Summary
Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder.
Abstract
Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder. Transplantasyon tahlillerinde WHO sınıf III ve IV malign gliomaları modellemek için, insan tümör hücreleri immün sistemi baskılanmış farelerin ortotopik bölgesine, yani beyne ksinografize edilir. Kültürlü tümör hücrelerini kullanan ikincil ksinograftların aksine, insan glioma hücreleri resected örneklerden ayrıştırılır ve birincil ksinograftlar oluşturmak için doku kültüründe önceden geçiş olmadan nakledilür. Bu rapordaki prosedür, tümör numunesi hazırlama, bağışıklık sistemi baskılanmış farelere intrakraniyal transplantasyon, tümör engraftmentinin izlenmesi ve alıcı hayvanlara veya analize sonraki geçiş için tümör hasadını detaylandırmamaktadır. Tümör hücre hazırlama 2 saat, cerrahi işlem ise 20 dk/hayvan gerektirir.
Introduction
Malign gliomalar, beyinde ve bazen omurilikte meydana gelen merkezi sinir sisteminin primer glial tümörleridir. Gliomalar Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından astrositlere, oligodendrositlere veya ependymal hücrelere histolojik benzerliğe göre sınıflandırılır ve daha sonra malignitenin patolojik özellikleri için sayısal olarak (I ila IV) derecelendirilir. En sık görülen histolojik alt tipler astrositomlar, oligodendrogliomalar ve karışık oligoastrositomlardır. WHO'nun II ila IV sınıflarını kapsayan malign gliomalar invaziv büyüme ve mevcut tedavilere yeniden hesaplama ile karakterizedir. Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık 15.750 kişiye malign glioma tanısı konulmaktadır ve tahmini 12.740 hasta bu hastalığa yenik düşmektedir. Bu istatistikler, malign gliomaların özellikle ölümcül doğasını ve gelişmiş terapötik etkinlik için önemli ihtiyacı vurgulamaktadır.
Kanser modelleri tümör biyolojisi ve tedavilerinin araştırılması için gereklidir. İnsan kanser hücre hatları in vitro manipülasyonlar ve in vivo ksinografting çalışmaları (ikincil ksinograftlar) için önemli bir ilk adımı temsil eder1. Bununla birlikte, standart kanser hücre kültürleri, ikincil ksinograftlarda geri yüklenemeyen fenotipik ve genotipik dönüşüm2-4'e tabidir5. Ayrıca kanser hücre kültürlerinde izoitrat dehidrogenaz(IDH)mutasyonları6, farklı kök hücre popülasyonları7 ve anahtar sinyal yollarına bağımlılık8 gibi genetik değişiklikler kaybedilebilir. Genomik profiller kanser küre kültüründe daha iyi ölçüde korunabilir, ancak yine de primer tümörlerin genotipini tam olarak yansıtamaz2,3. Doğrudan ortotopik transplantasyon in vitro kültürün etkilerini olumsuzlar, uygun bir mikroçevrme sağlar ve tümör başlatan hücrelerin bütünlüğünü korur9,10. Bu nedenle, birincil ksinograftlar, gelecekteki klinik çalışmaların rasyonel tasarımına yardımcı olmak için hedeflenen ajanları titizlikle test etmek için güçlü ve ilgili bir preklinik modeli temsil eder5,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tümör Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması
Not: Primer ortotopik glioma ksinograftlarının kurulması ve sürdürülmesi için hasta materyali ve hayvanların kullanımı için uygun kurumsal onaylar gereklidir. Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi'nde, tanı amaçlı gerekli olandan daha fazla resected tümör materyali, bir araştırma dokusu deposu için hasta onayı ile toplanır. Örnekler randomize 5 haneli REDcap veritabanı numarası ile etiketlenir ve hastaya özgü tüm tanımlayıcılar kaldırılır. REDcap veritabanı, doku deposundaki her örnek için cinsiyet, yaş (yıl), ırk, sağkalım durumu, patoloji, kanser tedavileri, rezeksiyon yılı ve ilerleme süresini içeren düzenli klinik veriler içerir. Steriliteyi korumak ve birincil ksinograft yönteminin başarısını optimize etmek için, tüm reaktifler, buharla otoklavlanmış cerrahi aletler ve cerrahi bölge önceden monte edilmeli veya hazırlanmalıdır.
Not: Glioma örnekleri genellikle büyük miktarlarda miyelin ve döküntü içerir. Numune boyutuna bağlı olarak, miyelin ve döküntülerin yeterli şekilde giderilmesi için 4'ten fazla süreksiz gradyan tüpü kullanmak gerekebilir.
