Summary
悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。
Abstract
悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。移植アッセイでIIIおよびIV悪性神経膠腫を採点するWHOをモデル化するために、ヒト腫瘍細胞は免疫不全マウスの同位体部位、脳に異種移植される。培養した腫瘍細胞を利用する二次異種移植片とは対照的に、ヒトグリオーマ細胞は切除標本から解離され、組織培養で事前に通過せずに移植され、原発性異種移植片を生成する。この報告書の手順は、腫瘍サンプル調製、免疫不全マウスへの頭蓋内移植、腫瘍生着および腫瘍収穫のモニタリングを詳述し、その後のレシピエント動物への通過または分析を行う。腫瘍細胞の調製は2時間を必要とし、外科的処置は20分/動物を必要とする。
Introduction
悪性神経膠腫は、脳および時には脊髄で起こる中枢神経系の原発性グリア腫瘍である。神経膠腫は、組織学的に天文学的に類似しており、組織学的に占星細胞、オリゴデンドロサイトまたはエセンディマル細胞に従って分類され、悪性腫瘍の病的特徴について数値的に等級(I〜IV)に分類される。最も一般的な組織学的サブタイプは、アストロサイトーマ、オリゴデンドロリオ腫および混合オリゴアストロサイトーマである。WHOグレードII〜IVを包含する悪性神経膠腫は、侵襲的な成長および現在の治療法への再特性によって特徴付けられる。米国では毎年、約15,750人が悪性神経膠腫と診断され、推定12,740人の患者がこの病気に屈しています。これらの統計は、悪性神経膠腫の特に致死的な性質と強化された治療効果の重要な必要性を強調する。
がんモデルは、腫瘍生物学や治療法の調査に不可欠です。ヒト癌細胞株は、インビトロ操作および生体内異種移植研究(二次異種移植片)1に対する重要な第一歩を表す。しかしながら、標準的な癌細胞培養は、二次異種移植片5では回復し得ない形質および遺伝子型変換2~4を受ける。さらに、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)変異6などの遺伝子改変は、癌細胞培養において、明確な幹細胞集団7および主要なシグナル伝達経路8への依存性が失われ得る。ゲノムプロファイルは、癌球培養においてより良い程度まで維持することができるが、原発性腫瘍2,3の遺伝子型を完全にミラーリングすることができない。直接の異形性移植は、インビトロ培養の影響を否定し、適切な微小環境を提供し、腫瘍開始細胞9,10の完全性を維持する。したがって、原発異種移植片は、将来の臨床試験5,11,12の合理的な設計を支援するために、標的剤を厳格に試験するための強力で関連性の高い前臨床モデルを表す。
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Protocol
1. 腫瘍細胞懸濁液の調製
注: 原発性異種異種移植片を確立し維持するためには、患者材料および動物の使用に関する適切な制度的承認が必要である。ヴァンダービルト大学医療センターでは、診断目的で必要なものを超える切除腫瘍材料を、研究組織リポジトリの患者の同意を得て収集します。検体は無作為化された5桁のREDcapデータベース番号でラベル付けされ、すべての患者固有の識別子が除去される。REDcapデータベースには、性別、年齢(年)、人種、生存状態、病理、癌治療、切除年、および進行までの時間を含む組織リポジトリ内の各標本の同定解除された臨床データが含まれています。滅菌を維持し、原発異種移植法の成功を最適化するために、試薬、蒸気オートクレーブ手術器具、および外科部位は事前に組み立てるか、または準備する必要があります。
注: グリオーマ標本には、多くの場合、大量のミエリンおよび破片が含まれています。試料のサイズによっては、ミエリンやデブリを適切に除去するために4つ以上の不連続勾配チューブを使用する必要があります。
注: このプロセスは、明確に見える解剖されていない組織が残っていない場合、またはほとんど残っていない場合に完了する。トリアージプロセス中に気泡の導入を避けてください。
注: 解離後の細胞生存率は、典型的には>90%である。低い生存率は、手術室からの最適でない組織処理または輸送時間、凍結保存法、またはパパイン解離技術を含む多くの変数を反映し得る。しかし、十分な数の生存可能な生存率が適切な体積で移植される限り、より低い細胞の生存率は依然として十分である。各マウスに対して、50,000-200,000個の生存細胞が2μlの容積に埋め込まれます。シリンジ針のベベル先端により、最終的な体積に5μlの細胞懸濁液を追加して、各注射用の注射器に適切な材料を引き込むことができるようにする必要があります。例えば、5匹のマウスに2μl/マウスを注入するには、最終体積は15μl(15μl=(5 x 2 μl)+5μlでなければなりません。
