazenamento adequados, descobrimos que a precisão geral de decodificação foi acima de 99%. As microesferas codificadas devem ser armazenados a 4 ° C. Evitar congelar e proteger da luz. Sob condições apropriadas de armazenamento, as microesferas codificadas são estáveis por mais de seis meses. Extremo cuidado é necessário durante as etapas de codificação e de modificação para reduzir a perda de microesferas. Por exemplo, não perturbar o pellet microesfera ao remover o sobrenadante. Além disso, inclusive de Tween-20 e SDS nos buffers é essencial para uma melhor microesfera granulação.
Alguns of os processos de resolução de problemas comuns são: (1) utilizam uma solução de EDC só recentemente preparada e a solução de EDC deve ser adicionada, gota a gota, (2) tubos de autoclave deve ser usado, e a solução de microesferas deve ser transferido para um tubo novo antes de cada passo de incubação, ( 3) durante cada passo de lavagem, para tentar remover o sobrenadante, tanto quanto possível, (4) as microesferas modificadas devem ser armazenados a 4 ° C, evitar o congelamento e proteger da luz. Sob condições de armazenamento adequadas, as microesferas modificadas podem ser armazenadas para mais de 3 meses sem perda de sinal detectável.
O algoritmo MATLAB utilizado para analisar as imagens de fluorescência é brevemente descrito abaixo. O código relevante pode ser encontrada nos materiais suplementares. Pixels dentro de uma faixa de intensidade definida pelo usuário para a imagem Eu-TTA são filtradas em primeiro lugar. Diferentes áreas foram verificados com um tamanho de filtro, áreas que contêm um centro de "oco" causado pela atenuação da luz foram removidas e as áreas ondemicroesferas estão presentes foram classificados em uma lista de observação para processamento futuro. Todas as microesferas da lista de observação foram ainda filtrada com respostas na imagem C30 correspondente. Os sinais para todos os pixels de uma microesfera especial se a média. A força do sinal desta microesfera de juros foi calculada pela média das intensidades de todas as microesferas na lista de observação. Para fazer com que os resultados estatisticamente mais representativo, um mínimo de 25 microesferas de cada tipo foi exigido. Para minimizar o sinal não específico e diminuir a variação entre experiências diferentes, os sinais de todos os tipos de microesferas foram normalizados pela subtracção do sinal de controlo a partir das microesferas.
A resposta do sinal das microesferas pode ser ajustada pela quantidade de anticorpos imobilizados na superfície das microesferas, o que é ideal para a detecção de proteínas multiplexado com ampla gama de concentrações. Com base em diferentes diâmetros das microesferas, tele quantidade de anticorpo necessária para formar uma monocamada de microsferas pode ser calculada pela equação do fabricante 17. Para as microesferas com um diâmetro de 4,5 mM, 3 mg de anticorpo é necessário por 1 mg de microesferas. Nós testamos diferentes quantidades de anticorpos na solução de acoplamento no passo 2.8 a partir de 3 mg (0,5 x) a 60 mg (10x) de anticorpo. Aumento dos sinais foram observados quando mais anticorpo foi usado na solução. Quantidades de anticorpos ideais para diferentes anticorpos e os pedidos devem ser determinadas experimentalmente. As "microesferas de controlo" foram acoplados com o anticorpo isótipo IgG de rato, que é fornecido pelo fabricante, como controlo negativo em ELISA directo e não mostrou nenhuma reactividade cruzada com até 40 proteínas recombinantes humanas 18. Para avaliar a reprodutibilidade do método de acoplamento, dois lotes de MMP-9 microesferas foram acoplados em dias diferentes. O rendimento das microesferas foi testada usando multiplexed detecção de 10 ng / ml de MMP-9. Os resultados não mostraram diferenças significativas entre os diferentes lotes de microesferas (resultados detalhados são mostrados na Tabela 3).
| Não | Data | Teste 1 | Teste 2 | Teste 3 | Média | Std. |
| 1 | 01/12/2011 | 773,8 | 690,1 | 756.8 | 740,2 | 44,2 |
| 2 | 2011/01/26 | 791,9 | 721,8 | 867,0 | 793,6 | 72,6 |
Tabela 3. A reprodutibilidade dos métodos de acoplamento (resultados apresentados em unidades arbitrárias).
O método aqui apresentado multiplexado permite rápido, preciso e reprodutívelA análise de proteínas diferentes ao longo de um largo intervalo de concentração (resultados listados na Tabela 4). A potencial reactividade cruzada para os seis pares de anticorpos que utilizados neste estudo também foi testada. Todos os sinais de reactividade cruzada foi considerado insignificante (menos do que 3%). Outras vantagens deste método, quando comparado a um convencional Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), incluem uma vasta gama dinâmica, as interacções não específicas mínimas, a redução do consumo de amostra e de baixo custo 10. O volume requerido de amostra de saliva é tão baixo como 100 ul e o ensaio pode ser completada dentro de 3,5 horas. Quando comparada com outras matrizes de suspensão, uma limitação desta abordagem é que, uma vez que a micromatriz foi montado, a detecção precisa de ser iniciada em menos de 15 min. O método aqui descrito foi usado no nosso laboratório para analisar amostras de saliva humanos recolhidos de pacientes com doenças inflamatórias e controlos saudáveis (dados não publicados). O método deve ser aplicávelpara análise de proteínas de outras amostras de fluidos complexos. Uma matriz semelhante de proteína à base de microesferas pode ser utilizado em outras plataformas, tais como dispositivos de microfluidos. A codificação e métodos de imobilização pode também ser aplicado a microsferas feitas com outros materiais 9.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| Teste 1 | 5.365,9 | 2.578,4 | 6.508,7 | 2.584,0 | 515,5 | 1.147,4 |
| Teste 2 | 5.787,8 | 2.577,9 | 7.238,9 | 2.919,2 | 375,7 | 1.099,2 |
| Teste 3 | 4.944,6 | 2.883,3 | 6.726,3 | 3.619,3 | 406,8 | 1.084,1 |
| Média | 5.366,1 | 2.679,9 | 6.824,6 | 3.040,8 | 432,7 | 1.110,2 |
| Std. Dev | 421,6 | 176,2 | 374,9 | 528,3 | 73,4 | 33,1 |
Tabela 4. Os resultados para os três testes independentes sobre a mesma amostra de saliva (resultados apresentados em unidades arbitrárias).
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant 08UDE017788-05). EBP também reconhece o apoio da Fundação Espanhola para a Ciência e Tecnologia (FECYT). Os autores agradecem a Shonda T. Gaylord e Pratyusha Mogalisetti para a leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
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