Not: İşlem, kalan veya çok az, açıkça görülebilen bir doku kalmadığında tamamlanır. Tritürasyon işlemi sırasında kabarcıkların tanıtılmasından kaçının.
Not: Ayrışmayı takiben hücre canlılığı tipik olarak %90 >. Daha düşük yükümlülükler, suboptimal doku elleçleme veya ameliyathaneden taşıma süresi, kriyoprezervasyon yöntemi veya papain ayrışma tekniği dahil olmak üzere birçok değişkeni yansıtabilir. Bununla birlikte, uygun hacimde yeterli sayıda canlı nakledilebileceği sürece, daha düşük hücresel canlılıklar hala yeterli olabilir. Her fare için 50.000-200.000 canlı hücre 2 μl hacimde implante edilir. Şırınga iğnesinin eğimli ucu nedeniyle, her enjeksiyon için şırıngaya yeterli malzemenin çekilebilmesini sağlamak için son hacme 5 μl hücre süspansiyonu eklenmelidir. Örneğin, 5 fare için 2 μl / fare enjekte etmek için son hacim 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl olmalıdır.
- Laboratuvara taşınmak üzere buz üzerinde steril, kaplanmış bir kaba yeni resected, deidentified hasta materyali yerleştirin. Numuneyi doğrudan transplantasyon için işleyin veya sıvı nitrojende numuneyi sıvı nitrojende (aşağıya bakınız) sıvı nitrojende depolamak ve daha sonra kullanmak için kriyoprezite saklayın.
- Papain ayrıştırma çözeltilerini (papain çözeltisi, yıkama/proteaz inhibitör çözeltisi ve süreksiz gradyan çözeltisi) kit bileşenleri ve üretici tarafından sağlanan talimatlarla steril bir kaputta hazırlayın. Steril 15 ml polistiren konik tüpleri etiketleyin ve çözeltileri aşağıdaki gibi dağıtın:
- Tüp 1: 5 ml papain çözeltisi
- Tüp 2: 3 ml yıkama/proteaz inhibitörü çözeltisi
- Tüpler 3-6: Her biri süreksiz degrade çözeltisinin her biri 5 ml
- Glioma örneğini 5 ml papain çözeltisi ile tüp 1'e yerleştirin ve 10-20 dakikalık bir süre boyunca 5 ml pipetle tritüre edin.
- Malzemeyi 10 kez yukarı ve aşağı pipetlayın ve bir sonraki olgunlaşma döngüsünü başlatmadan önce malzemeyi oda sıcaklığında 2-3 dakika kuluçkaya yatırın.
- 5 ml pipet ucunu konik tüpün altına yakın bir şekilde, her tritürasyon döngüsüyle birlikte, ucun son 2 döngü boyunca tüpün dibine değecek şekilde konumlandırın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve peletin 3 ml yıkama/ proteaz inhibitörü çözeltisinde 10x yukarı ve aşağı pipet.
- "Yerçekimi" dağıtım hızında ayarlanmış bir pipettör ile 5 ml süreksiz gradyan çözeltilerinin (tüpler 3-6) her biri üzerine eşit miktarda süspansiyonu dikkatlice katmanlayın.
- Tüpleri, hızlanma hızı en düşük ayara düşürülecek ve fren kapalı olacak şekilde sallanan kova rotorlu bir santrifüje yerleştirin. Oda sıcaklığında 12 dakika boyunca 76 x g'da santrifüj. Fren kapalıyken, santrifüjleme genellikle 20 dakika sonra tamamlanır.
- Süpernatant çıkarın, yeniden biriktirin ve her peleti 5 ml steril dengeli tuz çözeltisinde birleştirin ve hücreleri buza yerleştirin.
- Hücre süspansiyonunun bir kısmını (10-100 μl) çıkarın ve hemositometre ile trippan mavi dışlama ile canlı hücrelerin yoğunluğunu belirleyin.
- 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatant çıkarın ve hücre peletini μl başına 25.000-125.000 canlı hücre yoğunluğunda yeniden biriktirin.
- Hücre süspansiyonunun yeterli hacmini 200 μl mikrosantrifüj tüpüne (PCR tüpü) aktarın ve buza yerleştirin.
2. Cerrahi Bölge ve Aletlerin Hazırlanması
Not: İşlem sırasında steril cerrahi eldivenler giyilir. Her kurumun gereksinimlerine bağlı olarak cerrahi önlük, kapak ve yüz koruyucu gerekebilir.