- 実験室への輸送のために氷の上に滅菌されたキャップ付き容器に、切除され、識別され直された患者材料を置きます。移植のために直接検体を処理するか、液体窒素(下記参照)で標本を凍結保存し、液体窒素に保管し、後で使用します。
- キットコンポーネントとメーカーから提供される指示と滅菌フードにパパイン解離液(パパイン溶液、洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液および不連続勾配溶液)を準備します。ラベル無菌15 mlポリスチレン対等管と次のようにソリューションを配布します。
- チューブ1:パパイン溶液5ml
- チューブ2:3 mlの洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液
- チューブ 3-6: 5 ml 不連続勾配溶液
- 5 mlのパパイン溶液でグリオーマ標本をチューブ1に入れ、10〜20分の期間にわたって5mlピペットでトリチュレートします。
- 材料を10回上下にピペットし、次のトリアーレーションサイクルを開始する前に室温で2〜3分間インキュベートします。
- 5 ml ピペットの先端を円錐形チューブの底に近づけ、トリチャレーションの各サイクルで、先端が最後の 2 サイクルチューブの底面に触れるようにします。
- 室温で5分間300×gで遠心分離機。上清を取り除き、3mlの洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液中の10倍のペレットを上下にピペットします。
- 慎重に「重力」分配速度に設定されたピペットで、5 mlの不連続勾配溶液(チューブ3〜6)の各上に懸濁液の等量を重ね合わせた。
- スイングバケットローターを装備した遠心分離機にチューブを入れ、加速速度を最低の設定に下げ、ブレーキをオフにします。室温で12分間76×gで遠心分離機。ブレーキをオフにすると、一般的に20分後に遠心分離が完了します。
- 上清を取り除き、再懸濁し、各ペレットを5mlの無菌バランス塩溶液に組み合わせ、細胞を氷の上に置きます。
- 細胞懸濁液の部分(10〜100 μl)を取り除き、ヘモサイトメーターによるトリパンブルー排除により生存細胞の密度を決定します。
- 遠心分離機 300 x g で 5 分間上清を取り除き、μl当たり25,000-125,000個の生存細胞の密度で細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液の十分な容積を200 μlマイクロ遠心分離管(PCRチューブ)に移し、氷の上に置きます。
2. 手術部位と器具の準備
注: 滅菌外科用手袋は処置の間に着用される。各機関の要件に応じて、外科用ガウン、キャップ、フェイスガードが必要な場合があります。
- 動物の準備、操作フィールドおよび動物の回復のための分離された隣接領域とげっ歯類の外科のための、分解されたベンチトップを準備する。
- 蒸気オートクレーブで手術器具を殺菌する。続いて、ホットビーズ滅菌器を使用して、ある動物の対象から次の動物に移行する際に器具をフラッシュ滅菌します。
3. 誘導、麻酔、麻酔
注: マウスが麻酔された時点から15分を超える手術は、接触熱源を必要とする。低体温症を予防するために、マウスは術前および術後の期間中に熱源(循環湯毛布)を提供される。
- 各マウスが体重1グラム当たり10 μlのカクテルを注入してケタミン100mg/kgおよびキシラジン10mg/kgを受け取るような誘導麻酔用ケタミン/キシラジンカクテルを調製します。
-
表 1.麻酔カクテル。
在庫集中 準備するボリューム 1つのマウス 5匹のマウス 10匹のネズミ ケタミン 100 mg/ml 25 μl 125 μl 250 μl キシラジン 100 mg/ml 2.5 μl 12.5 μl 25 μl 等張生理生理 223 μl 1,113 μl 2,225 μl トータル 250 ul 1,250 μl 2,500 μl - ストック溶液(10 mg/ml)1:20を無菌で1:20に希釈して鎮痛用ケトプロフェン溶液を調製し、各マウスが体重1グラム当たり10μlの溶液を注入して5mg/kgの用量を受け取るようにします。
