Summary
악성 글리오마스는 뚜렷한 임상 및 분자 특징을 가진 고도로 침입된 신경교 신생물의 이질적인 그룹을 구성합니다. 1 차 성 치열 교정 이종이식은 전임상 동물 모델에서 악성 신경종 아류형의 조직 병리학 및 분자 특징을 재구성합니다.
Abstract
악성 글리오마스는 뚜렷한 임상 및 분자 특징을 가진 고도로 침입된 신경교 신생물의 이질적인 그룹을 구성합니다. 1 차 성 치열 교정 이종이식은 전임상 동물 모델에서 악성 신경종 아류형의 조직 병리학 및 분자 특징을 재구성합니다. WHO가 이식 분석에서 III 및 IV 악성 글리오마를 채점하는 것을 모델링하기 위해 인간 종양 세포는 면역 손상된 마우스의 직교 부위, 뇌로 이식됩니다. 배양된 종양 세포를 활용하는 이차 이차 이식과는 대조적으로, 인간 신경교종 세포는 절제된 견본에서 해리되고 1 차적인 이종이식을 생성하기 위하여 조직 배양에 있는 이전 통로 없이 이식됩니다. 이 보고서의 절차는 종양 샘플 준비, 면각 손상된 마우스로의 두개 내 이식, 종양 이식 및 종양 수확을 위한 모니터링을 통해 수령인 동물 또는 분석으로 이어지는 통과를 위한 세부 사항을 자세히 설명합니다. 종양 세포 준비는 2 시간 필요하 고 외과 적 절차는 20 분 / 동물이 필요합니다.
Introduction
악성 글리오마스는 뇌와 때때로 척수에서 발생하는 중추 신경계의 1 차 적인 신경교 종양입니다. Gliomas는 성상 세포, 올리고드로키테 또는 연골 세포에 대한 조직학적 유사성에 따라 세계 보건 기구 (WHO)에 의해 분류된 다음 악성종양의 병리학적 특징을 위해 수치적으로 등급화 (Ito IV). 가장 일반적인 히스토릭 아류형은 성상세포, 올리고드로글리오마 및 혼합 올리고아스트로시톰마스입니다. WHO 등급 II에서 IV에 대한 악성 글리오마는 현재 치료법에 대한 침습적인 성장과 재발을 특징으로합니다. 미국에서 매년, 대략 15,750명의 개별은 악성 신경종으로 진단되고 추정된 12,740명의 환자는 이 질병에 굴복합니다. 이 통계는 악성 글리오마의 특히 치명적인 특성과 향상된 치료 효능에 대한 중요한 필요성을 강조합니다.
암 모델은 종양 생물학 및 치료를 조사하기 위해 필수적입니다. 인간 암 세포주 체외 조작 및 생체 내 xenografting 연구 (이차 xenografts)1에대 한 중요 한 첫 번째 단계를 나타냅니다. 그러나, 표준 암 세포 배양은 이차 xenografts에서 복원되지 않을 수 있는 현상 및 genotypic 변환2-4를 겪는다5. 더욱이, 이소염 탈수소효소(IDH)돌연변이6,뚜렷한 줄기세포 인구7 및 주요 신호경로에 대한 의존성등 유전적 변화는 암세포 배양에서 손실될 수 있다. 유전체 프로파일은 암 구배 배양에서 더 나은 범위로 유지될 수 있지만, 여전히 1차 종양의 유전자형을 완전히 미러에 반영하지 못하지만2,3. 직접 직교 이식은 체외 배양의 영향을 부정하고, 적절한 미세 환경을 제공하며, 종양 개시 세포의 무결성을보존9,10. 따라서, 1차 이노그래프트는 향후 임상시험5,11,12의합리적 설계를 돕기 위해 표적 제제를 엄격하게 테스트하기 위한 강력하고 관련성 있는 전임상 모델을 나타낸다.