- Hayvan hazırlama, çalışma alanı ve hayvan kurtarma için ayrılmış bitişik alanlarla kemirgen cerrahisi için dezenfekte edilmiş bir tezgah hazırlayın.
- Cerrahi aletleri buharlı otoklavda sterilize edin. Daha sonra, bir hayvandan diğerine geçerken aletleri flaş sterilize etmek için sıcak bir boncuk sterilizatörü kullanın.
3. İndüksiyon, Anestezi ve Analjezi
Not: Farelerin uyuşturulmasından itibaren 15 dakikayı aşan ameliyatlar bir temas ısı kaynağı gerektirir. Hipotermiyi önlemek için, farelere ameliyat öncesi ve sonrası dönemlerde bir ısı kaynağı (dolaşımdaki sıcak su battaniyesi) sağlanır.
- Ketamin/ksilazine kokteylini indüksiyon anestezisi için hazırlayın, böylece her fare ketamin 100 mg / kg ve ksilazine 10 mg / kg, vücut ağırlığının gramı başına kokteylin 10 μl enjekte ederek.
-
Tablo 1. Anestezi kokteyli.
Stok konsantrasyonu Hazırlanacak birim bir fare beş fare on fare Ketamin 100 mg/ml 25 μl 125 μl 250 μl Xylazine 100 mg/ml 2,5 μl 12,5 μl 25 μl İsotonic salin 223 μl 1.113 μl 2.225 μl toplam 250 ul 1.250 μl 2.500 μl - Stok çözeltisini (10 mg/ ml) 1:20 steril, pilojen içermeyen suda seyrelterek analjezi için ketoprofen çözeltisi hazırlayın, böylece her fare, çözeltinin gram vücut ağırlığı başına 10 μl enjekte ederek 5 mg / kg'lık bir doz alır.
- Presurgical ağırlığı tartın ve kaydedin. Bireysel fare ağırlıkları değişir, ancak genellikle 18-22 g arasında değişir.
- Bir insülin şırınnası ile intraperitoneal alana fare vücut ağırlığının gramı başına 10 μl ketamin / ksilazin kokteyli enjekte edin. Örneğin, 20 g fare için 200 μl enjekte edin.
- Farenin arka bacağın ayak parmağı çimdikle tamamen uyuşturulup uyuşturulmadığını belirleyin. Farenin artık kıstırıktan çekilmemeleri genellikle 3-5 dakika sürer.
- Bir insülin şırınnası ile kanadın gevşek cildine gram fare vücut ağırlığı başına 10 μl ketoprofen çözeltisi enjekte edin. Örneğin, 20 g fare için 200 μl enjekte edin.
- Saç kesme makası ile kafatasının üzerinde saç tıraşı yapın, açıkta kalan kafa derisini pamuk ucu aplikatörü kullanarak povidone-iyotla ovalayın ve ardından bir alkol pedini silin. Bu adımları tekrarlayın, povidone-iyot ovma ve alkol silme, iki kez daha.
- Farenin gözlerine oftalmik merhem uygulayın.
- Steril bir neşter bıçağı ile kulakların arkasından gözlerin hemen önüne uzanan 1 cm'lik bir orta çizgi kesiği yapın.
- Fareyi bir diseksiyon dürbününün altına yerleştirin ve dikiş çizgilerini tanımlamak için kafatasını ortaya çıkarın. Matkapla dairesel hareketler kullanarak, bregma'ya 2,5 mm yanal ve koronal dikişe 1 mm posterior bir çapak deliği ortala.
4. intrakraniyal transplantasyon
Not: 2,5 μl'yi aşan enjeksiyon hacimleri fareler için ölümcül olabilir.
- Üst kesici dişleri kesici diş çubuğunun üzerine bağlayarak ve burun kelepçesini uygulayarak fareyi stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin, böylece kafatası nötr bir pozisyonda sıkıca tutulur.
- Süspansiyonu karıştırmak ve kabarcıkları ortadan kaldırmak için stereotaktik manipülatörün prob tutucusuna kenetlenmiş 10 μl Hamilton şırıngasına birkaç kez bir mikrosantrifüj tüpündeki hücrelerin 5-10 μl'lik kısmını yukarı ve aşağı çekin. Şırınnanın 2 μl (bir hayvana enjekte etmek için yeterli hacim) ile yüklenmesi için pistonu bastırın.
- Çapak deliğini açığa çıkarmak için cilt kesisinin yanal kenarını çekin ve mikromanipülatör ile iğneyi çapak deliğine sokun, böylece eğimli kısım kafatası yüzeyinin hemen altındadır.
