Summary
Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen.
Abstract
Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen. Um die WHO-Grade III und IV maligne Gliome in Transplantationstests zu modellieren, werden menschliche Tumorzellen in eine orthotopische Stelle, das Gehirn, von immungeschwächten Mäusen xenografiert. Im Gegensatz zu sekundären Xenografts, die kultivierte Tumorzellen nutzen, werden menschliche Gliomzellen von resezierten Proben getrennt und ohne vorherige Passage in der Gewebekultur transplantiert, um primäre Xenografts zu erzeugen. Das Verfahren in diesem Bericht beschreibt die Tumorprobenvorbereitung, die intrakranielle Transplantation in immungeschwächte Mäuse, die Überwachung der Tumorenpfroptmentierung und die Tumorernte für den späteren Übergang in Empfängertiere oder die Analyse. Tumorzellpräparat erfordert 2 Stunden und chirurgische Eingriffe erfordern 20 min/Tier.
Introduction
Bösartige Gliome sind primäre Gliatumoren des zentralen Nervensystems, die im Gehirn und gelegentlich im Rückenmark auftreten. Gliome werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) nach histologischer Ähnlichkeit mit Astrozyten, Oligodendrozyten oder ependymalen Zellen klassifiziert und dann numerisch (I bis IV) für pathologische Merkmale der Malignität eingestuft. Die häufigsten histologischen Subtypen sind Astrozytome, Oligodendrogliome und gemischte Oligoastrozytome. Bösartige Gliome, die die KLASSEN II bis IV der WHO umfassen, zeichnen sich durch invasives Wachstum und Widerspenstigkeit gegenüber aktuellen Therapien aus. Jedes Jahr wird in den Vereinigten Staaten etwa 15.750 Personen mit einem bösartigen Gliom diagnostiziert und schätzungsweise 12.740 Patienten erliegen dieser Krankheit. Diese Statistiken unterstreichen die besonders tödliche Natur bösartiger Gliome und den wichtigen Bedarf an verbesserter therapeutischer Wirksamkeit.
Krebsmodelle sind für die Untersuchung der Tumorbiologie und -therapien unerlässlich. Menschliche Krebszelllinien stellen einen wichtigen ersten Schritt für In-vitro-Manipulationen und in vivo Xenografting-Studien (sekundäre Xenografts)1dar. Jedoch, Standard-Krebszellkulturen unterziehen phänotypische und genotypische Transformation2-4, die nicht in sekundären Xenografts wiederhergestellt werden kann5. Darüber hinaus können genetische Veränderungen wie Isocitrate-Dehydrogenase (IDH)Mutationen6, unterschiedliche Stammzellpopulationen7 und Abhängigkeit von wichtigen Signalwegen8 in Krebszellkulturen verloren gehen. Genomprofile können in der Krebssphärenkultur in besserem Maße gepflegt werden, spiegeln aber den Genotyp der Primärtumoren immer noch nicht vollständig wider2,3. Direkte orthotopische Transplantation negiert die Einflüsse der In-vitro-Kultur, bietet eine angemessene Mikroumgebung und bewahrt die Integrität von tumorinitiierenden Zellen9,10. Daher stellen primäre Xenografts ein leistungsfähiges und relevantes präklinisches Modell für die gründliche Prüfung gezielter Wirkstoffe dar, um bei der rationalen Gestaltung zukünftiger klinischer Studien zu helfen5,11,12.
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Protocol
1. Vorbereitung der Tumorzellsuspension
Hinweis: Für die Herstellung und Aufrechterhaltung von primären orthotopischen Gliom-Xenografts sind geeignete institutionelle Genehmigungen für die Verwendung von Patientenmaterial und Tieren erforderlich. Am Vanderbilt University Medical Center wird resektiertes Tumormaterial, das über dem für diagnostische Zwecke erforderlichen Material hinausgeht, mit Zustimmung des Patienten für ein Forschungsgewebe-Repository gesammelt. Die Proben werden mit einer randomisierten 5-stelligen REDcap-Datenbanknummer beschriftet, und alle patientenspezifischen Bezeichner werden entfernt. Die REDcap-Datenbank enthält deidentifizierte klinische Daten für jede Probe im Gewebe-Repository, die Geschlecht, Alter (in Jahren), Rasse, Überlebensstatus, Pathologie, Krebsbehandlungen, Jahr der Resektion und Zeit bis zum Fortschreiten umfasst. Um die Sterilität zu erhalten und den Erfolg der primären Xenograft-Methode zu optimieren, sollten alle Reagenzien, dampfautoklavierten chirurgischen Instrumente und die chirurgische Stelle im Voraus montiert oder vorbereitet werden.
Hinweis: Gliom-Proben enthalten oft große Mengen myelin und Schmutz. Je nach Probengröße kann es notwendig sein, mehr als 4 diskontinuierliche Gradientenrohre für eine angemessene Entfernung von Myelin und Schmutz zu verwenden.
