Summary
I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici.
Abstract
I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici. Per modellare i gliomi maligni di grado III e IV dell'OMS nei test di trapianto, le cellule tumorali umane vengono xenografate in un sito ortotopico, il cervello, di topi immunocompromessi. A differenza degli xenoinnesti secondari che utilizzano cellule tumorali coltivate, le cellule glioma umane vengono dissociate dagli esemplari resected e trapiantate senza passaggio preventivo nella coltura tissutale per generare xenografti primari. La procedura in questo rapporto descrive in dettaglio la preparazione del campione tumorale, il trapianto intracraniale in topi immunocomprosi compromessi, il monitoraggio per l'innesto tumorale e la raccolta del tumore per il successivo passaggio negli animali riceventi o l'analisi. La preparazione delle cellule tumorali richiede 2 ore e la procedura chirurgica richiede 20 min / animale.
Introduction
I gliomi maligni sono tumori gliali primari del sistema nervoso centrale che si verificano nel cervello e occasionalmente nel midollo spinale. I gliomi sono classificati dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) in base alla somiglianza istologica con astrociti, oligodendrociti o cellule ependimali e quindi classificati numericamente (da I a IV) per caratteristiche patologiche di malignità. I sottotipi istologici più comuni sono astrocitomi, oligodendrogliomi e oligoastrocitomi misti. I gliomi maligni che comprendono i gradi da II a IV dell'OMS sono caratterizzati da crescita invasiva e recalcitranza alle terapie attuali. Ogni anno negli Stati Uniti, a circa 15.750 individui viene diagnosticato un glioma maligno e si stima che 12.740 pazienti soccombano a questa malattia. Queste statistiche evidenziano la natura particolarmente letale dei gliomi maligni e l'importante necessità di una maggiore efficacia terapeutica.
I modelli di cancro sono essenziali per studiare la biologia e le terapie tumorali. Le linee cellulari tumorali umane rappresentano un primo passo importante per le manipolazioni in vitro e gli studi di xenoin vivo (xenografti secondari)1. Tuttavia, le colture standard di cellule tumorali subiscono una trasformazione fenotipico e genotipico2-4 che potrebbe non essere ripristinata negli xenoinnestisecondari 5. Inoltre, alterazioni genetiche come mutazioni dell'isocitrato deidrogenasi(IDH)6, popolazioni distinte di cellule staminali7 e dipendenza dalle principali vie di segnalazione8 possono essere perse nelle colture delle cellule tumorali. I profili genomici possono essere mantenuti in misura migliore nella cultura della sfera tumorale, anche se non riescono ancora a rispecchiare completamente il genotipo dei tumoriprimari 2,3. Il trapianto ortotopico diretto nega le influenze della coltura in vitro, fornisce un microambiente adeguato e preserva l'integrità delle cellule che iniziano il tumore9,10. Pertanto, gli xenoinnesti primari rappresentano un modello preclinico potente e pertinente per testare rigorosamente agenti mirati per aiutare nella progettazione razionale dei futuri studiclinici 5,11,12.
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Protocol
1. Preparazione della sospensione delle cellule tumorali
Nota: Sono necessarie adeguate approvazioni istituzionali per l'uso di materiale paziente e animali per stabilire e mantenere gli xenografti di glioma ortotopici primari. Al Vanderbilt University Medical Center, il materiale tumorale reinsediato che è superiore a quello richiesto per scopi diagnostici viene raccolto con il consenso del paziente per un deposito di tessuti di ricerca. I campioni sono etichettati con un numero di database REDcap randomizzato a 5 cifre e tutti gli identificatori specifici del paziente vengono rimossi. Il database REDcap contiene dati clinici deidentificati per ogni campione nel repository tissutale che include sesso, età (negli anni), razza, stato di sopravvivenza, patologia, trattamenti antitumorali, anno di resezione e tempo di progressione. Per mantenere la sterilità e ottimizzare il successo del metodo dello xenograft primario, tutti i reagenti, gli strumenti chirurgici autoclavati a vapore e il sito chirurgico devono essere assemblati o preparati in anticipo.