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Protocol
1. 종양 세포 현탁액 의 준비
참고: 1차 직립성 신경교종 xenografts를 설치하고 유지하기 위해서는 환자 물질 및 동물의 사용에 대한 적절한 제도적 승인이 필요합니다. 밴더빌트 대학 의료 센터에서, 진단 목적을 위해 필요한 것을 초과하는 절제된 종양 물질은 연구 조직 저장소에 대한 환자의 동의하에 수집됩니다. 표본은 무작위 5자리 REDcap 데이터베이스 번호로 레이블이 지정되고 모든 환자 별 식별자가 제거됩니다. REDcap 데이터베이스는 성별, 연령(년), 인종, 생존 상태, 병리학, 암 치료, 절제 연도 및 진행 시간을 포함하는 조직 저장소의 각 표본에 대한 변형된 임상 데이터를 포함합니다. 멸균을 유지하고 기본 이노이식 방법의 성공을 최적화하기 위해 시약, 증기 자동 수술 기구 및 수술 부위를 사전에 조립하거나 준비해야합니다.
참고: 신경교종 표본은 종종 많은 양의 골수인과 파편을 함유하고 있습니다. 시편 크기에 따라 미엘린과 이물질을 적절히 제거하기 위해 4개 이상의 불연속 그라데이션 튜브를 사용해야 할 수도 있습니다.
참고: 프로세스는 남아 있는 아무, 또는 거의, 명확하게 보이는 불순종한 조직이 있을 때 완료됩니다. 트리튜션 과정에서 거품이 도입되지 않도록 하십시오.
참고: 해리 후 세포 생존가능성은 일반적으로 >90%이다. 낮은 비우음은 수술실에서 최적의 조직 취급 또는 수송 시간을 포함하여 많은 변수를 반영할 수 있습니다, 냉동 보존 방법, 또는 papain 해리 기술. 낮은 세포 비부채는 여전히 적절할 수 있지만, 충분한 수의 생존이 적절한 부피로 이식될 수 있는 한. 각 마우스에 대해, 50,000-200,000의 실행 가능한 세포는 2 μl의 부피로 이식됩니다. 주사기 바늘의 경부 팁으로 인해, 각 주사에 대한 적절한 물질을 주사기에 그릴 수 있도록 세포 현탁액의 추가 5 μl을 최종 부피에 포함시켜야합니다. 예를 들어, 5 마우스에 대해 2 μl/마우스를 주입하려면 최종 부피가 15 μl(15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl이어야 한다.
- 실험실로 운반하기 위해 얼음 위에 갓 절제되고 변형된 환자 물질을 멸균 용기에 놓습니다. 시편을 이식하거나 냉동 보존을 위해 직접 처리하여 액체 질소에 저장하고 나중에 사용할 수 있습니다(아래 참조).
- 제조자가 제공하는 키트 구성 요소 및 지침과 함께 멸균 후드에 파팡 해리 솔루션(파팡 용액, 세척/프로테아제 억제제 용액 및 불연속 그라데이션 용액)을 준비합니다. 라벨 멸균 15ml 폴리스티렌 원내 형 관과 다음과 같이 솔루션을 배포 :
- 튜브 1: 파팡 용액 5ml
- 튜브 2: 워시/프로테아제 억제제 용액 3ml
- 튜브 3-6: 불연속 그라데이션 용액 5ml
- 신경교종 표본을 튜브 1에 5 ml의 파팡 용액을 놓고 10-20 분 동안 5 ml 파이펫으로 삼중화하십시오.
- 재료를 위아래로 10번 피펫한 다음 실온에서 2-3분 동안 재료를 배양한 다음 다음 트리튜레이션 주기를 시작합니다.
- 팁이 마지막 2 주기 동안 튜브의 바닥을 만지는 것을 있도록 트리튜션의 각 주기와 함께 원식 튜브의 바닥에 가까운 5ml 파이펫의 끝을 배치합니다.
- 실온에서 5 분 동안 300 x g의 원심 분리기. 세차/프로테아제 억제제 용액 3ml에서 펠릿을 위아래로 10배 위아래로 제거합니다.