Hinweis: Der Prozess wird abgeschlossen, wenn kein oder wenig, deutlich sichtbares undissoziiertes Gewebe übrig ist. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen während des Triturierungsprozesses.
Hinweis: Die Zelllebensfähigkeit nach Dissoziation beträgt in der Regel >90 %. Geringere Viabilitäten können viele Variablen widerspiegeln, einschließlich suboptimaler Gewebehandhabung oder Transportzeit aus dem Operationssaal, Kryokonservierungsmethode oder Papain-Dissoziationstechnik. Niedrigere zelluläre Viabilitäten können jedoch noch ausreichen, solange eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Mittel in dem entsprechenden Volumen transplantiert werden kann. Für jede Maus werden 50.000-200.000 lebensfähige Zellen implantiert. Aufgrund der abgeschrägten Spitze der Spritzennadel sollte im Endvolumen eine zusätzliche Zellsuspension von 5 l enthalten sein, um sicherzustellen, dass für jede Injektion ausreichend Material in die Spritze eingezogen werden kann. Um z. B. für 5 Mäuse 2 l/Maus zu injizieren, sollte das Endvolumen 15 l (15 l = (5 x 2 l) + 5 l) betragen.
- Frisch resektiertes, identifiziertes Patientenmaterial in einen sterilen, verschlossenen Behälter auf Eis legen, um es zum Labor zu transportieren. Verarbeiten Sie die Probe direkt zur Transplantation oder kryokonservieren Sie die Probe in flüssigem Stickstoff (siehe unten) zur Lagerung in flüssigem Stickstoff und später zur Verwendung.
- Bereiten Sie die Papain-Dissoziationslösungen (Papainlösung, Wasch-/Protease-Inhibitor-Lösung und diskontinuierliche Gradientenlösung) in einer sterilen Haube mit den vom Hersteller gelieferten Kit-Komponenten und Anweisungen vor. Beschriften Sie sterile 15 ml Polystyrol-Konikonröhrchen und verteilen Sie die Lösungen wie folgt:
- Tube 1: 5 ml Papainlösung
- Tube 2: 3 ml Wasch-/Protease-Inhibitorlösung
- Tuben 3-6: je 5 ml diskontinuierliche Gradientenlösung
- Die Gliomprobe mit 5 ml Papainlösung in Tube 1 geben und mit einer 5 ml Pipette über einen Zeitraum von 10-20 min triturat.
- Das Material 10 Mal nach oben und unten pfeifen und dann das Material für 2-3 min bei Raumtemperatur inkubieren, bevor der nächste Zyklus der Trituration in Gang gesetzt wird.
- Positionieren Sie die Spitze der 5 ml Pipette näher an der Unterseite des konischen Rohres mit jedem Triturationszyklus, so dass die Spitze den Boden des Rohres für die letzten 2 Zyklen berührt.
- Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und Pipette das Pellet nach oben und unten 10x in 3 ml der Wasch-/Protease-Inhibitor-Lösung.
- Schichtung eines gleichen Volumens der Suspension über jede der 5 ml diskontinuierlichen Gradientenlösungen (Rohre 3-6), wobei eine Pipettentur auf die "Gravity"-Dosiergeschwindigkeit eingestellt ist.
- Legen Sie die Rohre in eine Zentrifuge, die mit einem Schwenkschaufelrotor ausgestattet ist, wobei die Beschleunigungsgeschwindigkeit auf die niedrigste Einstellung reduziert und die Bremse ausgeschaltet ist. Zentrifuge bei 76 x g für 12 min bei Raumtemperatur. Wenn die Bremse ausgeschaltet ist, wird die Zentrifugation in der Regel nach 20 min abgeschlossen.
- Den Überstand entfernen, wieder aufhängen und in 5 ml steriler, ausgewogener Salzlösung kombinieren und die Zellen auf Eis legen.
- Entfernen Sie einen Teil (10-100 l) der Zellsuspension und bestimmen Sie die Dichte lebensfähiger Zellen durch Trypan-Blauausschluss mit einem Hämozytometer.
- Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit einer Dichte von 25.000-125.000 lebensfähigen Zellen pro l wieder aus.
- Übertragen Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension auf ein 200-l-Mikrozentrifugenrohr (PCR-Rohr) und legen Sie es auf Eis.
2. Vorbereitung der chirurgischen Stelle und Instrumente
Hinweis: Während des Eingriffs werden sterile chirurgische Handschuhe getragen. Je nach Bedarf der einzelnen Institutionen können OP-Kleider, Mützen und Gesichtsschutz erforderlich sein.
- Bereiten Sie eine desinfizierte Tischplatte für die Nagetierchirurgie mit getrennten angrenzenden Bereichen für die Tieraufbereitung, Das Betriebsfeld und die Tierregeneration vor.
- Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente in einem Dampfautoklaven. Anschließend verwenden Sie einen heißen Perlensterilisator, um Instrumente zu blitzsterilisieren, wenn Sie von einem Tier zum anderen wechseln.
3. Induktion, Anästhesie und Analgesie
Hinweis: Operationen, die mehr als 15 min ab dem Zeitpunkt der Anästhesie der Mäuse sind, erfordern eine Kontaktwärmequelle. Um Unterkühlung zu vermeiden, werden die Mäuse während der prä- und postoperativen Perioden mit einer Wärmequelle (zirkulierende Warmwasserdecke) versorgt.
- Ketamin/Xylazin-Cocktail zur Induktionsanästhesie so zubereiten, dass jede Maus Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg erhält, indem sie 10 l des Cocktails pro Gramm Körpergewicht injiziert.
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Tabelle 1. Anästhesie-Cocktail.
Lagerkonzentration Volumen zur Vorbereitung eine Maus fünf Mäuse zehn Mäuse Ketamin 100 mg/ml 25 l 125 l 250 l Xylazin 100 mg/ml 2,5 l 12,5 l 25 l Isotonische Saline 223 l 1.113 l 2.225 l gesamt 250 ul 1.250 l 2.500 l - Bereiten Sie Ketoprofen-Lösung für Analgesie vor, indem Sie die Stammlösung (10 mg/ml) 1:20 in sterilem, pyogenfreiem Wasser verdünnen, so dass jede Maus eine Dosis von 5 mg/kg erhält, indem sie 10 l der Lösung pro Gramm Körpergewicht injiziert.
- Wiegen und aufzeichnen Sie das prächirurgische Gewicht. Die einzelnen Mausgewichte variieren, reichen aber in der Regel von 18-22 g.
- Mit einer Insulinspritze in den intraperitonealen Raum injizieren Sie 10 l des Ketamin/Xylazin-Cocktails pro Gramm Mauskörpergewicht. Injizieren Sie z. B. 200 l für eine 20 g Maus.
- Bestimmen Sie, ob die Maus vollständig durch Zehenkneifen des Hinterbeins beeinflicht ist. Es dauert in der Regel 3-5 min für die Maus nicht mehr von der Prise zurückziehen.
- Mit einer Insulinspritze in die lockere Haut der Flanke injizieren Sie 10 l der Ketoprofenlösung pro Gramm Mauskörpergewicht subkutan. Injizieren Sie z. B. 200 l für eine 20 g Maus.
- Rasieren Sie Haare mit Clippers über den Schädel, schrubben Sie die freiliegende Kopfhaut mit Povidon-Jod mit einem Baumwoll-Spitzenapplikator und wischen Sie dann ein Alkoholpad ab. Wiederholen Sie diese Schritte, Povidon-Jod-Peeling und Alkohol wischen, zwei weitere Male.
- Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus auf.
- Machen Sie einen 1 cm Mittellinienschnitt, der sich von hinter den Ohren bis direkt vor den Augen mit einer sterilen Skalpellklinge erstreckt.
- Platzieren Sie die Maus unter einem sezierenden Bereich und setzen Sie den Schädel aus, um die Nahtlinien zu identifizieren. Mit kreisförmigen Bewegungen mit einem Bohrer, zentrieren Sie ein Gratloch 2,5 mm seitlich zum Bregma und 1 mm hinter der koronalen Naht.
4. Intrakranielle Transplantation
Hinweis: Injektionsvolumina von mehr als 2,5 l können für Mäuse tödlich sein.
- Positionieren Sie die Maus auf einem stereotaktischen Rahmen, indem Sie die oberen Schneidezähne über die Schneidezähne hängen und die Nasenklemme so auftragen, dass der Schädel fest in einer neutralen Position gehalten wird.
- Ziehen Sie 5-10 l der Zellen in einem Mikrozentrifugenrohr mehrmals nach oben und unten in eine 10-l-Hamilton-Spritze, die im Sondenhalter des stereotaktischen Manipulators eingeklemmt ist, um die Suspension zu mischen und Blasen zu beseitigen. Drücken Sie den Kolben, so dass die Spritze mit 2 l (das ausreichende Volumen, um ein Tier zu injizieren) geladen wird.
- Ziehen Sie den seitlichen Rand des Hautschnitts, um das Gratloch freizulegen, und führen Sie mit dem Mikromanipulator die Nadel in das Gratloch ein, so dass sich der abgeschrägte Teil direkt unter der Schädeloberfläche befindet.
- Bewegen Sie die Nadel 3 mm und ziehen Sie dann die Nadel 0,5 mm, um einen Platz für die Injektion zu schaffen.