- 計量し、術前の体重を記録します。個々のマウスウェイトは異なりますが、一般的には18〜22gの範囲です。
- マウス体重1グラム当たりケタミン/キシラジンカクテルをインスリン注射器で腹腔内空間に10μl注入します。例えば、20gマウスに200μlを注入します。
- 後ろ足のつまみでマウスが完全に麻酔を受けるかどうかを確認します。マウスがピンチから撤退しなくなるのに、一般的に3〜5分かかります。
- マウス体重1グラム当たりのケトプロフェン溶液をインスリン注射器で脇腹の緩い皮膚に皮下に10μl注入する。例えば、20gマウスに200μlを注入します。
- 頭蓋骨の上に髪をバリカンで剃り、綿の先端アプリケーターを使って露出した頭皮をポビドネヨウ素でこすり、アルコールパッドを拭きます。これらのステップを繰り返し、ポビドネヨウ素スクラブとアルコール拭き、さらに2回。
- マウスの目に眼科軟膏を塗布する。
- 無菌メスの刃で目の前に耳の後ろから伸びる1cmの正中線切開を作ります。
- マウスを解剖スコープの下に置き、頭蓋骨を露出させて縫合線を特定します。ドリルで円形の動きを使用して、2.5mmの横方向のバリ穴をブレグマに、1 mm後部をコロナ縫合糸に中央に配置します。
4. 頭蓋内移植
注: 2.5 μlを超える注入量は、マウスに対して致死的である可能性があります。
- 上部の切り込み部を切り身バーの上に引っ掛け、鼻クランプを適用して、頭蓋骨が中立的な位置にしっかりと保持されるようにして、ステレオチックフレームにマウスを置きます。
- マイクロ遠心分離管内の細胞の5〜10 μlを数回上下に引き込み、立体式マニピュレータのプローブホルダーにクランプした10μlのハミルトンシリンジに取り込み、懸濁液を混合して気泡を除去します。プランジャーを押し下げるので、シリンジに2μl(1匹の動物を注入するのに十分な量)がロードされます。
- 皮膚切開部の横縁を引っ張ってバリ穴を露出させ、マイクロマニピュレーターで針をバリ穴に入れ、ベバ部分が頭蓋骨表面のすぐ下になるようにします。
- 針を3mm進めてから針を0.5mm引き出して、注射用のスペースを作ります。
- プランジャーを30秒以上ゆっくりと進め、針を脳内に残してさらに2分間進めます。0.5 mm上昇して徐々に針を引き出し、さらに30秒待ってから、脳から針を取り除きます。
- 定位フレームからマウスを取り外し、オートクリップで巻を閉じます。
- 体温を維持し、粘膜と露出した組織(足の裏)の呼吸パターンと色を継続的に監視するために、加温パッドの上にマウスを置きます。
- 麻酔(胸部および外来)から完全に回復したら、無菌ミクロアイソレーターケージにマウスを入れ、動物の住宅施設に戻します。
5. 移植後の動物のケアと観察
注: 腫瘍の生着および浸潤成長の最も信頼できる徴候は、ハンチ姿勢および粗い毛髪の上皮の発達を伴う漸進的で持続的な体重減少である。まれに、神経学的欠乏は運動失調、麻視、発作を含む指摘される。異形性原発異種移植片は非常に侵襲性が高く、長期間にわたって発達する。マウスは通常、移植後3〜6ヶ月の腫瘍増殖の症状を現す。
- 切開部位での食物および水の摂取、行動、グルーミング、および感染の兆候について、異交性異種移植片を持つマウスを毎日観察する。
- 痛みや苦痛が術後に観察された場合、ケトプロフェン(皮下5mg/kg、1日1〜2倍)を投与する。
- 手術後8~10日後にオートクリップを取り外します。
- マウスの体重は毎週です。
- 腫瘍の生着の徴候および症状を監視する。
6. 腫瘍ハーベスティング
注: この方法により、第1のコロナスライス(#1)は、嗅球の後部の側面と前葉の前部の側面を含む。生着した腫瘍は、その後の3つのコロナスライス(スライス#2、#3、#4)の右半球に最も豊富であり、注射部位はコロナスライス#3に日常的に含まれています。実験の必要性に応じて、材料は、腫瘍の通過、凍結組織切片、ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片、解離組織のフローサイトメトリー、DNA、RNA、またはタンパク質分析のための細胞培養またはリセートに使用され得る。腫瘍の一部は、80〜95%の範囲の細胞生存率を有する将来のニーズのために凍結保存され得る。
- 二酸化炭素への長期暴露によってマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。
- 脳の基部(頭蓋マグナムレベル)で大きな手術用ハサミで安楽死させたマウスを切断し、切開から皮膚を前方に引っ張って頭蓋骨を完全に露出させる。
- 脳を取り除く。