- 조심스럽게 "중력"디스펜스 속도로 설정 파이펫과 5ml 불연속 그라데이션 솔루션 (튜브 3-6)의 각 에 서스펜션의 동일한 볼륨을 층.
- 스윙 버킷 로터가 장착된 원심분리기에 튜브를 배치하고 가속 속도가 가장 낮은 설정으로 감소하고 브레이크가 꺼져 있습니다. 상온에서 12 분 동안 76 x g의 원심 분리기. 브레이크가 꺼져 있는 경우 원심분리는 일반적으로 20분 후에 완료됩니다.
- 상체를 제거하고, 각 펠릿을 멸균 균형 잡힌 소금 용액 5ml에 재봉틀어 넣고 얼음 위에 놓습니다.
- 세포 현탁액의 부분(10-100 μl)을 제거하고 혈류계를 사용하여 트립판 블루 배제에 의해 실행 가능한 세포의 밀도를 결정한다.
- 300 x g의 원심분리기는 5분 동안. 상체를 제거하고 μl 당 25,000-125,000 개의 실행 가능한 세포의 밀도로 세포 펠릿을 다시 분리하십시오.
- 200 μl 마이크로센심분리기 튜브(PCR 튜브)로 충분한 양의 셀 서스펜션을 전송하고 얼음 위에 놓습니다.
2. 수술 부위 및 기기 준비
참고: 멸균 수술 장갑은 시술 중에 착용됩니다. 각 기관의 요구 사항에 따라 외과 용 가운, 모자 및 얼굴 가드가 필요할 수 있습니다.
- 동물 제제, 수술장 및 동물 회복을 위해 분리된 인접 지역을 갖춘 설치류 수술을 위해 감염된 벤치탑을 준비하십시오.
- 증기 오토클레이브에서 수술 기구를 살균합니다. 그 후, 뜨거운 비드 멸균제를 사용하여 한 동물에서 다음 동물로 전환할 때 악기를 플래시 멸균합니다.
3. 유도, 마취 및 진통
참고: 마우스가 마취될 때부터 15분 이상 을 초과하는 수술은 접촉 열원이 필요합니다. 저체온증을 방지하기 위해, 마우스는 수술 전 및 수술 후 기간 동안 열원 (순환 온수 담요)을 제공합니다.
- 각 마우스가 체중 1그램당 칵테일 10 μl을 주입하여 케타민 100 mg/kg및 자일라진 10 mg/kg을 수신할 수 있도록 유도 마취를 위해 케타민/자일라진 칵테일을 준비합니다.
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표 1. 마취 칵테일.
재고 농도 준비하는 볼륨 마우스 1개 5마리의 마우스 10마리의 마우스 케타민 100 mg/ml 25 μl 125 μl 250 μl 자야진 100 mg/ml 2.5 μl 12.5 μl 25 μl 이소토닉 식염수 223 μl 1,113 μl 2,225 μl 합계 250 ul 1,250 μl 2,500 μl - 각 마우스가 체중 1그램당 용액의 10 μl을 주입하여 5 mg/kg의 용량을 수신하도록 한 멸균, 표겐없는 물에 1:20의 스톡 용액(10 mg/ml)을 희석하여 진통용 케토프로펜 용액을 준비한다.
- 계량 및 사전 수술 체중을 기록합니다. 개별 마우스 가중치는 다양하지만 일반적으로 18-22 g범위입니다.
- 인슐린 주사기로 관면 공간에 마우스 몸무게 1그램당 케타민/자일라진 칵테일 10μl을 주입합니다. 예를 들어 20g 마우스에 200 μl을 주입합니다.
- 마우스가 뒷다리의 발가락 핀치에 의해 완전히 마취되었는지 여부를 결정합니다. 일반적으로 마우스가 더 이상 핀치에서 철수하지 않는 데 3-5 분이 걸립니다.
- 인슐린 주사기로 측면의 느슨한 피부에 마우스 체중 무게의 그램 당 케토프로펜 용액의 10 μl을 피하로 주입합니다. 예를 들어 20g 마우스에 200 μl을 주입합니다.