- Bewegen Sie den Kolben langsam über 30 Sek. und lassen Sie dann die Nadel im Gehirn für weitere 2 min bleiben. Ziehen Sie die Nadel nach und nach ab, indem Sie 0,5 mm aufsteigen und auf weitere 30 Sek. warten, bevor Sie die Nadel aus dem Gehirn entfernen.
- Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und schließen Sie die Wunde mit einem Autoclip.
- Legen Sie die Maus auf ein wärmendes Pad, um die Körpertemperatur zu halten und kontinuierlich das Atmungsmuster und die Farbe von Schleimhäuten und freiliegenden Geweben (Fußsohlen) zu überwachen.
- Legen Sie die Maus in einen sterilen Mikroisolatorkäfig, sobald sie sich vollständig von der Anästhesie (sternal und ambulant) erholt, und bringen Sie sie in die Tierhaltungseinrichtung zurück.
5. Tierpflege und -beobachtung nach der Implantation
Hinweis: Die zuverlässigste Indikation für Tumorengraftment und infiltratives Wachstum ist allmählich, anhaltende Gewichtsverlust begleitet von der Entwicklung der geknickten Haltung und rauen Haarmantel. In seltenen Fällen, neurologische Defizite festgestellt werden, die Ataxie, Parese, und Krampfanfälle gehören. Orthotopische primäre Xenografts sind hochinvasiv und entwickeln sich über einen langen Zeitraum. Mäuse manifestieren in der Regel Symptome des Tumorwachstums 3-6 Monate nach der Transplantation.
- Beobachten Sie Mäuse mit orthotopischen Xenografts täglich für Nahrung und Wasseraufnahme, Verhalten, Pflege und Anzeichen einer Infektion an der Einschnittstelle.
- Ketoprofen (5 mg/kg subkutan, 1-2x pro Tag) verabreichen, wenn Schmerzen oder Leiden postoperativ beobachtet werden.
- Entfernen Sie Autoclips 8-10 Tage nach der Operation.
- Wiegen Sie Mäuse wöchentlich.
- Überwachen Sie Anzeichen und Symptome einer Tumorenpfropte.
6. Tumorernte
Hinweis: Bei dieser Methode enthält die erste koronale Scheibe (#1) den hinteren Aspekt der Olfaktorzwiebeln und den vorderen Aspekt der Frontallappen. Der transplantierte Tumor ist am häufigsten in der rechten Hemisphäre der folgenden 3 koronalen Scheiben (Scheibe #2, #3 und #4) und der Injektionsblick ist routinemäßig in koronalen Scheiben #3 enthalten. Je nach experimentellem Bedarf kann das Material für Tumorpassagen, gefrorene Gewebeabschnitte, formalin fixierte Paraffin-eingebettete Gewebeabschnitte, Durchflusszytometrie von dissoziiertem Gewebe, Zellkultur oder Lysate für dna-, RNA- oder Proteinanalysen verwendet werden. Teile des Tumors können für zukünftige Bedürfnisse mit Zelllebensfähigkeit von 80-95% kryokonserviert werden.
- Euthanisieren Sie Mäuse durch längere Exposition gegenüber Kohlendioxid, gefolgt von zervikalen Dislokationen.
- Enthaupten Sie eingeschläferte Mäuse an der Basis des Gehirns (foramen magnum-Ebene) mit einer größeren chirurgischen Schere, und ziehen Sie die Haut aus dem Schnitt nach vorne, um den Schädel vollständig freizulegen.
- Entfernen Sie das Gehirn.
- Legen Sie eine Spitze der feinen chirurgischen Schere in den seitlichen Aspekt des Foramen magnum, um Ebene der linken externen Auditfleisch, um den okzipitalen Knochen entlang der linken Seite des Schädels zu schneiden. Führen Sie den gleichen Schnitt auf der rechten Seite durch.
- Schneiden Sie den okzipitalen Knochen entlang einer koronalen Ebene von einem externen auditiven Fleisch auf den anderen und entfernen Sie den Knochen, um das Kleinhirn freizulegen.
- Schneiden Sie die Nasenknochenplatten zwischen den Augen.
- Schneiden Sie die sagittale Naht, indem Sie hinter der sagittalen Naht von den Nasenknochenplatten bis zum Bregma schneiden. Vervollständigen Sie den Mittellinienschnitt entlang der sagittalen Naht, indem Sie vordergründ vom Lambda zum Bregma schneiden.
- Legen Sie vorsichtig die Spitze eines feinen Zangenpaares entlang der sagittalen Öffnung auf jeder Seite ein, um jede durale Haftung des Schädels an das Gehirn zu reißen und dann die beiden Schädelhälften seitlich zu schälen, um das Gehirn und die olfaktorischen Glühbirnen dorsal freizulegen.
- Schieben Sie die Zange zwischen dem ventralen Aspekt der olfaktorischen Glühbirnen und dem Schädel, um jegliche Adhäsionen zu befreien.