Nota: Gli esemplari di glioma spesso contengono grandi quantità di mielina e detriti. A seconda delle dimensioni del campione, potrebbe essere necessario utilizzare più di 4 tubi gradienti discontinui per un'adeguata rimozione di mielina e detriti.
Nota: Il processo viene completato quando non rimane tessuto non dissociato, o poco, chiaramente visibile. Evitare l'introduzione di bolle durante il processo di triturazione.
Nota: La vitalità cellulare dopo la dissociazione è in genere >90%. Le viabilità più basse possono riflettere molte variabili tra cui la manipolazione del tessuto non ottimale o il tempo di trasporto dalla sala operatoria, il metodo di crioconservazione o la tecnica di dissociazione della papaina. Tuttavia, le minori capacità cellulari possono essere ancora adeguate, a condizione che un numero sufficiente di vitali possano essere trapiantati nel volume appropriato. Per ogni topo, 50.000-200.000 cellule vitali vengono impiantate in volume di 2 μl. A causa della punta smussata dell'ago della siringa, nel volume finale devono essere inclusi altri 5 μl di sospensione cellulare per garantire che nel volume finale possa essere prelevato materiale adeguato nella siringa per ogni iniezione. Ad esempio, per iniettare 2 μl/topo per 5 topi il volume finale dovrebbe essere di 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl).
- Mettere il materiale paziente appena reinsediato e deidentificato in un contenitore sterile e chiuso sul ghiaccio per il trasporto in laboratorio. Elaborare il campione direttamente per il trapianto o crioconservare il campione in azoto liquido (vedi sotto) per la conservazione in azoto liquido e successivamente l'uso.
- Preparare le soluzioni di dissociazione della papaina (soluzione di papaina, soluzione inibitore di lavaggio/proteasi e soluzione gradiente discontinuo) in una cappa sterile con i componenti del kit e le istruzioni fornite dal produttore. Etichettare tubi conici sterili in polistirolo da 15 ml e distribuire le soluzioni come segue:
- Tubo 1: 5 ml di soluzione di papaina
- Tubo 2: 3 ml di soluzione inibitore del lavaggio/proteasi
- Tubi 3-6: 5 ml ciascuno di soluzione gradiente discontinuo
- Posizionare il campione di glioma nel tubo 1 con 5 ml di soluzione di papaina e triturato con una pipetta da 5 ml in un periodo di tempo di 10-20 minuti.
- Pipettare il materiale su e giù 10 volte e quindi incubare il materiale per 2-3 minuti a temperatura ambiente prima di iniziare il ciclo successivo di triturazione.
- Posizionare la punta della pipetta da 5 ml più vicino al fondo del tubo conico con ogni ciclo di triturazione in modo che la punta tocchi il fondo del tubo negli ultimi 2 cicli.
- Centrifuga a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere il supernatante e pipettare il pellet su e giù 10x in 3 ml della soluzione inibitore di lavaggio/proteasi.
- Stratalizzare con cura un volume uguale della sospensione su ciascuna delle soluzioni di gradiente discontinuo da 5 ml (tubi 3-6), con un pipettor impostato alla velocità di erogazione "gravità".
- Posizionare i tubi in una centrifuga dotata di un rotore a benna oscillante, con la velocità di accelerazione ridotta all'impostazione più bassa e il freno spento. Centrifuga a 76 x g per 12 min a temperatura ambiente. Con il freno spento, la centrifugazione viene generalmente completata dopo 20 minuti.
- Rimuovere il supernatante, resuspend e combinare ogni pellet in 5 ml di soluzione di sale sterile bilanciato e posizionare le cellule sul ghiaccio.
- Rimuovere una porzione (10-100 μl) della sospensione cellulare e determinare la densità delle cellule vitali mediante esclusione blu tripano con un emocitometro.
- Centrifuga a 300 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare ad una densità di 25.000-125.000 cellule vitali per μl.
- Trasferire un volume adeguato della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 200 μl (tubo PCR) e posizionarlo sul ghiaccio.
2. Preparazione del sito chirurgico e degli strumenti
Nota: I guanti chirurgici sterili vengono indossati durante la procedura. A seconda delle esigenze di ogni istituzione, possono essere necessari abiti chirurgici, berretti e protezioni per il viso.
