Summary
גליומות ממאירות מהוות קבוצה הטרוגנית של ניאופלסמות גליה מסתננות מאוד עם תכונות קליניות ומולקולריות מובהקות. קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים מסכמים מחדש את התכונות ההיסטופתולוגיות והמולקולריות של תת-סוגים ממאירים של גליומה במודלים פרה-קוליניים של בעלי חיים.
Abstract
גליומות ממאירות מהוות קבוצה הטרוגנית של ניאופלסמות גליה מסתננות מאוד עם תכונות קליניות ומולקולריות מובהקות. קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים מסכמים מחדש את התכונות ההיסטופתולוגיות והמולקולריות של תת-סוגים ממאירים של גליומה במודלים פרה-קוליניים של בעלי חיים. כדי מודל WHO ציונים III ו IV גליומות ממאירות מבחני השתלה, תאים סרטניים אנושיים הם xenografted לתוך אתר אורתוטופי, המוח, של עכברים immunocompromised. בניגוד לשנאת זרים משנית המשתמשת בתאי גידול מתורבתים, תאי גליומה אנושיים מנותקים מדגימות שננשכו ומושתלים ללא מעבר קודם בתרבית הרקמות כדי ליצור קסנוגרפטים ראשוניים. ההליך בדו"ח זה מפרט הכנת מדגם הגידול, השתלה תוך נדרית לעכברים immunocompromised, ניטור תחריט הגידול וקציר הגידול למעבר הבא לתוך בעלי חיים המטופל או ניתוח. הכנת תאים סרטניים דורשת 2 שעות והליך כירורגי דורש 20 דקות / בעל חיים.
Introduction
גליומות ממאירות הן גידולי גליה ראשוניים של מערכת העצבים המרכזית המתרחשים במוח ולעיתים בחוט השדרה. Gliomas מסווגים על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) על פי הדמיון היסטולוגי אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים או תאים ependymal ולאחר מכן מדורגים מספרית (אני עד IV) עבור תכונות פתולוגיות של ממאירות. תת-הסוגים ההיסטולוגיים הנפוצים ביותר הם אסטרוציטומות, אוליגודאנדרוגליומות ואוליגואסטרוציטומות מעורבות. גליומות ממאירות המקיפות את ציוני WHO II עד IV מאופיינים בצמיחה פולשנית ו recalcitrance לטיפולים הנוכחיים. בכל שנה בארצות הברית, כ 15,750 אנשים מאובחנים עם גליומה ממאירה וכ -12,740 חולים נכנעים למחלה זו. נתונים סטטיסטיים אלה מדגישים את האופי הקטלני במיוחד של גליומות ממאירות ואת הצורך החשוב ביעילות טיפולית משופרת.
מודלים של סרטן חיוניים לחקר ביולוגיה של גידולים וטיפולים. קווי תאים סרטניים אנושיים מייצגים צעד ראשון חשוב עבור מניפולציות במבחנה ומחקרים vivo xenografting (xenografts משני)1. עם זאת, תרביות תאים סרטניים סטנדרטיים עוברים טרנספורמציה פנוטיפית וגנוטיפית2-4 שלא ניתן לשחזר בקסנוגרפטים משניים5. יתר על כן, שינויים גנטיים כגון מוטציות isocitrate dehydrogenase(IDH)6 ,אוכלוסיותתאי גזע שונות7 ותלות במסלולי איתות מרכזיים8 יכולים ללכת לאיבוד בתרביות תאים סרטן. פרופילים גנומיים ניתן לשמור במידה רבה יותר בתרבות כדור הסרטן, אם כי עדיין לא מצליחים לשקף באופן מלא את הגנוטיפ של גידולים ראשוניים2,3. השתלה אורתוטופית ישירה שוללת את ההשפעות של תרבות במבחנה, מספקת מיקרו-ווירוניזציה נאותה, ושומרת על שלמותם של תאים יוזמים גידולים9,10. לכן, קסנוגרפטים ראשוניים מייצגים מודל פרה-קליני רב עוצמה ורלוונטי לבדיקה קפדנית של סוכנים ממוקדים כדי לסייע בתכנון הרציונלי של ניסויים קליניים עתידיים5,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת השעיית תאים סרטניים
שים לב: אישורים מוסדיים מתאימים לשימוש בחומר החולה ובעלי חיים נדרשים להקים ולתחזק גליומה אורתוטופית ראשונית xenografts. במרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט, חומר גידול חתוך כי הוא מעבר לזה הנדרש למטרות אבחון נאסף בהסכמת המטופל למאגר רקמת מחקר. דגימות מסומנות במספר אקראי של מסד נתונים REDcap בן 5 ספרות וכל המזהים הספציפיים למטופל מוסרים. מסד הנתונים REDcap מכיל נתונים קליניים מזוהים עבור כל דגימה במאגר הרקמות הכולל מין, גיל (בשנים), גזע, מצב הישרדות, פתולוגיה, טיפולים בסרטן, שנת כריתה, וזמן להתקדם. כדי לשמור על סטריליות ולייעל את ההצלחה של שיטת xenograft העיקרית, כל ריאגנטים, מכשירים כירורגיים steam-autoclaved, ואת האתר הכירורגי צריך להיות מורכב או מוכן מראש.