- Neigen Sie den Schädel zurück, damit das Gehirn zurückgezogen werden kann, so dass die Optik und andere Hirnnerven freigelegt werden. Trennen Sie die Hirnnerven, um das Gehirn in eine Schüssel mit sterilem PBS zu entlassen.
- Übertragen Sie das Gehirn mit einem Wägespachtel auf einen Matrixschneider und erzeugen Sie 2 mm koronale Scheiben mit Rasierklingen.
- Die koronalen Scheiben in einer Schale mit sterilem PBS für die weitere Sichtprüfung und weitere Gewebeverarbeitung anrichten.
7. Tumor-Kryokonservierung
- Bereiten Sie eine Lagerlösung von Kryokonservierungsmedium vor.
- Fügen Sie 50 ml Proliferationsergänzung, 5 ml 100x Penicillin und Streptomycin-Lösung und 450 l 0,2% Heparin zu 450 ml Basalmedium hinzu.
- Lagerhaltung stämmieren Sie die Lagerlösung bei 4 °C, die vor Licht geschützt ist.
- Bereiten Sie eine funktionierende Lösung des Kryokonservierungsmediums vor.
- Kombinieren Sie 47,5 ml Kryokonservierungsmedium und 2,5 ml steriles DMSO in einem 50 ml Polypropylen-Konustube und mischen Sie gut.
- Aliquot 1,0 ml Arbeitslösung für jeden Kryovial und lagern bei 4 °C vor Licht geschützt.
- Legen Sie eine 2 mm koronale Scheibe des xenotransplantierten Gehirns in ein Kryovial, das Kryokonservierungsmedium enthält, auf Eis.
- Die Durchstechflasche fest verschließen und bei -80 °C in einen Gefrierbehälter geben. Übertragen Sie den Kryovial am nächsten Tag in einen flüssigen Stickstofftank für eine längere Lagerung.
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Representative Results
Dissoziierte Gliomzellen werden direkt in das Gehirn immungeschwächter Mäuse transplantiert, um primäre orthotopische Xenograft-Linien zu erhalten. Jeder Tumorprobe wird vor der Transplantation eine randomisierte Zahl zugewiesen, als Teil des Deidentifizierungsprozesses, um geschützte Gesundheitsinformationen zu entfernen. Dazu verwenden wir eine 5-stellige REDcap-Datenbanknummer. Abbildung 1 zeigt den Prozess und die Nomenklatur zur Herstellung einer Xenograft-Linie aus einem Glioblastom (GBM 17182) mit Isocitrat-Dehydrogenase 1 (IDH1)-Mutation Arginin 132 bis Histidin (R132H). Nach der Transplantation wird der Tumor-Identifikationsnummer ein "X" hinzugefügt, um einen xenotransplantierten Tumor zu bezeichnen, gefolgt von einem "P", um die Durchgangsnummer zu verfolgen. P0 bezeichnet den ursprünglichen Transplantationsempfänger und P1 Empfängermäuse der ersten Xenograft-Passage. In der Regel werden 3-5 Mäuse zunächst transplantiert, um eine Linie zu bilden, und xenografted Tumor wird dann in 10 Empfängermäuse (P1) übergeben, um die Linie für zukünftige Studien zu erweitern.
Nach der orthotopischen Transplantation werden Empfängermäuse auf Anzeichen und Symptome einer Tumortransplantation und des Wachstums überwacht. Die empfindlichste Indikation der Tumorenpfroptment ist signifikant und anhaltende Gewichtsverlust. Da Mäuse in jungen Jahren transplantiert werden, wird eine postoperative Gewichtszunahme erwartet. Mausgewichte können in scheinbar dramatischer Weise von Woche zu Woche schwanken, aber anhaltender Verlust von mehr als 3 g ist in der Regel ein guter Hinweis auf Tumortransplantation. Typischerweise entwickeln die meisten Mäuse in einer Xenograft-Kohorte Gewichtsverlust über einen ähnlichen Zeitraum von so kurz wie 60 Tagen bis zu 350 Tagen je nach Tumor. Die medialen Überlebenszeiten für einen bestimmten Tumor sind im Allgemeinen von Durchgang zu Durchgang ähnlich, wenn jedes Mal die gleiche Anzahl von Tumorzellen transplantiert wird. In Abbildung 2 ist eine Kohorte von 5 Mäusen, die mit einem GBM (17182XP2) transplantiert wurden, die zuvor einmal transplantiert und durchzogen wurden. Vier der fünf 17182XP2-Mäuse zeigten 17 Wochen nach der Transplantation einen signifikanten Gewichtsverlust. Die verbleibende Maus (Maus 3) zeigte keinen Gewichtsverlust und bei der Obduktion wurde kein Tumor festgestellt, was auf eine Tumortransplantation bei nur 80 % der Empfänger hindeutet.