- İğneyi 3 mm ilerletin ve enjeksiyon için bir alan oluşturmak için iğneyi 0,5 mm çekin.
- Pistonu yavaşça 30 sn'nin üzerinde ilerletin ve ardından iğnenin beyinde 2 dakika daha kalmasına izin verin. 0,5 mm yükselerek ve iğneyi beyinden çıkarmadan önce 30 saniye daha bekleyerek iğneyi yavaş yavaş çekin.
- Fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın ve yarayı bir otoklapla kapatın.
- Vücut sıcaklığını korumak ve mukoza zarlarının ve açıkta kalan dokuların (ayak tabanları) solunum düzenini ve rengini sürekli izlemek için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin.
- Fareyi anesteziden (sternal ve ambülatör) tamamen iyileştikten sonra steril bir mikroisolatör kafesine yerleştirin ve hayvan barınma tesisine geri verin.
5. İmplant sonrası Hayvan Bakımı ve Gözlemi
Not: Tümör engraftasyonunun ve infiltratif büyümenin en güvenilir göstergesi, kambur duruş ve pürüzlü saç önlüğü gelişimi eşliğinde kademeli, sürekli kilo kaybıdır. Nadir durumlarda, ataksi, parez ve nöbetleri içeren nörolojik eksiklikler not edilir. Ortotopik primer ksinograftlar oldukça invazivdir ve uzun bir süre boyunca gelişir. Fareler tipik olarak nakilden 3-6 ay sonra tümör büyümesi belirtileri gösterir.
- Kesi yerinde yiyecek ve su alımı, davranış, tımar ve enfeksiyon belirtileri için her gün ortotopik ksinograftları olan fareleri gözlemleyin.
- Ameliyat sonrası ağrı veya sıkıntı görülürse ketoprofen (deri altından 5 mg/ kg, günde 1-2x) verin.
- Ameliyattan 8-10 gün sonra otoklapları çıkarın.
- Fareleri haftalık olarak tartın.
- Tümör engraftment belirti ve semptomlarını izleyin.
6. Tümör Hasadı
Not: Bu yöntemle, ilk koronal dilim (#1) koku ampullerinin arka yönünü ve frontal lobların ön yönünü içerir. Engrafted tümör en çok sonraki 3 koronal dilimin sağ yarımküresinde (dilim #2, #3 ve #4) bol miktarda bulunur ve enjeksiyon görüşü rutin olarak koronal dilim #3 bulunur. Deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak, malzeme tümör geçişi, donmuş doku bölümleri, formalin sabit parafin gömülü doku bölümleri, ayrışmış dokunun akış sitometrisi, hücre kültürü veya DNA, RNA veya protein analizi için lizatlar için kullanılabilir. Tümörün bazı bölümleri% 80-95 arasında değişen hücre canlılığı ile gelecekteki ihtiyaçlar için kriyopreziserved edilebilir.
- Fareleri uzun süre karbondioksite maruz kalarak ötenazi ve ardından servikal çıkık.
- Beynin tabanındaki ötenazili farelerin kafasını daha büyük bir çift cerrahi makasla (foramen magnum seviyesi) çıkarın ve kafatasını tamamen ortaya çıkarmak için deriyi kesiden ileri çekin.
- Beyni çıkarın.
- Kafatasının sol tarafındaki oksipital kemiği kesmek için sol dış işitsel meatus seviyesine foramen magnum'un yanal yönüne bir çift ince cerrahi makas yerleştirin. Sağ tarafta aynı kesimi gerçekleştirin.
- Koronal düzlem boyunca oksipital kemiği bir dış işitsel meatustan diğerine kesin ve beyinciği ortaya çıkarmak için kemiği çıkarın.
- Burun kemik plakalarını gözlerin arasından kesin.
- Sagittal sütür boyunca burun kemik plakalarından bregmaya kadar arka arka kesim yaparak sagittal sütürünü kesin. Lambda'dan bregma'ya kadar ön kesim yaparak sagittal dikiş boyunca orta çizgi kesisini tamamlayın.
- Kafatasının beyne herhangi bir dural yapışıklıklarını yırtmak için her iki taraftaki sagittal açıklık boyunca ince bir çift tokanın ucunu dikkatlice yerleştirin ve ardından beyni ve koku ampullerini dorsally maruz bırakmak için iki kafatası yarısını yanal olarak soyun.
- Herhangi bir yapışıklık serbest için koku ampulleri ve kafatasının ventral yönü arasında tokaları kaydırın.