- Preparare un banco disinfettato per la chirurgia dei roditori con aree adiacenti separate per la preparazione degli animali, il campo operativo e il recupero degli animali.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici in un'autoclave a vapore. Successivamente, utilizzare uno sterilizzatore di perline calde per sterilizzare gli strumenti quando si passa da un animale all'altro.
3. Induzione, Anestesia e Analgesia
Nota: Gli interventi chirurgici che superano i 15 minuti dal momento in cui i topi potrebbero essere anestetizzati richiedono una fonte di calore di contatto. Per prevenire l'ipotermia, ai topi viene fornita una fonte di calore (coperta di acqua calda circolante) durante i periodi pre e post-operatori.
- Preparare il cocktail di ketamina/xiazina per l'anestesia di induzione in modo che ogni topo riceva ketamina 100 mg/kg e xiazina 10 mg/kg iniettando 10 μl del cocktail per grammo di peso corporeo.
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La tabella 1. Cocktail di anestesia.
Concentrazione di scorte Volume per prepararsi un mouse cinque topi dieci topi Ketamina 100 mg/ml 25 μl 125 μl 250 μl Xiazina 100 mg/ml 2,5 μl 12,5 μl 25 μl Salina isotonica 223 μl 1.113 μl 2.225 μl totale 250 ul 1.250 μl 2.500 μl - Preparare la soluzione di chetoprofene per l'analgesia diluendo la soluzione stock (10 mg/ml) 1:20 in acqua sterile e priva di piogeni in modo che ogni topo riceva una dose di 5 mg/kg iniettando 10 μl della soluzione per grammo di peso corporeo.
- Pesare e registrare il peso prechirurgico. I singoli pesi del mouse variano, ma generalmente vanno da 18-22 g.
- Iniettare 10 μl del cocktail chetamina/xiazina per grammo di peso corporeo del topo nello spazio intraperitoneale con una siringa per insulina. Ad esempio, iniettare 200 μl per un topo da 20 g.
- Determinare se il mouse è completamente anestetizzato dal pizzico della gamba posteriore. Generalmente ci vogliono 3-5 minuti perché il mouse non si ritiri più dal pizzico.
- Iniettare 10 μl della soluzione di chetoprofene per grammo di peso corporeo del topo per via sottocutanea nella pelle sciolta del fianco con una siringa per insulina. Ad esempio, iniettare 200 μl per un topo da 20 g.
- Radere i capelli sul cranio con le tosaerba, strofinare il cuoio capelluto esposto con povidone-iodio usando un applicatore a punta di cotone e quindi pulire un tampone alcolico. Ripetere questi passaggi, scrub povidone-iodio e salvietta alcolica, altre due volte.
- Applicare unguento oftalmico agli occhi del topo.
- Fai un'incisione della linea mediana di 1 cm che si estende da dietro le orecchie a proprio davanti agli occhi con una lama sterile del bisturi.
- Posizionare il mouse sotto un mirino di sezionamento ed esporre il cranio per identificare le linee di sutura. Utilizzando movimenti circolari con un trapano, centrare un foro di bava laterale di 2,5 mm al bregma e 1 mm posteriore alla sutura coronale.
4. Trapianto intracranale
Nota: I volumi di iniezione superiori a 2,5 μl possono essere letali per i topi.
- Posizionare il mouse su un telaio stereotattico agganciando gli incisivi superiori sopra la barra incisiva e applicando il morsetto del naso in modo che il cranio sia saldamente tenuto in posizione neutra.
- Disegnare 5-10 μl delle cellule in un tubo di microcentrifugo su e giù più volte in una siringa Hamilton da 10 μl bloccata nel supporto della sonda del manipolatore stereotattico per mescolare le sospensioni ed eliminare le bolle. Deprimere lo stantuffo in modo che la siringa sia caricata con 2 μl (il volume adeguato per iniettare un animale).
- Tirare il bordo laterale dell'incisione cutanea per esporre il foro di bava e, con il micromanipolatore, introdurre l'ago nel foro di bava in modo che la porzione smussata sia appena sotto la superficie del cranio.
- Far avanzare l'ago di 3 mm e quindi ritirare l'ago di 0,5 mm per creare uno spazio per l'iniezione.