- 頭蓋骨の左側に沿って後頭部骨を切断するために、左外部聴覚肉のレベルに孔マグナムの側面に細かい外科用ハサミの1つの先端を挿入します。右側に同じカットを実行します。
- 一方の外部聴覚肉からもう一方の外熱部に沿って後頭部骨を切断し、小脳を露出させるために骨を取り除く。
- 目の間の鼻骨板を切ります。
- 鼻骨板から尾大に矢状縫合糸に沿って後に切断することによって、矢状縫合を切断します。ラムダからブレグマに前から切断することによって、矢状縫合に沿って正中切開を完了します。
- 慎重に頭蓋の開口部に沿って鉗子の細かいペアの先端を挿入して、頭蓋骨の硬膜接着を脳に引き裂き、2つの頭蓋骨を横に皮をむいて脳と嗅球を逆に露出させる。
- 嗅球の腹側の側面と頭蓋骨の間の鉗子を滑って、あらゆる癒着を解放する。
- 頭蓋骨を後ろに傾けて、視神経やその他の脳神経が露出するように脳を後退させます。脳神経を切断し、脳を無菌PBSを含む皿に放出する。
- 重さのあるヘラで脳をマトリックススライサーに移し、カミソリの刃で2mmコロナスライスを生成します。
- さらに目視検査と組織処理のために滅菌PBSを含む皿にコロナスライスを配置します。
7. 腫瘍凍結保存
- 凍結保存培地のストック溶液を準備する。
- 増殖サプリメント50ml、ペニシリン100x溶液5ml、レンサマイシン溶液5ml、0.2%ヘパリン450μlを450mlの基底培地に加えます。
- 光から保護された4°Cで在庫液を保管してください。
- 凍結保存媒体の作業溶液を準備します。
- 50mlポリプロピレンコニカルチューブに47.5mlの凍結保存培地と2.5mlの無菌DMSOを組み合わせてよく混ぜます。
- アリコート1.0 mlの作業溶液を各クライボシャルにし、光から保護された4°Cで保存します。
- ゼノグラフトされた脳の2mmコロナスライスを氷の上に凍結保存培地を含む凍結に入れる。
- バイアルをしっかりとキャップし、-80°Cの冷凍容器に入れます。 翌日、凍結液を液体窒素タンクに移し、より長く貯蔵します。
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Representative Results
解剖したグリオーマ細胞は、免疫不全マウスの脳に直接移植され、一次異形移植ラインを得る。各腫瘍標本には、保護された健康情報を除去する識別プロセスの一環として、移植前に無作為化数が割り当てられる。この目的のために、5桁のREDcapデータベース番号を使用します。 図1 は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1(IDH1)変異アルギニン132をヒスチジン(R132H)と共に神経膠芽腫(GBM 17182)から異種移植片線を確立するためのプロセスおよび命名法を示す。移植後、異種移植腫瘍を示す腫瘍同定番号に「X」が付加され、続いて「P」が通過数を追跡する。P0は、最初の移植レシピエントを指定し、P1は、第1異種移植片の通過のレシピエントマウスを指定する。典型的には、3〜5匹のマウスは最初に移植されてラインを確立し、異種移植された腫瘍は10匹のレシピエントマウス(P1)に継代され、今後の研究のためにラインを拡大する。
異形移植後、レシピエントマウスは腫瘍の生着および成長の徴候および症状をモニターする。腫瘍の生着の最も敏感な徴候は有意で持続的な体重減少である。マウスは若い年齢で移植されるため、術後の体重増加が予想されます。マウスの体重は週から週に一見劇的な方法で変動する可能性があるが、3gを超える持続的な損失は一般的に腫瘍の生着の良い徴候である。典型的には、異種移植コホート中のマウスのほとんどは、腫瘍に応じて60日から350日までの同様の期間にわたって体重減少を発症する。特定の腫瘍の生存時間の中央値は、毎回同じ数の腫瘍細胞が移植される場合、一般的に通過から通過まで類似している。 図2 に示すコホートは、以前に一度生着して継代したGBM(17182XP2)を移植した5匹のマウスのコホートである。5匹の17182XP2マウスのうち4匹は移植後17週で有意な体重減少を示した。残りのマウス(マウス3)は体重減少を示さなかったが、死後の検査では腫瘍は検出されなかったが、レシピエントの80%に限り腫瘍の生着を示す。