שים לב: דגימות גליומה מכילות לעתים קרובות כמויות גדולות של מיאלין ופסולת. בהתאם לגודל הדגימה, ייתכן שיהיה צורך להשתמש ביותר מ 4 צינורות שיפוע רציפים להסרת נאותה של מיאלין ופסולת.
שים לב: התהליך הושלם כאשר אין, או מעט, נראה בבירור רקמה לא ממושמעת שנותרה. הימנע מהכנסת בועות במהלך תהליך הטריטורציה.
שים לב: הכדאיות של התא לאחר הניתוק היא בדרך כלל >90%. viabilities נמוך יותר עשוי לשקף משתנים רבים כולל טיפול ברקמות תת-אופטימליות או זמן הובלה מחדר הניתוח, שיטת cryopreservation, או טכניקת דיסוציאציה פפאין. viabilities הסלולר התחתון עדיין עשוי להיות מספיק, עם זאת, כל עוד מספר מספיק של קיימא עשוי להיות מושתל בנפח המתאים. עבור כל עכבר, 50,000-200,000 תאים בני קיימא מושתלים בנפח של 2 μl. בשל קצה משופע של מחט המזרק, תוספת של 5 μl של השעיית התא צריך להיכלל בנפח הסופי כדי להבטיח כי חומר הולם ניתן למשוך לתוך המזרק עבור כל זריקה. לדוגמה, כדי להזריק 2 μl / עכבר עבור 5 עכברים הנפח הסופי צריך להיות 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl).
- מניחים את חומר החולה שזה עתה הוקדש למחילה במיכל סטרילי ומכוסה על קרח להובלה למעבדה. לעבד את הדגימה ישירות להשתלה או cryopreserve את הדגימה חנקן נוזלי (ראה להלן) לאחסון חנקן נוזלי ושימוש מאוחר יותר.
- הכן את פתרונות דיסוציאציה פפאין (פתרון פפאין, פתרון מעכב לשטוף / פרוטאז פתרון הדרגתי רציפה) במכסה המנוע סטרילי עם רכיבי הערכה והוראות שסופקו על ידי היצרן. תווית סטרילית 15 מיליליטר פוליסטירן צינורות חרוטים ולהפיץ את הפתרונות כדלקמן:
- צינור 1: 5 מ"ל של פתרון פפאין
- צינור 2: 3 מ"ל של תמיסת מעכבי שטיפה/פרוטאז
- צינורות 3-6: 5 מ"ל כל פתרון שיפוע לא רציף
- מניחים את דגימת גליומה בצינור 1 עם 5 מ"ל של פתרון פפאין ו triturate עם פיפטה 5 מיליליטר על פני 10-20 דקות זמן.
- פיפטה החומר למעלה ולמטה 10 פעמים ולאחר מכן להדגיר את החומר במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר לפני ייזום המחזור הבא של trituration.
- מקם את קצה פיפטה 5 מיליליטר קרוב יותר לתחתית הצינור חרוט עם כל מחזור של trituration כך הקצה נוגע בתחתית הצינור במשך 2 המחזורים האחרונים.
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו pipette גלולה למעלה ולמטה 10x ב 3 מ"ל של הפתרון מעכב לשטוף / פרוטאז.
- בזהירות שכבה נפח שווה של ההשעיה על כל אחד 5 מ"ל פתרונות הדרגתיים רציפים (צינורות 3-6), עם pipettor להגדיר במהירות "כוח הכבידה".
- מניחים את הצינורות בצנטריפוגה המצוידת ברוטור מתנדנד, כאשר מהירות ההאצה מצטמצמת להגדרה הנמוכה ביותר והבלם כבוי. צנטריפוגה ב 76 x גרם במשך 12 דקות בטמפרטורת החדר. עם הבלם כבוי, צנטריפוגה הושלמה בדרך כלל לאחר 20 דקות.
- הסר את supernatant, resuspend ולשלב כל גלולה ב 5 מ"ל של פתרון מלח מאוזן סטרילי ומניחים את התאים על קרח.
- הסר חלק (10-100 μl) של השעיית התא ולקבוע את הצפיפות של תאים קיימא על ידי הדרה כחול trypan עם המוציטרומטר.
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולת התא בצפיפות של 25,000-125,000 תאים קיימא לכל μl.