- Beynin geri çekilmesini sağlamak için kafatasını geriye doğru eğin, böylece optik ve diğer kraniyal sinirler açığa çıkar. Beyni steril PBS içeren bir tabağa salmak için kraniyal sinirleri koparın.
- Tartım spatulası olan beyni matris dilimleyiciye aktarın ve jiletlerle 2 mm koronal dilimler oluşturun.
- Koronal dilimleri daha fazla görsel inceleme ve daha fazla doku işleme için steril PBS içeren bir tabakta düzenleyin.
7. Tümör Kriyoprezervasyonu
- Kriyoprezervasyon ortamının bir stok çözeltisi hazırlayın.
- 50 ml çoğalma takviyesi, 5 ml 100x penisilin ve streptomisin çözeltisi ve 450 ml bazal ortama% 0.2 heparin 450 μl ekleyin.
- Stok çözeltisi 4 °C'de ışıktan korunur.
- Kriyoprezervasyon ortamının çalışma çözümünü hazırlayın.
- 47,5 ml kriyoprezervasyon ortamı ve 2,5 ml steril DMSO'yu 50 ml polipropilen konik tüpte birleştirin ve iyice karıştırın.
- Her bir cryovial için aliquot 1.0 ml çalışma çözeltisi ve ışıktan korunan 4 ° C'de saklayın.
- Xenografted beynin bir 2 mm'lik koronal dilimini buz üzerinde kriyoprezervasyon ortamı içeren bir cryovial içine yerleştirin.
- Şişeyi sıkıca kaplayın ve -80 °C'de bir dondurucu kaba yerleştirin. Ertesi gün cryovial'ı daha uzun depolama için sıvı bir azot tankına aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissosiyatif glioma hücreleri, primer ortotopik ksinograft çizgileri elde etmek için doğrudan bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin beyinlerine nakledilir. Her tümör örneğine, korunan sağlık bilgilerini kaldırmak için deidentifikasyon sürecinin bir parçası olarak transplantasyondan önce randomize bir sayı atanır. Bu amaçla 5 haneli bir REDcap veritabanı numarası kullanıyoruz. Şekil 1' de, izosirat dehidrogenaz 1 (IDH1) mutasyon arginin 132'den histidin'e (R132H) sahip bir glioblastomadan (GBM 17182) ksinograft hattı kurma işlemi ve isimlendirmesi gösterilmektedir. Transplantasyondan sonra ksinografted tümörü belirtmek için tümör tanımlama numarasına bir "X" eklenir ve ardından geçiş numarasını izlemek için bir "P" eklenir. P0 ilk transplantasyon alıcısını, P1 ise ilk ksinograft pasajının alıcı farelerini belirler. Tipik olarak, başlangıçta bir hat oluşturmak için 3-5 fare nakledilir ve ksinografted tümör daha sonra gelecekteki çalışmalar için hattı genişletmek için 10 alıcı fareye (P1) iletilir.
Ortotopik transplantasyondan sonra, alıcı fareler tümör engraftasyonu ve büyümesi belirti ve semptomları için izlenir. Tümör engrafasyonunun en hassas göstergesi önemli ve sürekli kilo kaybıdır. Fareler genç yaşta nakledildikçe ameliyat sonrası kilo alımı beklenir. Fare ağırlıkları haftadan haftaya görünüşte dramatik bir şekilde dalgalanabilir, ancak 3 g'dan fazla sürekli kayıp genellikle tümör engraftmentinin iyi bir göstergesidir. Tipik olarak, bir ksinograft kohortunda farelerin çoğu, tümöre bağlı olarak 60 gün ile 350 gün arasında değişen benzer bir süre boyunca kilo kaybı geliştirir. Belirli bir tümör için ortanca sağkalım süreleri genellikle her seferinde aynı sayıda tümör hücresi nakledildiğinde geçişten geçide benzer. Şekil 2'de, daha önce bir kez engrafted ve geçiş yapmış bir GBM (17182XP2) ile nakledilen 5 fareden oluşan bir kohort. Beş 17182XP2 fareden dördü transplantasyondan 17 hafta sonra önemli kilo kaybı gösterdi. Kalan fare (fare 3) kilo kaybı göstermedi ve ölüm sonrası muayenede tümör saptanmadı, bu da alıcıların sadece% 80'inde tümör engraftmentini gösterdi.