症候性マウスの脳が収穫されるとき、脳スライサーマトリックスは組織処理のための非常に貴重なツールである。各脳からの複数の解剖学的に定義されたセクションの生成は、いくつかの部分と組織の他の部分の凍結保存を用いて複数の分析モードを可能にする。例えば、IDH1の変異状態は、ある部分の物質または他の部分の免疫体化学によるサンガーシーケンシングによって評価され得る(図3)。腫瘍の生着は、コロナ切片の目視検査によって容易に明らかであり得るが、しかし、免疫組織化学を用いた組織学は、いくつかの異種移植片に必要とされるかもしれない(図4 および 5)。連続通路または他の研究のために異種移植片を解離する場合、ミエリンと破片を適切に除去できるように、材料の小さく、定義された部分から始めるのが重要である(図6)。パパイン解離システムの不連続勾配は、成人マウス脳の小さな部分を処理するのに最も適しています。正中線に沿って各コロナセクションをカットし、各半分に2つの不連続勾配を使用することをお勧めします。
図 1.一次異形移植ラインは、解き放たれたグリオーマ細胞を免疫不全マウスの脳に直接移植し、連続移植によって拡大することによって確立される。 IDH1遺伝子のアルギニン132におけるヘテロ接合体系突然変異は、びまん性星細胞腫、オリゴデンドロリオ腫、オリゴアストロサイトーマおよび二次神経膠芽腫の70%以上で起こり、原発性神経膠芽腫の7%未満である。GBM 17182は、ヒスチジン(R132H)に最も一般的なIDH1突然変異、アルギニン132を含む。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 2.GBM 17182XP1の連続移植レシピエントの成長曲線は、5 GBM 17182XP2マウスの4で手術後130〜150日目に有意な体重減少を示す。ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 3.ヘテロ接合、患者腫瘍(GBM 17182)および原発異種移植片(17182XP0)における体細胞IDH1 R132H突然変異は、サンガーシーケンシングまたは抗体染色によって検出することができる。 IDH1 R132H特異的抗体を用いた免疫体化学は、血管の周りまたは患者標本およびマウス脳のより拡散的に浸潤領域に密集して集まる変異神経膠腫細胞を示す。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 4.一次異形移植片は、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色単独で十分に理解することが困難な非常に浸透性の高い成長を示す。 ヒト特異的抗体を用いた免疫組織化学は、ヒト細胞を同定するのに特に有用な方法である。アナプラスチックオリゴアストロサイトーマ異種移植片の抗ヒトビメンチン染色(14175XP2)は、注入された右半球にびまん性腫瘍塊を有する浸潤性神経膠腫の典型的な特徴を明らかにする そして、脳梁(アスタリスク)と線条体繊維(黒矢印)およびレプトメニンゲラル分布(黒矢印)の髄鞘管に沿った侵襲的な成長。この倍率(1.25X)では、侵入した皮質におけるマウスニューロン(ニューロン周囲サテリトーシス)の周囲のヒト腫瘍細胞のクラスタリングは認められていない。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 5.A-Cの箱入領域における高出力(40X)のアナルプラスチックオリゴアストロサイト腫14175XP2コロナ切片の分析は、血管(領域A)、ストリアトカリダル管(「鉛筆繊維;」領域B)およびコーパスカルサム(領域C)の周りのIDH突然変異ヒト細胞を明らかにする。 GBM 17182XP2と同様に、IDH1 R132Hの未分化オリゴアストロサイト腫14175XP2の染色は、レシピエントマウスの連続継代に続く一次異同性異同移植片においてIDH突然変異が維持されることを示している。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 6.ヒト腫瘍細胞は、サイズに基づいて解離された異種移植片におけるマウス細胞と区別することができる。 解き分化された異種移植片のヒト腫瘍細胞を逐次的に定量するために、ヒト細胞は、その大きなサイズと濃緑色の発光(矢印頭)によって光顕微鏡下でヘモサイトメーターで同定される。フローサイトメトリーにより、ヒト細胞はマウス材料とは異なる散乱特性を有し、さらなる分析のためにゲートすることができます。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
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Discussion