- להעביר נפח הולם של השעיית התא לצינור microcentrifuge 200 μl (צינור PCR) ומניחים על קרח.
2. הכנת אתר כירורגי ומכשירים
שים לב: כפפות כירורגיות סטריליות משוחק במהלך ההליך. בהתאם לדרישות של כל מוסד, שמלות כירורגיות, כובעים ושומרי פנים עשויים להידרש.
- הכינו ספסל מחוטא לניתוח מכרסמים עם אזורים סמוכים מופרדים להכנת בעלי חיים, שדה הפעלה והתאוששות בעלי חיים.
- לעקר מכשירים כירורגיים במובלעת קיטור. לאחר מכן, השתמש מעקר חרוז חם כדי להבהב-לעקר מכשירים בעת מעבר מבעל חיים אחד כפוף הבא.
3. אינדוקציה, הרדמה ומשככי כאבים
שים לב: ניתוחים העולים על 15 דקות מהרגע שהעכברים מורדמים דורשים מקור חום מגע. כדי למנוע היפותרמיה, העכברים מסופקים עם מקור חום (שמיכת מים חמים במחזור) בתקופות שלפני ואחרי הניתוח.
- הכן קוקטייל קטמין /xylazine להרדמה אינדוקציה כך שכל עכבר מקבל קטמין 100 מ"ג / קילוגרם ו xylazine 10 מ"ג / קילוגרם על ידי הזרקת 10 μl של קוקטייל לכל גרם של משקל גוף.
-
שולחן 1. קוקטייל הרדמה.
ריכוז מלאי אמצעי אחסון להתכונן אליו עכבר אחד חמישה עכברים עשרה עכברים קטמין (קטמין) 100 מ"ג/מ"ל 25 מיקרול 125 מיקרול 250 מיקרול קסילאצין (1991) 100 מ"ג/מ"ל 2.5 מיקרול 12.5 מיקרול 25 מיקרול תמיסת מלח איזוטונית 223 מיקרול 1,113 מיקרול 2,225 מיקרול סך 250 אול 1,250 מיקרול 2,500 מיקרול - הכן פתרון ketoprofen עבור משככי כאבים על ידי דילול פתרון המניה (10 מ"ג / מיליליטר) 1:20 במים סטריליים, ללא פיוג'ן כך שכל עכבר מקבל מנה של 5 מ"ג / קילוגרם על ידי הזרקת 10 μl של הפתרון לכל גרם של משקל גוף.
- לשקול ולתעד משקל טרום כירורגי. משקלי עכבר בודדים משתנים, אך בדרך כלל נעים בין 18-22 גרם.
- להזריק 10 μl של קוקטייל קטמין / xylazine לכל גרם של משקל גוף העכבר לתוך החלל תוך-פריטוני עם מזרק אינסולין. לדוגמה, להזריק 200 μl עבור עכבר 20 גרם.
- קבע אם העכבר מורדם לחלוטין על-ידי קמצוץ בוהן של הרגל האחורית. בדרך כלל לוקח 3-5 דקות עד שהעכבר כבר לא נסוג מהצביטה.
- להזריק 10 μl של פתרון ketoprofen לכל גרם של משקל גוף העכבר תת עורית בעור רופף של האגף עם מזרק אינסולין. לדוגמה, להזריק 200 μl עבור עכבר 20 גרם.
- לגלח את השיער על הגולגולת עם קוצץ, לשפשף את הקרקפת החשופה עם povidone-יוד באמצעות אפליקטור קצה כותנה ולאחר מכן לנגב כרית אלכוהול. חזור על צעדים אלה, לשפשף povidone-יוד ולנגב אלכוהול, פעמיים נוספות.
- החל משחה עיניים על העיניים של העכבר.
- הפוך חתך קו האמצע 1 ס"מ המשתרע מאחורי האוזניים רק מול העיניים עם להב אזמל סטרילי.
- הנח את העכבר תחת טווח ניתוח וחשוף את הגולגולת כדי לזהות את קווי התפירה. באמצעות תנועות מעגליות עם מקדחה, מרכז חור בר 2.5 מ"מ לרוחב ל bregma ו 1 מ"מ אחורי לתפר קורנל.
4. השתלה תוך נדרית
שים לב: נפחי הזרקה העולים על 2.5 μl עלולים להיות קטלניים לעכברים.
- מקם את העכבר על מסגרת סטראוטקטית על-ידי חיבור החותכות העליונות מעל מוט החותך והחלת מלחצי האף כך שהגולגולת מוחזקת היטב בתנוחה נייטרלית.