- Far avanzare lentamente lo stantuffo per oltre 30 secondi e quindi lasciare che l'ago rimanga nel cervello per altri 2 minuti. Prelevare gradualmente l'ago salendo di 0,5 mm e aspettando altri 30 secondi prima di rimuovere l'ago dal cervello.
- Rimuovere il mouse dal telaio stereotattico e chiudere la ferita con un'autoclip.
- Posizionare il mouse su un tampone riscaldante per mantenere la temperatura corporea e monitorare continuamente il modello di respirazione e il colore delle mucose e dei tessuti esposti (suole dei piedi).
- Posizionare il topo in una gabbia di microisolatore sterile una volta recuperato completamente dall'anestesia (sternale e ambulatoriale) e restituirlo alla struttura abitativa degli animali.
5. Cura e osservazione degli animali post-impianto
Nota: L'indicazione più affidabile di innesto tumorale e crescita infiltrativa è una perdita di peso graduale e sostenuta accompagnata dallo sviluppo di postura intuizioneta e pelo ruvido. In rare occasioni, si nota deficit neurologici che includono atassia, paresi e convulsioni. Gli xenoinnesti primari ortotopici sono altamente invasivi e si sviluppano per un lungo periodo di tempo. I topi manifestano in genere sintomi di crescita tumorale 3-6 mesi dopo il trapianto.
- Osserva quotidianamente topi con xenoinnesti ortotopici per l'assunzione di cibo e acqua, comportamento, toelettatura e segni di infezione nel sito di incisione.
- Somministrare chetoprofene (5 mg/kg per via sottocutanea, 1-2 volte al giorno) se si osserva dolore o angoscia postoperatoriamente.
- Rimuovere le clip automatiche 8-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Pesare i topi settimanalmente.
- Monitorare i segni e i sintomi dell'innesto tumorale.
6. Raccolta del tumore
Nota: Con questo metodo, la prima fetta coronale (#1) contiene l'aspetto posteriore dei bulbi olfattivi e l'aspetto anteriore dei lobi frontali. Il tumore innestato è più abbondante nell'emisfero destro delle successive 3 fette coronali (fetta #2, #3 e #4) e la vista di iniezione è regolarmente contenuta nella fetta coronale #3. A seconda delle esigenze sperimentali, il materiale può essere utilizzato per il passaggio tumorale, sezioni di tessuto congelato, sezioni di tessuto incorporato di paraffina fissa formalina, citometria del flusso del tessuto dissociato, coltura cellulare o lysati per analisi di DNA, RNA o proteine. Parti del tumore possono essere crioconservate per esigenze future con vitalità cellulare che vanno dall'80 al 95%.
- Eutanasia dei topi per esposizione prolungata all'anidride carbonica seguita da lussazione cervicale.
- Decapitare i topi eutanasiati alla base del cervello (livello di forame magnum) con un paio più grande di forbici chirurgiche e estrarre la pelle dall'incisione in avanti per esporre completamente il cranio.
- Rimuovi il cervello.
- Inserire una punta di coppia di forbici chirurgiche fini nell'aspetto laterale del forame magnum al livello del meato uditivo esterno sinistro per tagliare l'osso occipitale lungo il lato sinistro del cranio. Eseguire lo stesso taglio sul lato destro.
- Tagliare l'osso occipitale lungo un piano coronale da un meato uditivo esterno all'altro e rimuovere l'osso per esporre il cervelletto.
- Tagliare le placche ossee nasali tra gli occhi.
- Tagliare la sutura sagittale tagliando posteriormente lungo la sutura sagittale dalle placche ossee nasali al bregma. Completare l'incisione della linea mediana lungo la sutura sagittale tagliando anteriormente dalla lambda al bregma.
- Inserire con cura la punta di un bel paio di force lungo l'apertura sagittale su ciascun lato per strappare qualsiasi adesione durale del cranio al cervello e quindi sbucciare le due metà del cranio lateralmente per esporre dorsalmente il cervello e i bulbi olfattivi.
- Far scorrere le forcep tra l'aspetto ventrale dei bulbi olfattivi e il cranio per liberare eventuali aderenze.