培養細胞株、異種移植片および遺伝子組み換えマウスは、神経膠腫をモデル化するための最も一般的な方法であり、各モデルシステム3,13,14には明確な利点と限界がある。原発性異形性神経膠腫の関連する利点には、びまん性神経膠腫を代表する浸潤性増殖と、培養グリオーマ細胞で維持することが非常に困難な遺伝的変化および重要なシグナル伝達メカニズムの保持が含まれる。例えば、Iは、15,16個の第一交位異種異種移植片において、デヒドロゲナーゼ変異およびソニックヘッジホッグリガンド産生をソクチングするが、培養グリオーマ細胞14,17-19ではまれにしか維持されない。しかし、実験的ニーズに応じて、一次異交性異種移植片の重大な欠点を考慮することが重要です。十分な患者材料へのアクセスにもかかわらず、異所性部位よりも脳内の時間の経過とともにグリオーマの成長を測定することはより困難である。さらに、一次異交性異種移植片は異種異種移植片よりも著しく遅い割合で増殖する。したがって、研究者は、重要な組織学的および分子的特徴もまた保持することができる免疫不全マウスの側面に細胞を移植することを好むかもしれない4。
一次異形移植片を確立するための2つの重要な考慮事項は、免疫不全マウスレシピエントの種類と悪性神経膠腫のグレードです。我々は、アミチミック(nu-nu)マウスにおける原発異種移植片の確立に極度に限られた成功を収めており、NOD/SCIDおよびNSG(NOD/SCID/Interleukin-2受容体gアンマ鎖欠損)マウスでも同様に良好な成功を収めている。NSGマウスは、NOD/SCIDマウス20,21と比較して腫瘍原生細胞の生着速度が増加し、より長い寿命を有するため、レシピエントであることが好ましい。WHO腫瘍グレードに関しては、グレードIIIおよびIV腫瘍の神経膠腫の生着は観察したが、グレードIおよびIIは観察していない。
原発性異形性神経膠腫の場合、解離された腫瘍細胞は、免疫不全マウス9 または腫瘍開始細胞の脳内に直接移植され得る(例えばCD133発現細胞を選択することによって)移植22のために前向きに単離されてもよい。細胞のどちらの供給源も、CD133濃縮細胞の使用はより多くの出発物質を必要とするが、我々の経験15,16における成功した腫瘍の生着に適している。移植のために選別または未分類の細胞を準備するかどうかは、解離されたグリオーマ標本からミエリンおよび破片を適切に除去することが重要である。ミエリンや破片を十分に除去しないと、懸濁液をハミルトン注射器に引き込み、各レシピエントに均一な数の細胞を移植する能力が著しく妨げられる。パパイン解離後、ミエリンやデブリを十分に排除するために必要となる不連続勾配管の数を決定するために、ヘモサイトメーターを用いて小さなアリコートを評価することが有用である。完全な除去は実現可能ではありませんが、ミエリン除去前の解体標本中の細胞を定量化するのが難しいことと、不連続勾配による除去後の比較的容易さに対する理解を得ることができます。
解離された患者標本からの生存細胞の収率は非常に可変であり得る。最適には、わずか3,000個の細胞/動物で生着を得ているが、5匹のレシピエントマウスのそれぞれに105 個の細胞が移植される。我々が移植した原発性悪性神経膠腫標本(WHOグレードIIIおよびIV)のおよそ半分は、最初のレシピエントマウスの40〜100%に生着した。整形外科的移植後、レシピエントマウスは毎週体重を量り、腫瘍の生着および成長の徴候および症状を定期的に監視しなければならない。原発性異形移植片は、びまん性、浸潤性成長を示し、片麻麻炎または発作などの焦点神経学的症状はまれにしか観察されない。腫瘍の生着の最も敏感な徴候は、ハンチ姿勢、粗い毛髪コートまたはドーム型頭蓋骨の発達を伴うことがあり得る有意かつ持続的な体重減少である。マウスが持続的な体重減少を発症する速度は、患者の標本に応じて非常に変動し、60〜350日の範囲で及ぶ可能性があります。NSGマウスは通常、移植時に18〜25gの重量を量り、術後28〜33gの成人体重を達成する。寝具材料は、ケージの状態が動物の体重をかなり大きく変える可能性があるため、定期的に変更する必要があります。動物の体重は1週間から次の週に1グラムも変動する可能性があり、これが腫瘍の生着を表しているかどうかを判断することは困難です。成人体重を達成したNSGマウスにおける腫瘍生着の良好な指標は、3gを超える持続的な体重減少である。生着マウスは通常、数週間にわたって測定できる段階的な体重減少を発症するが、例えば水頭症の発症後、または感染などの無関係な原因から、腫瘍の成長のために動物の健康状態が急速に低下することもある。