Semptomatik bir farenin beyni toplandığında, beyin dilimleyici matrisi doku işleme için son derece değerli bir araçtır. Her beyinden birden fazla, anatomik olarak tanımlanmış bölümlerin üretilmesi, bazı kısımlarla birden fazla analiz moduna ve dokunun diğer bölümlerinin kriyoprezervasyonuna izin verir. Örneğin, IDH1'in mutasyon durumu Sanger dizilimi ile bir kısımdan malzeme veya başka bir kısmı ile immünhistokimya ile değerlendirilebilir (Şekil 3). Tümör engraftment koronal bölümlerin görsel muayenesi ile kolayca görülebilir, ancak bazı ksinograftlar için immünhistokinemya histolojisi gerekebilir (Şekil 4 ve 5). Seri geçiş veya diğer çalışmalar için bir ksinograft ayrıştırırken, miyelin ve döküntülerin yeterince kaldırılabilmesi için malzemenin küçük ve tanımlanmış bir kısmı ile başlamak önemlidir (Şekil 6). Papain Ayrışma Sistemi'nin süreksiz gradyanı, yetişkin bir fare beyninin küçük bölümlerini işlemek için en uygun olanıdır. Her koronal kesitleri orta hat boyunca kesmenizi ve her yarım için iki süreksiz degrade kullanmanızı öneririz.
Şekil 1. Primer ortotopik ksinograft çizgileri, ayrışmış glioma hücrelerinin doğrudan bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin beyinlerine nakledilerek kurulur ve daha sonra seri transplantasyon ile genişletilir. IDH1 geninin arginin 132'sinde heterozipöz somatik mutasyonlar, yaygın astrositomalar, oligodendrogliomalar, oligoastrositomalar ve sekonder glioblastomların %70'inden fazlasında ve primer glioblastomların %7'sinden azında görülür. GBM 17182 en yaygın IDH1 mutasyonunu içerir, arginin 132'den histidin'e (R132H). Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 2. GBM 17182XP1 seri nakil alıcılarının büyüme eğrileri, 5 GBM 17182XP2 farenin 4'unda ameliyattan 130-150 gün sonra önemli kilo kaybı göstermektedir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 3. Sanger dizilimi veya antikor lekeleme ile hasta tümöründe (GBM 17182) ve primer ksinograftta (17182XP0) heterozegöz, somatik IDH1 R132H mutasyonu saptanabilir. IDH1 R132H spesifik antikorlu immünhistokimya, kan damarları etrafında veya hasta örneğinin ve fare beyninin daha yaygın olarak sızmış bölgelerinde yoğun olarak kümelenmiş mutant glioma hücrelerini göstermektedir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 4. Primer ortotopik ksinograftlar, hematoksilin ve eozin (H & E) boyama ile tam olarak takdir edilmesi zor olabilecek son derece infiltratif büyüme gösterir. İnsana özgü antikorlu immünhistokimya, engrafted insan hücrelerini tanımlamak için özellikle yararlı bir yöntemdir. Analplastik oligoastrositoma ksinograft (14175XP2) anti-insan vimentin lekeleme enjekte edilen dağınık tümör kütlesi ile infiltratif glioma tipik özelliklerini ortaya koymaktadır corpus callosum (yıldız) ve striatopallidal lifler (siyah ok uçları) ve leptomeningeal yayılma (siyah ok) miyelinli yolları boyunca sağ yarımküre ve invaziv büyüme. Bu büyütmede takdir edilen değil (1.25X), insan tümör hücrelerinin istila edilen kortekste fare nöronları (perineuronal satellitosis) etrafında kümelenmesidir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 5. A-C kutulu bölgelerde daha yüksek güçte (40X) analplastik oligoastrositoma 14175XP2 koronal kesitlerinin analizi, kan damarları (A bölgesi), striatopalaidal sistemlerde ("kalem lifleri;" B bölgesi) ve korpus callosum (C bölgesi) çevresindeki IDH mutant insan hücrelerini ortaya koymaktadır. GBM 17182XP2'de olduğu gibi, anaplastik oligoastrositoma 14175XP2'nin IDH1 R132H boyanması, alıcı farelerdeki seri pasajları takiben birincil ortotopik ksinograftta IDH mutasyonunun korunduğunu