- Inclinare il cranio verso l'indietro per consentire al cervello di essere retratti in modo che l'ottica e altri nervi cranici siano esposti. Sever i nervi cranici per rilasciare il cervello in un piatto contenente PBS sterile.
- Trasferire il cervello con una spatola di pesatura su un filtro a fette a matrice e generare fette coronali da 2 mm con lamette da barba.
- Disporre le fette coronali in un piatto contenente PBS sterile per un'ulteriore ispezione visiva e un'ulteriore lavorazione dei tessuti.
7. Crioconservazione tumorale
- Preparare una soluzione stock di mezzo di crioconservazione.
- Aggiungere 50 ml di integratore di proliferazione, 5 ml di penicillina 100x e soluzione di streptomicina e 450 μl di 0,2% di eparina a 450 ml di mezzo basale.
- Conservare la soluzione stock a 4 °C protetta dalla luce.
- Preparare una soluzione funzionante di mezzo di crioconservazione.
- Unire 47,5 ml di mezzo di crioconservazione e 2,5 ml di DMSO sterile in un tubo conico in polipropilene da 50 ml e mescolare bene.
- Aliquota 1,0 ml di soluzione di lavoro per ogni crioviale e conservare a 4 °C protetto dalla luce.
- Posizionare una fetta coronale di cervello xenografato di 2 mm in un mezzo crioconservato contenente crioconservazione sul ghiaccio.
- Cappuccio stretto il flaconcino e posizionarlo in un contenitore di congelamento a -80 °C. Trasferire il criovio il giorno seguente in un serbatoio di azoto liquido per una conservazione più lunga.
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Representative Results
Le cellule di glioma dissociate vengono trapiantate direttamente nel cervello di topi immunocompromessi per ottenere linee primarie di xenograft ortotopico. Ad ogni campione tumorale viene assegnato un numero randomizzato prima del trapianto, come parte del processo di deidentificazione per rimuovere le informazioni sanitarie protette. A tale scopo utilizziamo un numero di database REDcap a 5 cifre. La figura 1 illustra il processo e la nomenclatura per stabilire una linea di xenograft da un glioblastoma (GBM 17182) con isocitrato deidrogenasi 1 (IDH1) mutazione arginina 132 a istidina (R132H). Dopo il trapianto viene aggiunta una "X" al numero di identificazione tumorale per indicare il tumore xenografato, seguito da una "P" per tracciare il numero di passaggio. P0 designa il ricevente iniziale del trapianto e P1 designa i topi riceventi del primo passaggio di xenograft. Tipicamente, 3-5 topi vengono inizialmente trapiantati per stabilire una linea e il tumore xenografato viene quindi inserito in 10 topi ricevente (P1) per espandere la linea per studi futuri.
Dopo il trapianto ortotopico, i topi riceventi sono monitorati per i segni e i sintomi dell'innesto e della crescita del tumore. L'indicazione più sensibile dell'innesto tumorale è una perdita di peso significativa e sostenuta. Poiché i topi vengono trapiantati in giovane età, è previsto un aumento di peso post-operatorio. I pesi dei topi possono fluttuare in modo apparentemente drammatico di settimana in settimana, tuttavia una perdita sostenuta superiore a 3 g è generalmente una buona indicazione dell'innesto tumorale. Tipicamente, la maggior parte dei topi in una coorte di xenograft sviluppa la perdita di peso in un periodo di tempo simile che va da 60 giorni a 350 giorni a seconda del tumore. I tempi di sopravvivenza mediana per un dato tumore sono generalmente simili da passaggio a passaggio quando lo stesso numero di cellule tumorali viene trapiantato ogni volta. Illustrata nella Figura 2 è una coorte di 5 topi trapiantati con un GBM (17182XP2) che era stato precedentemente innestato e passato una volta. Quattro dei cinque topi 17182XP2 hanno dimostrato una significativa perdita di peso 17 settimane dopo il trapianto. Il topo rimanente (topo 3) non ha mostrato perdita di peso e nessun tumore è stato rilevato durante l'esame post mortem, indicando l'innesto tumorale solo nell'80% dei destinatari.