安楽死後、腫瘍の生着は脳の総検査によって容易に明らかでない可能性があり、組織学的確認が不可欠である。初期の腫瘍レシピエントについては、各脳を同じ方法で処理し、1つの部分が組織学的に評価され、他の部分が生着が確認された場合にはその後の腫瘍通過のために凍結保存されるようにします。上で説明したように、脳はマトリックススライサーに配置され、各スライスが前から後軸に沿って脳の定義された領域を表す2mmコロナスライスを生成する。注射部位を日常的に含むコロナスライス#3はホルマリンに固定され、残りの各スライスは1mlの凍結保存培地を含む別のラベル付き凍結に入れられる。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)スライドは、ヘマトキシリンとエオシンで染色され、組織学を評価し、Ki67およびヒトビメンチンに対する抗体を用いて、生着細胞を可視化する。
一旦生着が確認されると、腫瘍は通過し、二次レシピエントの生着率は典型的には80〜100%で高くなる。我々は、将来の研究のために低通路(2-5)で所定の腫瘍ラインを維持するために十分な凍結保存物質を生成することができるように、より多くのレシピエントマウスで初めて腫瘍を通過することをお勧めします。特定の腫瘍の生存時間の中央値は、毎回同じ数の腫瘍細胞が移植される場合、一般的に通過から通過まで類似している。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
私たちは、分子脳神経外科組織銀行のための貴重な研究資料を提供したヴァンダービルト大学医療センターの患者に特にお世話になっています。ティッシュバンク、リード・C・トンプソンMD(主任研究者)、チェリー・キナードRN(リサーチナース)、ラリー・A・ピアースMS(マネージャー)を設立し、維持してくれた方に感謝します。組織学的サービスは、ヴァンダービルト大学医療センター(VUMC)トランスレーショナル病理学共有リソース(ヴァンダービルト・イングラムがんセンターに授与5P30 CA068485によってサポートされている)によって部分的に行われました。この作業は、NINDS(1R21NS070139)、バロウズ・ウェルカム・ファンド、VMC開発資金からのMKCへの助成金によって支えられました。MKCは、退役軍人省、退役軍人保健局、研究開発局、生物医学研究所研究開発局の助成金1 I01 BX000744-01によってサポートされています。内容は退役軍人省や米国政府の見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
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| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
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| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
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| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
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| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
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| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
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| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
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| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
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| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
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