Wenn das Gehirn einer symptomatischen Maus geerntet wird, ist eine Gehirnschneidermatrix ein äußerst wertvolles Werkzeug für die Gewebeverarbeitung. Die Generierung von mehreren, anatomisch definierten Abschnitten aus jedem Gehirn ermöglicht mehrere Analysemodi mit einigen Portionen und Kryokonservierung anderer Teile des Gewebes. Beispielsweise kann der Mutationsstatus von IDH1 durch Sanger-Sequenzierung mit Material aus einem Teil oder Immunhistochemie mit einem anderen (Abbildung 3) beurteilt werden. Tumorengraftment kann durch visuelle Inspektion der koronalen Abschnitte leicht erkennbar sein, jedoch kann histologie mit Immunhistochemie für einige Xenografts erforderlich sein (Abbildungen 4 und 5). Bei der Dissoziierung eines Xenografts für serielle Passagen oder andere Studien ist es wichtig, mit einem kleinen und definierten Materialanteil zu beginnen, damit Myelin und Schmutz angemessen entfernt werden können (Abbildung 6). Der diskontinuierliche Gradient des Papain Dissoziationssystems eignet sich am besten für die Verarbeitung kleiner Teile eines erwachsenen Maushirns. Wir empfehlen, jeden koronalen Abschnitt entlang der Mittellinie zu schneiden und zwei diskontinuierliche Gradienten für jede Hälfte zu verwenden.
Abbildung 1. Primäre orthotopische Xenograft-Linien werden durch Transplantation dissoziierter Gliomzellen direkt in das Gehirn immungeschwächter Mäuse etabliert und dann durch serielle Transplantation erweitert. Heterozygote somatische Mutationen bei Arginin 132 des IDH1-Gens treten bei mehr als 70 % der diffusen Astrozytome, Oligodendrogliome, Oligoastrozytome und sekundären Glioblastome und weniger als 7 % der primären Glioblastome auf. GBM 17182 enthält die häufigste IDH1-Mutation, Arginin 132 zu Histidin (R132H). Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. Wachstumskurven von Serientransplantationsempfängern von GBM 17182XP1 zeigen einen signifikanten Gewichtsverlust 130-150 Tage nach der Operation bei 4 von 5 GBM 17182XP2 Mäusen. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Heterozygote, somatische IDH1 R132H-Mutation im Patiententumor (GBM 17182) und primärem Xenograft (17182XP0) kann durch Sanger-Sequenzierung oder Antikörperfärbung nachgewiesen werden. Die Immunhistochemie mit einem IDH1 R132H-spezifischen Antikörper zeigt mutierte Gliomzellen, die dicht um Blutgefäße oder in diffus infiltrierten Regionen der Patientenprobe und des Maushirns gruppiert sind. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Primäre orthotopische Xenografts weisen ein hochinfiltratives Wachstum auf, das allein durch Hämatoxylin und Eosin (H & E) nur schwer zu erkennen ist. Die Immunhistochemie mit einem humanspezifischen Antikörper ist eine besonders nützliche Methode zur Identifizierung transplantierter menschlicher Zellen. Die antihumane Vimentinfärbung eines analplastischen Oligoastrozytom-Xenograft (14175XP2) zeigt typische Merkmale eines infiltrativen Glioms mit einer diffusen Tumormasse in der injizierten rechten Hemisphäre und invasivem Wachstum entlang myelinierter Traktate (Sternchen) und der striatopallidalen Fasern (schwarze Pfeilspitzen) und leptomeningealer Verbreitung (schwarzer Pfeil). Bei dieser Vergrößerung (1,25X) wird nicht geschätzt, dass sich menschliche Tumorzellen um Mausneuronen (perineuronale Satellitose) im eingedrungenen Kortex gruppieren. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Die Analyse von analplastischem Oligoastrozytom 14175XP2 koronalen Abschnitten mit höherer Leistung (40X) in boxförmigen Regionen A-C zeigt IDH-mutierte menschliche Zellen um Blutgefäße (Region A), in striatopallidalen Trakten ("Bleistiftfasern;" Region B) und dem Corpus callosum (Region C). Wie bei GBM 17182XP2 zeigt die IDH1 R132H-Färbung von anaplastischem Oligoastrozytom 14175XP2, dass die IDH-Mutation in einem primären orthotopischen Xenograft nach seriellen Passagen in Empfängermäusen beibehalten wird. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. Menschliche Tumorzellen können je nach Größe von Mauszellen in dissoziierten Xenografts unterschieden werden. Um menschliche Tumorzellen in einem dissoziierten Xenograft für die serielle Passage zu quantifizieren, werden menschliche Zellen in einem Hämozytometer unter Lichtmikroskopie durch ihre große Größe und dunkelgrüne Lumineszenz (Pfeilspitzen) identifiziert. Durch die Durchflusszytometrie weisen menschliche Zellen unterschiedliche Streueigenschaften aus dem Mausmaterial auf und können zur weiteren Analyse abgegrenzt werden. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