Quando viene raccolto il cervello di un topo sintomatico, una matrice di affettatrici cerebrali è uno strumento estremamente prezioso per l'elaborazione dei tessuti. La generazione di sezioni multiple, anatomicamente definite da ogni cervello, consente più modalità di analisi con alcune porzioni e crioconservazione di altre porzioni del tessuto. Ad esempio, lo stato mutazionale di IDH1 può essere valutato sequenziando Sanger con materiale proveniente da una porzione o immunoistochimica con un'altra (Figura 3). L'innesto tumorale può essere facilmente evidente mediante ispezione visiva delle sezioni coronali, tuttavia, l'istologia con immunoistochimica può essere richiesta per alcuni xenoinnesti(figure 4 e 5). Quando si dissocia uno xenoinnesto per il passaggio seriale o altri studi, è importante iniziare con una piccola e definita porzione di materiale in modo che mielina e detriti possano essere adeguatamente rimossi(Figura 6). Il gradiente discontinuo del sistema di dissociazione della papaina è più adatto per l'elaborazione di piccole porzioni di un cervello di topo adulto. Si consiglia di tagliare ogni sezione coronale lungo la linea mediana e di utilizzare due gradienti discontinui per ogni metà.
Figura 1. Le linee primarie di xenoinnesto ortotopico vengono stabilite trapiantando cellule di glioma dissociate direttamente nel cervello di topi immunocompromessi e quindi espanse mediante trapianto seriale. Mutazioni somatiche eterozigoti all'arginina 132 del gene IDH1 si verificano in oltre il 70% di astrocitomi diffusi, oligodendrogliomi, oligoastrocitomi e glioblastomi secondari e meno del 7% dei glioblastomi primari. GBM 17182 contiene la mutazione IDH1 più comune, l'arginina 132 all'istidina (R132H). Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 2. Le curve di crescita dei riceventi di trapianti seriali di GBM 17182XP1 dimostrano una significativa perdita di peso 130-150 giorni dopo l'intervento chirurgico in 4 topi GBM 17182XP2 da 5 GBM. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 3. La mutazione Eterozigote e somatica IDH1 R132H nel tumore del paziente (GBM 17182) e nello xenograft primario (17182XP0) può essere rilevata dal sequenziamento sanger o dalla colorazione degli anticorpi. L'immunoistochimica con un anticorpo specifico dell'IDH1 R132H dimostra cellule di glioma mutanti densamente raggruppate attorno ai vasi sanguigni o in regioni più diffuse infiltrate del campione paziente e del cervello del topo. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 4. Gli xenoinnesti ortotopici primari mostrano una crescita altamente infiltrativa che può essere difficile da apprezzare appieno solo con la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E). L'immunoistochimica con un anticorpo specifico per l'uomo è un metodo particolarmente utile per identificare le cellule umane innestati. La colorazione anti-umana di un oligoastrocitoma xenograft analplastico (14175XP2) rivela le caratteristiche tipiche di un glioma infiltrativo con una massa tumorale diffusa nell'emisfero destro iniettato e una crescita invasiva lungo tratti mielini del corpo calloso (asterischi) e delle fibre striatopallidali (punte di freccia nere) e diffusione leptomeningeale (freccia nera). Non apprezzato a questo ingrandimento (1,25X) è il raggruppamento di cellule tumorali umane attorno ai neuroni del topo (satellitosi perineuronale) nella corteccia invasa. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 5. L'analisi dell'oligoastrocitoma analplastico 14175XP2 sezioni coronali a potenza superiore (40X) nelle regioni in scatola A-C rivela cellule umane mutanti IDH attorno ai vasi sanguigni (regione A), nei tratti striatopallidi ("fibre di matita;" regione B) e nel corpus calloso (regione C). Come per GBM 17182XP2, la colorazione IDH1 R132H dell'oligoastrocitoma anaplastico 14175XP2 dimostra che la mutazione IDH viene mantenuta in uno xenoinnesto ortotopico primario a seguito di passaggi seriali nei topi riceventi. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
Figura 6. Le cellule tumorali umane possono essere distinte dalle cellule del topo negli xenoinnesti dissociati in base alle dimensioni. Per quantificare le cellule tumorali umane in uno xenograft dissociato per il passaggio seriale, le cellule umane sono identificate in un emocitometro sotto microscopia leggera dalle loro grandi dimensioni e dalla luminescenza verde scuro (punte di freccia). Per citometria del flusso, le cellule umane hanno proprietà di dispersione distinte dal materiale del mouse e possono essere gated per ulteriori analisi. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.