- לצייר 5-10 μl של התאים בצינור microcentrifuge למעלה ולמטה מספר פעמים לתוך מזרק המילטון 10 μl מהודק במחזיק הבדיקה של מניפולטור סטריאוטקטי לערבב את ההשעיה ולחסל בועות. לדכא את הכוכנה, כך המזרק טעון עם 2 μl (נפח מספיק כדי להזריק בעל חיים אחד).
- משוך את הקצה לרוחב של חתך העור כדי לחשוף את חור בר, עם micromanipulator, להציג את המחט לתוך חור בר, כך החלק משופע הוא ממש מתחת לפני השטח של הגולגולת.
- קדם את המחט 3 מ"מ ולאחר מכן למשוך את המחט 0.5 מ"מ כדי ליצור מקום להזרקה.
- לקדם את הכוען לאט מעל 30 שניות ולאחר מכן לאפשר את המחט להישאר במוח במשך 2 דקות נוספות. משוך את המחט בהדרגה על ידי עלייה של 0.5 מ"מ ומחכה 30 שניות נוספות לפני הסרת המחט מהמוח.
- הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקטית וסגור את הפצע עם תמונה אוטומטית.
- מניחים את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ולפקח ברציפות על דפוס הנשימה והצבע של קרום רירי ורקמות חשופות (כפות הרגליים).
- מניחים את העכבר בכלוב מיקרוסולטור סטרילי ברגע שהוא מתאושש באופן מלא מהרדמה (עצם החזה ואמבולטוריום), ולהחזיר אותו למתקן דיור בעלי חיים.
5. טיפול ותצפית בבעלי חיים לאחר ההשתלה
שים לב: האינדיקציה האמינה ביותר של תחריט הגידול וצמיחה הסתננות היא הדרגתית, ירידה במשקל מתמשכת מלווה בפיתוח של יציבה רכון ומעיל שיער מחוספס. במקרים נדירים, גירעונות נוירולוגיים מצוינים הכוללים אטקסיה, paresis, והתקפים. קסנוגרפטים ראשוניים אורתוטופיים הם פולשניים מאוד ומתפתחים לאורך תקופה ארוכה של זמן. עכברים בדרך כלל להתבטא סימפטומים של גידול 3-6 חודשים לאחר ההשתלה.
- שימו לב לעכברים עם קסנוגרפטים אורתוטופיים מדי יום לצריכת מזון ומים, התנהגות, טיפוח וסימני זיהום באתר החתך.
- יש לתת קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג תת עורית, 1-2x ביום) במקרה של כאב או מצוקה לאחר הניתוח.
- הסר autoclips 8-10 ימים לאחר הניתוח.
- לשקול עכברים מדי שבוע.
- לפקח על סימנים ותסמינים של תחריט הגידול.
6. קצירת גידולים
שים לב: בשיטה זו, פרוסת הקורונל הראשונה (#1) מכילה את ההיבט האחורי של נורות הריח ואת ההיבט הקדמי של האונות הקדמיות. גידול חרוט הוא הנפוץ ביותר בחצי הכדור הימני של 3 פרוסות קורנל הבאות (פרוסות #2, #3 #4) ומראה ההזרקה כלול באופן שגרתי בפרוסת קורנל #3. בהתאם לצרכים ניסיוניים, החומר עשוי לשמש למעבר גידולים, מקטעי רקמות קפואות, מקטעי רקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין, ציטומטריית זרימה של רקמה מנותקת, תרבית תאים או ליסטים לניתוח DNA, RNA או חלבון. חלקים של הגידול עשוי להיות cryopreserved לצרכים עתידיים עם הכדאיות התא החל 80-95%.
- המתת חסד עכברים על ידי חשיפה ממושכת לפחמן דו חמצני ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- ערפו את ראשם של עכברים מורדמים בבסיס המוח (רמת מגנום קדמי) עם זוג גדול יותר של מספריים כירורגיים, ומשוך את העור מחתך קדימה כדי לחשוף את הגולגולת במלואה.
- הסר את המוח.
- הכנס קצה אחד של זוג מספריים כירורגיים עדינים להיבט הצדדי של מגנום הפורמן לרמה של בשר השמיעה החיצוני השמאלי כדי לחתוך את עצם העורף לאורך הצד השמאלי של הגולגולת. בצע את אותו חתך בצד ימין.
- חותכים את עצם העורף לאורך מישור קורנל מבשר שמיעתי חיצוני אחד לשני ומסירים את העצם כדי לחשוף את המוח הקטן.
- חותכים את צלחות עצם האף בין העיניים.
- חותכים את התפר הסגיטלי על ידי חיתוך אחורי לאורך התפר הסגיטלי מצלחות עצם האף אל bregma. להשלים את החתך קו האמצע לאורך תפר קשת על ידי חיתוך לפני הלמבדה אל bregma.