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Discussion
Kultivierte Zelllinien, Xenografts und gentechnisch veränderte Mäuse sind die gebräuchlichsten Methoden zur Modellierung von Gliomen, und es gibt deutliche Vorteile und Einschränkungen für jedes Modellsystem3,13,14. Relevante Vorteile von primären orthotopischen Gliom-Xeografts sind infiltratives Wachstum, das diffuse Gliome typisiert, und die Retention genetischer Veränderungen und wichtige Signalmechanismen, die in kultivierten Gliomzellen äußerst schwierig zu erhalten sein können. Zum Beispiel können isocitrate Dehydrogenase Mutationen und Sonic Igel Ligandenproduktion in primären orthotopischen Xenografts15,16, aber nur selten in kultivierten Gliomzellen14,17-19aufrechterhalten werden. Es ist jedoch wichtig, signifikante Nachteile von primären orthotopischen Xenografts zu berücksichtigen, je nach experimentellen Bedürfnissen. Ungeachtet des Zugangs zu angemessenem Patientenmaterial ist es schwieriger, das Gliomwachstum im Laufe der Zeit im Gehirn zu messen als an einer heterotopischen Stelle. Darüber hinaus wachsen primäre orthotopische Xenografts deutlich langsamer als heterotopische Xenografts. So können Die Forscher es vorziehen, Zellen in die Flanke einer immungeschwächten Maus zu transplantieren, wo wichtige histologische und molekulare Merkmale auch beibehalten werden können4.
Zwei wichtige Überlegungen zur Etablierung primärer orthotopischer Xenografts sind die Art des immungeschwächten Mausempfängers und der Grad der Gliommalignität. Wir hatten sehr begrenzten Erfolg bei der Etablierung von primären Xenografts bei athymischen (Nu-Nu)-Mäusen und ebenso guten Erfolg mit NOD/SCID und NSG (NOD/SCID/Interleukin-2-Rezeptor gAmma-Kette mangelhaft) Mäuse. NSG-Mäuse sind aufgrund einer erhöhten Engraftmentrate von tumorgenen Zellen und einer längeren Lebensdauer im Vergleich zu NOD/SCID-Mäusen20,21bevorzugte Empfänger. In Bezug auf den WHO-Tumorgrad haben wir eine Gliom-Engraftmentierung von Tumoren der Stufen III und IV beobachtet, nicht jedoch die Grade I und II.
Bei primären orthotopischen Gliom-Xenografts können dissoziierte Tumorzellen direkt in das Gehirn immungeschwächterMäuse 9 transplantiert werden oder tumorinitoriierende Zellen können prospektiv isoliert werden (z. B. durch Auswahl von CD133-exezierenden Zellen) für Transplantation22. Beide Zellquellen eignen sich nach unserer Erfahrung für eine erfolgreiche Tumorentransplantation15,16, obwohl die Verwendung von CD133-angereicherten Zellen mehr Ausgangsmaterial erfordert. Ob die Vorbereitung von sortierten oder unsortierten Zellen für die Transplantation, es ist wichtig, Myelin und Schmutz von dissoziierten Gliomproben angemessen zu entfernen. Wenn Myelin und Schmutz nicht ausreichend entfernt werden, wird die Fähigkeit, die Suspension in eine Hamilton-Spritze zu ziehen und jedem Empfänger eine einheitliche Anzahl von Zellen zu transplantieren, erheblich behindert. Nach der Papain-Dissoziation ist es hilfreich, ein kleines Aliquot mit einem Hämozytometer zu bewerten, um die Anzahl der diskontinuierlichen Gradientenröhren zu bestimmen, die erforderlich sind, um Myelin und Schmutz ausreichend zu beseitigen. Eine vollständige Entfernung ist nicht möglich, aber man kann eine Wertschätzung für die Schwierigkeit gewinnen, Zellen in einer dissoziierten Probe vor der Myelinentfernung zu quantifizieren und die relative Leichtigkeit nach der Entfernung mit diskontinuierlichen Gradienten.