göstermektedir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 6. İnsan tümör hücreleri, boyuta göre ayrışmış ksinograftlardaki fare hücrelerinden ayırt edilebilir. Seri geçiş için ayrışmış bir ksinografttaki insan tümör hücrelerini ölçmek için, insan hücreleri ışık mikroskopisi altında bir hemositometrede büyük boyutları ve koyu yeşil lüminesansları (ok uçları) ile tanımlanır. Akış sitometrisi ile, insan hücreleri fare malzemesinden farklı dağılım özelliklerine sahiptir ve daha fazla analiz için kapılanabilir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kültürlü hücre hatları, ksinograftlar ve genetik olarak tasarlanmış fareler gliomaları modellemek için en yaygın yöntemlerdir ve her model sistemi için farklı faydalar ve sınırlamalar vardır3,13,14. Primer ortotopik glioma ksinograftlarının ilgili faydaları arasında yaygın gliomaları tipleyen infiltratif büyüme ve genetik değişikliklerin tutulması ve kültürlü glioma hücrelerinde bakımı son derece zor olabilecek önemli sinyal mekanizmaları sayılabilir. Örneğin, isocitrate dehidrogenaz mutasyonları ve Sonic kirpi ligand üretimi primer ortotopik ksinograftlarda15,16 ancak kültürlü glioma hücrelerinde nadirenkorunabilir 14,17-19. Bununla birlikte, deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak primer ortotopik ksinograftların önemli dezavantajlarını göz önünde bulundurmak önemlidir. Yeterli hasta materyaline erişime rağmen, glioma büyümesini beyinde zaman içinde ölçmek heterotopik bir bölgeye göre daha zordur. Ek olarak, primer ortotopik ksinograftlar heterotopik ksinograftlardan önemli ölçüde daha yavaş büyür. Bu nedenle araştırmacılar, önemli histolojik ve moleküler özelliklerin de korunabileceği bağışıklık sistemi baskılanmış bir farenin kanadına hücre nakli yapmayı tercih edebilir4.
Primer ortotopik ksinograftların kurulmasında iki önemli husus immün sistemi baskılanmış fare alıcısının tipi ve glioma malignite derecesidir. Athymic (nu-nu) farelerde birincil ksinograftlar kurmada ciddi şekilde sınırlı bir başarı ve NOD / SCID ve NSG(NOD /SCID / Interleukin-2 reseptörü gamma zinciri eksikliği) farelerle eşit derecede iyi bir başarı elde ettik. NSG fareleri, nod / SCID farelere kıyasla artan engraftment oranı ve daha uzun ömür nedeniyle tercih edilen alıcılardır20,21. WHO tümör derecesi ile ilgili olarak, grade III ve IV tümörlerinin glioma engraftmentini gözlemledik, ancak I ve II notlarını gözlemlemedik.
Primer ortotopik glioma ksinograftları için, ayrışmış tümör hücreleri doğrudan bağışıklık sistemi baskılanmış farelerin beyinlerine nakledilebilir9 veya tümör başlatan hücreler transplantasyon için prospektif olarak izole edilebilir (örneğin CD133 ifade eden hücreler seçilerek)22. Her iki hücre kaynağı da deneyimimizde başarılı tümör engraftment için uygundur15,16CD133 ile zenginleştirilmiş hücrelerin kullanımı daha fazla başlangıç malzemesi gerektirir. Sıralanmış veya sıralanmamış hücrelerin transplantasyon için hazırlanması olsun, miyelin ve döküntülerin ayrışmış glioma örneklerinden yeterince uzaklaştırılması önemlidir. Miyelin ve döküntülerin yeterince çıkarılmaması, süspansiyonu bir Hamilton şırıncına çekme ve her alıcıya tek tip sayıda hücre nakletme yeteneğini belirgin bir şekilde engeller. Papain ayrışmasını takiben, miyelin ve döküntüleri yeterince ortadan kaldırmak için gerekli olan süreksiz gradyan tüplerinin sayısını belirlemek için hemositometre kullanarak küçük bir aliquot değerlendirmek yararlıdır. Tamamen çıkarılması mümkün değildir, ancak miyelin çıkarılmasından önce ayrışmış bir numunedeki hücrelerin ölçülme zorluğu ve süreksiz gradyanlarla çıkarıldıktan sonraki göreceli kolaylık için takdir kazanılabilir.