- בזהירות להכניס את הקצה של זוג דק של מלקחיים לאורך פתח sagittal מכל צד לקרוע כל הידבקות dural של הגולגולת למוח ולאחר מכן לקלף את שני חצאי הגולגולת לרוחב כדי לחשוף את המוח ואת נורות חוש הריח dorsally.
- החלק את המלקחיים בין ההיבט הגחוני של נורות הריח והגולגולת כדי לשחרר את כל ההידבקויות.
- הטה את הגולגולת לאחור כדי לאפשר למוח לחזור בו, כך עצבי הראייה ועצבי גולגולת אחרים נחשפים. לנתק את עצבי הגולגולת כדי לשחרר את המוח לתוך צלחת המכילה PBS סטרילי.
- מעבירים את המוח עם מרית במשקל לפרוסת מטריצה ויוצרים פרוסות קורנל 2 מ"מ עם סכיני גילוח.
- מסדרים את פרוסות הקורונל בצלחת המכילה PBS סטרילי לבדיקה ויזואלית נוספת ועיבוד רקמות נוסף.
7. הקפאה של גידולים
- הכן פתרון מלאי של מדיום cryopreservation.
- הוסף 50 מ"ל של תוסף התפשטות, 5 מ"ל של 100x פניצילין ותמיסת סטרפטומיצין, ו 450 μl של 0.2% הפרין ל 450 מ"ל של בינוני בסיסי.
- יש לאחסן את הפתרון במלאי ב-4°C מוגן מפני אור.
- הכן פתרון עבודה של מדיום cryopreservation.
- ערבבו 47.5 מ"ל של מדיום קריו-שימור ו-2.5 מ"ל של DMSO סטרילי בצינור חרוט פוליפרופילן של 50 מ"ל ומערבבים היטב.
- Aliquot 1.0 מ"ל של פתרון עבודה לכל cryovial ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
- מניחים פרוסת קורונל אחת 2 מ"מ של מוח קסנוגרפט לתוך cryovial המכיל מדיום cryopreservation על קרח.
- מכסים בחוזקה את הבקבוקון ומניחים אותו במיכל מקפיא ב -80 מעלות צלזיוס. מעבירים את ההקפאה למחרת למיכל חנקן נוזלי לאחסון ארוך יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי גליומה מנותקים מושתלים ישירות במוחם של עכברים חיסוניים כדי להשיג קווי קסנוגרפט אורתוטופיים ראשוניים. כל דגימת גידול מוקצית מספר אקראי לפני ההשתלה, כחלק מתהליך deidentification כדי להסיר מידע בריאותי מוגן. אנו משתמשים במספר מסד נתונים REDcap בן 5 ספרות למטרה זו. איור 1 ממחיש את התהליך ואת המינוח ליצירת קו קסנוגרפט מגליבלסטומה (GBM 17182) עם מוטציה isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) מוטציה ארגינין 132 להיסטידין (R132H). לאחר ההשתלה נוסף "X" למספר זיהוי הגידול כדי לציין גידול xenografted, ואחריו "P" כדי לעקוב אחר מספר המעבר. P0 מייעד את מושתל הראשוני P1 מייעד עכברים המטופל של המעבר הראשון xenograft. בדרך כלל, 3-5 עכברים מושתלים בתחילה כדי להקים קו וגידול xenografted מועבר לאחר מכן לתוך 10 עכברים המטופל (P1) כדי להרחיב את הקו למחקרים עתידיים.
בעקבות השתלה אורתוטופית, עכברים המטופל מנוטרים סימנים ותסמינים של תחריט הגידול וצמיחה. האינדיקציה הרגישה ביותר של תחריט הגידול היא ירידה משמעותית ומתמשכת במשקל. כמו עכברים מושתלים בגיל צעיר, עלייה במשקל לאחר הניתוח צפוי. משקולות עכבר עשוי להשתנות בצורה דרמטית לכאורה משבוע לשבוע, אולם אובדן מתמשך של יותר מ 3 גרם הוא בדרך כלל אינדיקציה טובה של תחריט הגידול. בדרך כלל, רוב העכברים בקבוצת קסנוגרפט לפתח ירידה במשקל על פני תקופה דומה של זמן נע בין קצר ככל 60 ימים כל עוד 350 ימים בהתאם לגידול. זמני ההישרדות החציוניים לגידול נתון דומים בדרך כלל ממעבר למעבר כאשר אותו מספר תאים סרטניים מושתלים בכל פעם. איור 2 הוא קבוצה של 5 עכברים שהושתלו ב-GBM (17182XP2) שנחרטו בעבר והועברו בעבר. ארבעה מתוך חמשת העכברים 17182XP2 הפגינו ירידה משמעותית במשקל 17 שבועות לאחר ההשתלה. העכבר הנותר (עכבר 3) לא הפגין ירידה במשקל ולא זוהה גידול בבדיקה שלאחר המוות, מה שמצביע על חריטה של גידול רק ב -80% מהמטופלים.