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Discussion
Linee cellulari coltivate, xenografti e topi geneticamente modificati sono i metodi più comuni per modellare i gliomi e ci sono benefici e limitazioni distinti per ogni sistemamodello 3,13,14. I benefici rilevanti degli xenografti di glioma ortotopico primario includono la crescita infiltrativa che caratterizza i gliomi diffusi e la ritenzione di alterazioni genetiche e importanti meccanismi di segnalazione che possono essere estremamente difficili da mantenere nelle cellule di glioma coltivate. Ad esempio, le mutazioni dell'isocitrato deidrogenasi e la produzione di ligando riccio sonico possono essere mantenute negli xenoinnesti ortotopiciprimari 15,16 ma solo raramente nelle cellule di gliomacoltivate 14,17-19. È importante considerare svantaggi significativi degli xenoinnesti ortotopici primari, tuttavia, a seconda delle esigenze sperimentali. Nonostante l'accesso a materiale adeguato del paziente, è più difficile misurare la crescita del glioma nel tempo nel cervello che in un sito eterotopico. Inoltre, gli xenoinnesti ortotopici primari crescono ad un ritmo significativamente più lento rispetto agli xenoinnesti eterotopici. Così gli investigatori possono preferire trapiantare cellule nel fianco di un topo immunocompromato, dove importanti caratteristiche istologiche e molecolari possono anche essere mantenute4.
Due considerazioni importanti per stabilire xenoinnesti ortotopici primari sono il tipo di ricevente immunocompromimato di topo e il grado di malignità del glioma. Abbiamo avuto un successo molto limitato nel creare xenografti primari nei topi atimici (nu-nu) e altrettanto un buon successo con i topi NOD / SCID e NSG(NOD /SCID / Interleukin-2 recettore gamma amma carente). I topi NSG sono destinatari preferibili a causa dell'aumento del tasso di innesto delle cellule tumorigeniche e di una maggiore durata rispetto ai topi NOD /SCID20,21. Per quanto riguarda il grado tumorale dell'OMS, abbiamo osservato l'innesto di glioma di tumori di grado III e IV ma non di grado I e II.
Per gli xenograft di glioma ortotopico primario, le cellule tumorali dissociate possono essere trapiantate direttamente nel cervello di topi immunocompromessi9 o cellule che iniziano il tumore possono essere potenziali isolate (ad esempio selezionando cellule che esprimono CD133) per il trapianto22. Entrambe le fonti di cellule sono adatte per l'innesto tumorale di successo nella nostraesperienza 15,16, anche se l'uso di cellule arricchite da CD133 richiede più materiale di partenza. Che si tratti di preparare cellule ordinate o non ordinate per il trapianto, è importante rimuovere adeguatamente mielina e detriti da campioni di glioma dissociati. La mancata rimozione di mielina e detriti ostacola notevolmente la capacità di disegnare la sospensione in una siringa Hamilton e trapiantare un numero uniforme di cellule in ogni ricevente. Dopo la dissociazione da papaina, è utile valutare una piccola aliquota usando un emocitometro al fine di determinare il numero di tubi gradienti discontinui che saranno necessari per eliminare sufficientemente mielina e detriti. La rimozione completa non è fattibile, ma si può ottenere un apprezzamento per la difficoltà di quantificare le cellule in un campione dissociato prima della rimozione della mielina e la relativa facilità dopo la rimozione con gradienti discontinui.