Ayrışmış hasta örneklerinden canlı hücrelerin verimi oldukça değişken olabilir. En iyi şekilde, beş alıcı farenin her birine10 5 hücre nakledilir, ancak 3.000 hücre / hayvan ile engraftment elde ettik. Nakletdiğimiz primer malign glioma örneklerinin (WHO sınıfları III ve IV) yaklaşık yarısı ilk alıcı farelerin %40-100'lerinde engrafededir. Ortotopik transplantasyondan sonra, alıcı fareler haftalık olarak tartılmalı ve tümör engraftasyonu ve büyümesi belirti ve semptomları için düzenli olarak izlenmelidir. Primer ortotopik ksenograftlar yaygın, infiltratif büyüme gösterir ve hemiparezi veya nöbetler gibi fokal nörolojik semptomlar sadece nadir durumlarda görülür. Tümör engrafasyonunun en hassas göstergesi, kambur duruş, pürüzlü saç önlüğü veya kubbeli kafatası gelişimi ile birlikte oluşabilecek önemli ve sürekli kilo kaybıdır. Farelerin sürekli kilo kaybı geliştirme oranı hasta örneğine bağlı olarak oldukça değişkendir ve 60-350 gün arasında değişebilir. NSG fareleri transplantasyonda tipik olarak 18-25 g ağırlığındadır ve ameliyat sonrası 28-33 g yetişkin ağırlıklarına ulaşır. Kafes koşulları hayvan ağırlıklarını önemli ölçüde değiştirebileceği için yatak malzemesi düzenli olarak değiştirilmelidir. Bir hayvanın ağırlıkları bir haftadan diğerine bir gram kadar dalgalanabilir ve bunun tümör engraftmentini temsil edip etmediğini belirlemek zor olabilir. Yetişkin ağırlıklarına ulaşan NSG farelerinde tümör engraftasyonunun iyi bir göstergesi, 3 g'dan daha fazla sürekli kilo kaybıdır. Engrafted fareler tipik olarak birkaç haftalık bir süre boyunca ölçülebilen kademeli kilo kaybı geliştirse de, bazen bir hayvanın sağlığı tümör büyümesi nedeniyle, örneğin hidrosefali gelişimini takiben veya enfeksiyon gibi ilgisiz nedenlerden hızla düşebilir.
Ötenazi sonrasında beynin brüt muayenesi ile tümör engraftasyonu kolayca belirgin olmayabilir ve histolojik doğrulama esastır. İlk tümör alıcıları için, her beyni aynı şekilde işliyoruz, böylece bir bölüm histolojik olarak değerlendiriliyor ve engraftment doğrulanırsa diğer kısımlar sonraki tümör geçişi için kriyoprezerserved. Yukarıda tartışıldığı gibi, beyin, ön eksen boyunca beynin tanımlanmış bir bölgesini temsil eden her dilimle 2 mm koronal dilimler oluşturmak için bir matris dilimleyiciye yerleştirilir. Rutin olarak enjeksiyon bölgesini içeren koronal dilim #3 formalin ile sabitlenir ve kalan dilimlerin her biri 1 ml kriyoprezervasyon ortamı içeren ayrı, etiketli bir cryovial içine yerleştirilir. Formalin sabit parafin gömülü (FFPE) slaytlar histolojiyi değerlendirmek için hematoksilin ve eozin ile, engrafted hücreleri görselleştirmek için Ki67 ve insan vimentine karşı antikorlar ile lekelenir.
Gravür doğrulandıktan sonra tümör geçişli olabilir ve ikincil alıcılarda gravür oranları tipik olarak %80-100 oranında daha yüksektir. Daha fazla sayıda alıcı farede ilk kez bir tümörü geçirmenizi öneririz, böylece gelecekteki çalışmalar için belirli bir tümör hattını düşük geçişte (2-5) korumak için yeterli kriyoprezizasyonlu malzeme üretilebilir. Belirli bir tümör için ortanca sağkalım süreleri genellikle her seferinde aynı sayıda tümör hücresi nakledildiğinde geçişten geçide benzer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Özellikle Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Moleküler Nöroşirürjik Doku Bankası için paha biçilmez araştırma materyalleri sağlayan hastalara borçluyuz. Doku Bankası'nı kuranlara, Reid C. Thompson MD'ye (baş araştırmacı), Cherryl Kinnard RN'ye (araştırma hemşiresi) ve Larry A. Pierce MS'e (yönetici) teşekkür ederiz. Histolojik hizmetler kısmen Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi (VUMC) Çeviri Patolojisi Paylaşılan Kaynağı (Vanderbilt-Ingram Kanser Merkezi'ne 5P30 CA068485 ödülü ile desteklenmektedir) tarafından gerçekleştirilmesiyle gerçeklenmiştir. Bu çalışma NINDS (1R21NS070139), Burroughs Wellcome Fonu ve VMC geliştirme fonlarından MKC'ye verilen hibelerle desteklenmiştir. MKC, Gazi İşleri Dairesi, Gaziler Sağlık İdaresi, Araştırma ve Geliştirme Ofisi, Biyomedikal Laboratuvarı Araştırma ve Geliştirme Bölümü tarafından 1 I01 BX000744-01 hibesi ile desteklenmektedir. İçerikler, Gazi İşleri Bakanlığı'nın veya Amerika Birleşik Devletleri Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmez.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