כאשר המוח של עכבר סימפטומטי נקצר, מטריצת כלי פריסה במוח היא כלי בעל ערך רב לעיבוד רקמות. הדור של חלקים מרובים, מוגדרים אנטומית מכל מוח מאפשר מצבי ניתוח מרובים עם כמה מנות cryopreservation של חלקים אחרים של הרקמה. לדוגמה, ניתן להעריך את מצב המוטציה של IDH1 על ידי רצף סנגר עם חומר מחלק אחד או אימונוהיסטוכימיה עם אחר (איור 3). תחריט הגידול עשוי להיות גלוי בקלות על ידי בדיקה חזותית של החלקים הכתר, עם זאת, היסטולוגיה עם אימונוהיסטוכימיה עשוי להידרש עבור כמה xenografts (איורים 4 ו 5). בעת ניתוק קסנוגרפט למעבר סדרתי או מחקרים אחרים, חשוב להתחיל עם חלק קטן ומוגדר של חומר, כך שמיאלין ופסולת יוסרו כראוי (איור 6). השיפוע ללא הפסקה של מערכת הדיסוציאציה Papain מתאים ביותר לעיבוד חלקים קטנים של מוח עכבר בוגר. אנו ממליצים לחתוך כל קטע קורנל לאורך קו האמצע ולהשתמש בשני מעברי צבע רציפים לכל מחצית.
איור 1. קווי קסנוגרפט אורתוטופיים ראשוניים הוקמו על ידי השתלת תאי גליומה מנותקים ישירות לתוך המוחות של עכברים immunocompromised ולאחר מכן מורחב על ידי השתלה סדרתית. מוטציות סומטיות הטרוזיגוטיות בארגינין 132 של הגן IDH1 מתרחשות ביותר מ-70% מהאסטרוציטומות המפוזרות, האוליגודנדרוגליומות, אוליגואסטרוציטומות וגליאובלסטומות משניות, ופחות מ-7% מהגליובלסטומות העיקריות. GBM 17182 מכיל את המוטציה IDH1 הנפוצה ביותר, ארגינין 132 להיסטידין (R132H). לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 2. עקומות צמיחה של מושתלים סדרתיים של GBM 17182XP1 להפגין ירידה משמעותית במשקל 130-150 ימים לאחר הניתוח ב 4 של 5 GBM 17182XP2 עכברים. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 3. מוטציה הטרוזיגית, סומטית IDH1 R132H בגידול החולה (GBM 17182) ושנאת שופכה ראשונית (17182XP0) ניתן לזהות על ידי רצף סנגר או כתמי נוגדן. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן ספציפי ל- IDH1 R132H מדגימה תאי גליומה מוטנטים המקובצים בצפיפות סביב כלי הדם או באזורים שחדרו בצורה מפוזרת יותר לדגימה החולה ולמוח העכבר. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 4. קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים מציגים צמיחה חדירה מאוד שעשויה להיות קשה להעריך באופן מלא על ידי המטוקסילין ו eosin (H &E) מכתים לבד. אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן ספציפי לבני אדם היא שיטה שימושית במיוחד לזיהוי תאים אנושיים חרוטים. מכתים וינמנטין אנטי-אנושי של אוליגואסטרוציטומה אנאלפלסטית קסנוגרפט (14175XP2) חושף תכונות אופייניות של גליומה מסתנן עם מסת גידול מפוזרת חצי הכדור הימני מוזרק וצמיחה פולשנית לאורך דרכי מיאלין של כפיס המוח (כוכביות) ואת סיבי striatopallidal (ראשי חץ שחורים) והפצה leptomeningeal (חץ שחור). לא מוערך בהגדלה זו (1.25X) הוא clustering של תאים סרטניים אנושיים סביב נוירונים העכבר (satellitosis פרינורנלית) בקליפת המוח הפולש. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 5. ניתוח של אוליגואסטרוציטומה אנאפלסטית 14175XP2 מקטעי קורנל בהספק גבוה יותר (40X) באזורים ארוזים A-C מגלה תאים אנושיים מוטנטים IDH סביב כלי הדם (אזור A), בדרכי striatopallidal ("סיבי עיפרון;" אזור B) ואת כפיס המוח הקורפוס (אזור C). כמו עם GBM 17182XP2, IDH1 R132H כתמים של אוליגואסטרוציטומה אנאפלסטית 14175XP2 מדגים כי מוטציה IDH נשמרת קסנוגרפט אורתוטופי ראשי בעקבות מעברים סדרתיים בעכברים המטופל. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 6. תאים סרטניים אנושיים ניתן להבחין בין תאי עכבר קסנוגרפטים מנותקים בהתבסס על גודל. כדי לכמת תאים סרטניים אנושיים בקסנוגרפט מנותק למעבר סדרתי, תאים אנושיים מזוהים בהמוציטומטר תחת מיקרוסקופיה קלה על ידי גודלם הגדול והאווירה הירוקה הכהה (ראשי חץ). על ידי cytometry זרימה, תאים אנושיים יש תכונות פיזור ברור מחומר העכבר והוא יכול להיות מגודר לניתוח נוסף. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קווי תאים מתורבתים, קסנוגרפטים ועכברים מהונדסים גנטית הם השיטות הנפוצות ביותר למידול גליומות, ויש יתרונות ומגבלות ברורים עבור כל מערכת מודל3,13,14. היתרונות הרלוונטיים של גליומה אורתוטופית ראשונית xenografts כוללים צמיחה חדירה המאפיין גליומות מפוזרות ושמירה על שינויים גנטיים ומנגנוני איתות חשובים שיכולים להיות קשים מאוד לתחזוקה בתאי גליומה מתורבתים. לדוגמה, אניsocitrate דהידרוגנאז מוטציות וייצור ליגנד קיפוד סוניק ניתן לשמור על קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים15,16 אבל רק לעתים רחוקות בתאי גליומה מתורבתים14,17-19. חשוב לשקול חסרונות משמעותיים של קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים, עם זאת, בהתאם לצרכים ניסיוניים. למרות הגישה לחומר מטופל הולם, קשה יותר למדוד צמיחת גליומה לאורך זמן במוח מאשר באתר הטרוטופי. בנוסף, קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים גדלים בקצב איטי משמעותית מאשר קסנוגרפטים הטרוטופיים. לכן החוקרים עשויים להעדיף השתלת תאים לתוך האגף של עכבר immunocompromised, שבו תכונות היסטולוגיות ומולקולריות חשובות עשויות להישמר גם4.
שני שיקולים חשובים להקמת קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים הם סוג של נמען עכבר immunocompromised ואת הציון של ממאירות גליומה. הייתה לנו הצלחה מוגבלת מאוד בהקמת קסנוגרפטים ראשוניים בעכברים אתמיים (נו-נו) והצלחה טובה באותה מידה עם NOD / SCID ו- NSG (NOD /SCID / Interleukin-2 קולטן gשרשרת אמה לקוי) עכברים. עכברי NSG הם מטופלים עדיפים בגלל קצב חריטה מוגבר של תאים tumorigenic ותוחלת חיים ארוכה יותר בהשוואה לעכברי NOD / SCID20,21. לגבי דרגת הגידול של WHO, ראינו חריטה גליומה של גידולים בדרגה III ו- IV אך לא ציונים I ו- II.
עבור גליומה אורתוטופית ראשונית xenografts, תאים סרטניים מנותקים עשויים להיות מושתלים ישירות לתוך המוח של עכברים immunocompromised9 או תאים ביוזמת הגידול עשוי להיות מבודד פוטנציאלית (למשל על ידי בחירת תאים מבטאים CD133) להשתלה22. כל מקור של תאים מתאים תחריט הגידול מוצלח מניסיוננו15,16, אם כי השימוש בתאים מועשרים CD133 דורש חומר התחלתי יותר. בין אם הכנת תאים ממוינים או לא ממוינים להשתלה, חשוב להסיר כראוי מיאלין ופסולת מדגימות גליומה מנותקות. כישלון להסיר כראוי מיאלין ופסולת פוגע במידה ניכרת ביכולת למשוך את ההשעיה לתוך מזרק המילטון ולהשתלת מספר אחיד של תאים לתוך כל נמען. בעקבות ניתוק פפאין, כדאי להעריך aliquot קטן באמצעות המוציטרומטר על מנת לקבוע את מספר צינורות שיפוע רציפה שיידרשו מספיק כדי לחסל מיאלין ופסולת. הסרה מלאה אינה אפשרית, אבל אפשר לקבל הערכה לקושי לכמת תאים בדגימה מנותקת לפני הסרת מיאלין ואת הקלות היחסית לאחר הסרה עם מעברי צבע רציפים.