La resa di cellule vitali da campioni di pazienti dissociati può essere altamente variabile. In modo ottimale, 10 5 cellulevengono trapiantate in ciascuno dei cinque topi riceventi, anche se abbiamo ottenuto l'innesto con solo 3.000 cellule / animali. Circa la metà dei campioni di glioma maligno primario (gradi OMS III e IV) che abbiamo trapiantato hanno insiantato nel 40-100% dei topi riceventi iniziali. Dopo il trapianto ortotopico, i topi riceventi devono essere pesati settimanalmente e monitorati regolarmente per i segni e i sintomi dell'innesto e della crescita del tumore. Gli xenoinnesti ortotopici primari dimostrano una crescita diffusa e infiltrativa e sintomi neurologici focali come l'emiparesi o le convulsioni si osservano solo in rare occasioni. L'indicazione più sensibile dell'innesto tumorale è una perdita di peso significativa e sostenuta che può essere accompagnata dallo sviluppo di postura intuizione, pelo ruvido o cranio a cupola. La velocità con cui i topi sviluppano una perdita di peso sostenuta è altamente variabile a seconda del campione del paziente e può variare da 60-350 giorni. I topi NSG pesano in genere 18-25 g al trapianto e raggiungono post-operatoriamente pesi adulti di 28-33 g. Il materiale da letto deve essere cambiato regolarmente in quanto le condizioni della gabbia possono alterare in misura considerevole il peso degli animali. I pesi di un animale possono fluttuare fino a un grammo da una settimana all'altra e determinare se questo rappresenta l'innesto tumorale può essere difficile. Una buona indicazione dell'innesto tumorale nei topi NSG che hanno raggiunto pesi adulti è una perdita di peso sostenuta superiore a 3 g. Sebbene i topi innestati sviluppino tipicamente una graduale perdita di peso che può essere misurata per un periodo di diverse settimane, occasionalmente la salute di un animale può diminuire rapidamente a causa della crescita tumorale, a seguito dello sviluppo di idrocefalo, ad esempio, o da cause non correlate come l'infezione.
Dopo l'eutanasia, l'innesto tumorale potrebbe non essere facilmente evidente dall'ispezione grossolana del cervello e la conferma istologica è essenziale. Per i destinatari iniziali del tumore, emogiamo ogni cervello allo stesso modo in modo che una porzione venga valutata istologicamente e altre porzioni siano crioconservate per il successivo passaggio tumorale se l'innesto è verificato. Come discusso sopra, il cervello è posto in un affettatrice a matrice per generare fette coronali da 2 mm con ogni fetta che rappresenta una regione definita del cervello lungo l'asse anteriore a quello posteriore. La fetta coronale #3, che contiene regolarmente il sito di iniezione, è fissata in formalina e ciascuna delle fette rimanenti viene posta in un crioviale separato ed etichettato contenente 1 ml di mezzo di crioconservazione. Le diapositive in paraffina fissa formalina incorporata (FFPE) sono macchiate di ematossilina ed eosina per valutare l'istologia e con anticorpi contro Ki67 e vimentina umana per visualizzare le cellule innestati.
Una volta verificato l'innesto, il tumore può essere superato e i tassi di innesto nei riceventi secondari sono in genere più alti all'80-100%. Si consiglia di passare un tumore la prima volta in un numero maggiore di topi riceventi in modo che possa essere generato materiale crioconservato adeguato per mantenere una data linea tumorale a basso passaggio (2-5) per studi futuri. I tempi di sopravvivenza mediana per un dato tumore sono generalmente simili da passaggio a passaggio quando lo stesso numero di cellule tumorali viene trapiantato ogni volta.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Siamo particolarmente in debito con i pazienti del Vanderbilt University Medical Center che hanno fornito materiale di ricerca inestimabile per la Molecular Neurosurgical Tissue Bank. Ringraziamo coloro che hanno fondato e mantengono la Tissue Bank, Reid C. Thompson MD (principal investigator), Cherryl Kinnard RN (infermiere di ricerca) e Larry A. Pierce MS (manager). I servizi istologici sono stati eseguiti, in parte, dal Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Translational Pathology Shared Resource (supportato dal premio 5P30 CA068485 al Vanderbilt-Ingram Cancer Center). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a MKC da parte dei fondi di sviluppo NINDS (1R21NS070139), Burroughs Wellcome Fund e VMC. MKC è supportato dal Dipartimento degli Affari dei Veterani, Dalla Veterans Health Administration, dall'Office of Research and Development, dalla Biomedical Laboratory Research and Development attraverso la sovvenzione 1 I01 BX000744-01. I contenuti non rappresentano le opinioni del Dipartimento degli Affari dei Veterani o del Governo degli Stati Uniti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
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