Die Ausbeute lebensfähiger Zellen aus dissoziierten Patientenproben kann sehr variabel sein. Optimalerweise werden 105 Zellen in jede der fünf Empfängermäuse transplantiert, obwohl wir eine Transplantation mit nur 3.000 Zellen/Tier erhalten haben. Ungefähr die Hälfte der primären bösartigen Gliom-Proben (WHO-Klassen III und IV), die wir transplantiert haben, haben 40-100% der ursprünglichen Empfängermäuse eingepfropft. Nach der orthotopischen Transplantation müssen Empfängermäuse wöchentlich gewogen und regelmäßig auf Anzeichen und Symptome einer Tumortransplantation und -wachstum überwacht werden. Primäre orthotopische Xenografts zeigen diffuses, infiltratives Wachstum und fokale neurologische Symptome wie Hemiparese oder Krampfanfälle werden nur in seltenen Fällen beobachtet. Die empfindlichste Indikation für Tumortransplantation ist signifikant und anhaltende Gewichtsverlust, die von der Entwicklung der geknickten Haltung, rauen Haarmantel oder gewölbten Schädel begleitet werden kann. Die Rate, mit der Mäuse einen anhaltenden Gewichtsverlust entwickeln, ist je nach Patientenprobe sehr variabel und kann zwischen 60 und 350 Tagen liegen. NSG-Mäuse wiegen bei der Transplantation in der Regel 18-25 g und erreichen postoperativ ein Gewicht von 28-33 g für Erwachsene. Das Einstreumaterial sollte regelmäßig gewechselt werden, da die Käfigbedingungen das Gewicht der Tiere erheblich verändern können. Die Gewichte eines Tieres können von woche zu Woche um bis zu ein Gramm schwanken, und es kann schwierig sein, festzustellen, ob dies eine Tumortransplantation darstellt. Ein guter Hinweis auf tumorendetransplantation bei NSG-Mäusen, die Eingewichte für Erwachsene erreicht haben, ist ein anhaltender Gewichtsverlust von mehr als 3 g. Obwohl transplantierte Mäuse in der Regel einen allmählichen Gewichtsverlust entwickeln, der über einen Zeitraum von mehreren Wochen gemessen werden kann, kann die Gesundheit eines Tieres gelegentlich aufgrund des Tumorwachstums, z. B. nach der Entwicklung von Hydrocephalus, oder aufgrund nicht verwandter Ursachen wie Infektionen rapide abnehmen.
Nach der Euthanasie kann eine Tumortransplantation bei grober Inspektion des Gehirns nicht ohne weiteres erkennbar sein, und eine histologische Bestätigung ist unerlässlich. Für anfängliche Tumorempfänger verarbeiten wir jedes Gehirn auf die gleiche Weise, so dass ein Teil histologisch ausgewertet wird und andere Portionen für die nachfolgende Tumorpassage kryokonserviert werden, wenn die Transplantation überprüft wird. Wie oben beschrieben, wird das Gehirn in einen Matrixschneider gelegt, um 2 mm koronale Scheiben zu erzeugen, wobei jede Scheibe einen definierten Bereich des Gehirns entlang der vorderen zur hinteren Achse darstellt. Die koronale Scheibe #3, die routinemäßig die Injektionsstelle enthält, wird in Formalin fixiert und jede der verbleibenden Scheiben wird in ein separates, als Kryovial gekennzeichnetes Kryovial mit 1 ml Kryokonservierungsmedium gelegt. Formalin fixed paraffin embedded (FFPE) Dias werden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, um die Histologie zu bewerten und mit Antikörpern gegen Ki67 und menschliches Vimentin, um transplantierte Zellen zu visualisieren.
Sobald die Transplantation überprüft ist, kann der Tumor durchdrungen werden und die Transplantationsraten bei sekundären Empfängern sind in der Regel höher bei 80-100%. Wir empfehlen, einen Tumor zum ersten Mal in einer größeren Anzahl von Empfängermäusen zu passieren, so dass ausreichend kryokonserviertes Material erzeugt werden kann, um eine bestimmte Tumorlinie bei niedriger Passage (2-5) für zukünftige Studien aufrechtzuerhalten. Die medialen Überlebenszeiten für einen bestimmten Tumor sind im Allgemeinen von Durchgang zu Durchgang ähnlich, wenn jedes Mal die gleiche Anzahl von Tumorzellen transplantiert wird.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir sind uns besonders bei Patienten am Vanderbilt University Medical Center zu zu sehr gedankt, die unschätzbares Forschungsmaterial für die Molecular Neurosurgical Tissue Bank zur Verfügung gestellt haben. Wir danken allen, die die Tissue Bank gegründet und unterhalten haben, Reid C. Thompson MD (Hauptermittler), Cherryl Kinnard RN (Forschungsschwester) und Larry A. Pierce MS (Manager). Histologische Dienstleistungen wurden teilweise vom Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Translational Pathology Shared Resource (unterstützt durch die Auszeichnung 5P30 CA068485 an das Vanderbilt-Ingram Cancer Center) durchgeführt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an MKC aus dem NINDS (1R21NS070139), dem Burroughs Wellcome Fund und den VMC-Entwicklungsfonds unterstützt. MKC wird durch das Department of Veterans Affairs, Veterans Health Administration, Office of Research and Development, Biomedical Laboratory Research and Development durch Stipendium 1 I01 BX000744-01 unterstützt. Der Inhalt gibt nicht die Ansichten des Department of Veterans Affairs oder der Regierung der Vereinigten Staaten wieder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
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