התשואה של תאים בני קיימא מדגימות חולה מנותק יכול להיות משתנה מאוד. באופן אופטימלי, 105 תאים מושתלים בכל אחד מחמישה עכברים מטופלים למרות שהשגנו תחריט עם מעט כמו 3,000 תאים / בעלי חיים. כמחצית מדגימות גליומה ממאירות העיקריות (WHO ציונים III ו- IV) שהשתלנו חרטו ב 40-100% של העכברים המטופל הראשוני. לאחר השתלה אורתוטופית, עכברים המטופל חייב להיות שקל שבועי במעקב קבוע עבור סימנים ותסמינים של תחריט הגידול וצמיחה. קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים מדגימים תסמינים נוירולוגיים מפוזרים, מסתננים ומוקדים כגון המיפרזיס או התקפים רק במקרים נדירים. האינדיקציה הרגישה ביותר של תחריט הגידול היא ירידה משמעותית ומתמשכת במשקל שעשויה להיות מלווה בהתפתחות של יציבה רכון, מעיל שיער מחוספס או גולגולת כיפה. הקצב שבו עכברים לפתח ירידה במשקל מתמשכת משתנה מאוד בהתאם לדגימה המטופל והוא יכול לנוע בין 60-350 ימים. עכברי NSG שוקלים בדרך כלל 18-25 גרם בהשתלה ומשיגים לאחר הניתוח משקלים בוגרים של 28-33 גרם. חומר מצעים צריך להיות שונה באופן קבוע כמו תנאי הכלוב עשוי לשנות משקולות בעלי חיים במידה ניכרת. משקולות של בעל חיים עשויות להשתנות על ידי ככל גרם משבוע אחד למשנהו, ולקבוע אם זה מייצג תחריט הגידול יכול להיות קשה. אינדיקציה טובה של תחריט הגידול בעכברי NSG שהשיגו משקולות למבוגרים הוא מתמשך ירידה במשקל של יותר מ 3 גרם. למרות עכברים חרוטים בדרך כלל לפתח ירידה במשקל הדרגתית שניתן למדוד על פני תקופה של כמה שבועות, מדי פעם בריאותו של בעל חיים עשוי לרדת במהירות עקב צמיחת הגידול, בעקבות התפתחות הידרוצפלוס למשל, או מסיבות שאינן קשורות כגון זיהום.
לאחר המתת חסד, תחריט הגידול לא יכול להיות גלוי בקלות על ידי בדיקה ברוטו של המוח ואישור היסטולוגי הוא חיוני. עבור מקבלי הגידול הראשוני, אנו מעבדים כל מוח באותו אופן, כך שחלק אחד מוערך מבחינה היסטולוגית וחלקים אחרים הם cryopreserved למעבר הגידול הבאים אם החריטה מאומתת. כפי שנדון לעיל, המוח ממוקם בכלי פריסה מטריצה כדי ליצור פרוסות קורנל 2 מ"מ עם כל פרוסה המייצגת אזור מוגדר של המוח לאורך הציר האחורי עד האחורי. פרוסת קורונל #3, המכילה באופן שגרתי את אתר ההזרקה, קבועה בפורמלין וכל אחת מהפרוסות הנותרות ממוקמת בקריובל נפרד ומסומן המכיל 1 מ"ל של מדיום קריו-שימור. פורמלין קבוע פרפין מוטבע (FFPE) שקופיות מוכתמים hematoxylin ו אאוסין כדי להעריך את היסטולוגיה עם נוגדנים נגד Ki67 ו vimentin אנושי לדמיין תאים חרוטים.
לאחר אימות החריטה, הגידול עשוי להיות מועבר ושיעורי החריטה אצל מטופלים משניים גבוהים בדרך כלל ב-80-100%. אנו ממליצים להעביר גידול בפעם הראשונה במספר גדול יותר של עכברים המטופל, כך חומר cryopreserved נאותה עשוי להיווצר כדי לשמור על קו גידול נתון במעבר נמוך (2-5) למחקרים עתידיים. זמני ההישרדות החציוניים לגידול נתון דומים בדרך כלל ממעבר למעבר כאשר אותו מספר תאים סרטניים מושתלים בכל פעם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו חבים במיוחד לחולים במרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט שסיפקו חומר מחקרי שלא יסולא בפז עבור בנק הרקמות הנוירוכירורגיות המולקולריות. אנו מודים לאלה שהקימו ומתחזקים את בנק הרקמות, ריד ס. תומפסון MD (החוקר הראשי), צ'רל קינארד RN (אחות מחקר) ולארי פירס טרשת נפוצה (מנהל). השירותים ההיסטולוגיים בוצעו, בין השאר, על ידי המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט (VUMC) משאב משותף פתולוגיה תרגום (נתמך על ידי פרס 5P30 CA068485 למרכז הסרטן ונדרבילט-אינגרם). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל- MKC מן NINDS (1R21NS070139), קרן Wellcome בורוז וקרנות פיתוח VMC. MKC נתמך על ידי המחלקה לענייני חיילים משוחררים, מינהל בריאות ותיקים, משרד המחקר והפיתוח, מחקר ופיתוח מעבדה ביו רפואית באמצעות מענק 1 I01 BX000744-01. התכנים אינם מייצגים את עמדות המחלקה לענייני חיילים משוחררים או ממשלת ארצות הברית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