- 클리퍼로 두개골 위에 머리를 면도하고, 면 팁 어플리케이터를 사용하여 포비달 요오드로 노출된 두피를 문질러서 알코올 패드를 닦아냅니다. 이 단계, 포비도요오드 스크럽과 알코올 닦아, 두 번 더 반복합니다.
- 마우스의 눈에 안과 연고를 바치다.
- 멸균 메스 블레이드로 귀 뒤에서 눈 바로 앞까지 1cm 의 중간 절개를 만듭니다.
- 마우스를 해부 범위 아래에 놓고 두개골을 노출하여 봉합사 선을 식별합니다. 드릴이 있는 원형 동작을 사용하여 버 홀 2.5mm 측면을 브레그마에, 1mm 후방을 관상 봉합사에 집중시합니다.
4. 두개내 이식
참고: 2.5 μl을 초과하는 주사 부피가 마우스에 치명적일 수 있다.
- 마우스를 절개 막대 위에 연결하고 코 클램프를 적용하여 마우스를 중립 자세로 단단히 고정하여 고정 프레임에 배치합니다.
- 마이크로센트심분리기 튜브에 있는 세포의 5-10 μl을 스테레오전술 조작기의 프로브 홀더에 고정된 10 μl 해밀턴 주사기로 여러 번 위아래로 그려 서스펜션을 혼합하고 거품을 제거합니다. 주사기가 2 μl (한 동물을 주입하기에 적절한 부피)로로드되도록 플런저를 우울하게하십시오.
- 피부 절개의 측면 가장자리를 당겨 버 구멍을 노출시키고, 마이크로 조작기를 사용하여 버 구멍에 바늘을 도입하여 경솔한 부분이 두개골 표면 바로 아래에 있도록하십시오.
- 바늘을 3mm 전진한 다음 바늘을 0.5 mm로 철수시켜 주입 공간을 만듭니다.
- 플런저를 30초 이상 천천히 전진한 다음 바늘이 뇌에 2분 더 남도록 합니다. 0.5 mm를 오르고 뇌에서 바늘을 제거하기 전에 추가 30 초를 기다렸다가 바늘을 점차적으로 철회하십시오.
- 스테레오전술 프레임에서 마우스를 제거하고 자동 클립으로 상처를 닫습니다.
- 체온을 유지하기 위해 워밍업 패드에 마우스를 배치하고 점막과 노출 된 조직 (발 바닥)의 호흡 패턴과 색상을 지속적으로 모니터링합니다.
- 마취(흉골 및 외래)에서 완전히 회복되면 마우스를 멸균 미세소화케이지에 넣고 동물 하우징 시설로 되돌게 됩니다.
5. 이식 후 동물 관리 및 관찰
참고: 종양 이식 및 침투 성장의 가장 신뢰할 수 있는 표시는 점진적, 구부러진 자세와 거친 머리 털의 발달을 동반 하는 지속적인 체중 감소. 드문 경우에, 신경 결핍은 운동 실조를 포함 하는 지적, paresis, 그리고 발작. 직교 1 차 적인 이종이이식은 높게 침략적이고 오랜 기간 동안 발전합니다. 마우스는 이식 후에 3-6 달 종양 성장의 현상을 전형적으로 명시합니다.
- 절개 부위의 음식과 물 섭취, 행동, 그루밍 및 감염 징후를 위해 매일 직교 성 이종이 접목을 가진 마우스를 관찰하십시오.
- 케토프로펜관리(5 mg/kg 피하, 하루 1-2배)를 투여하면 수술 후 통증이나 고민이 관찰됩니다.
- 수술 후 8-10일 후에 자동 클립을 제거합니다.
- 매주 쥐의 무게.
- 종양 이식의 징후와 증상을 모니터링합니다.
6. 종양 수확
참고: 이 방법에 의해, 제1 관상 슬라이스 (#1)는 후각 전구의 후방 측면과 전두엽의 전방 측면을 포함합니다. 이식된 종양은 후속 3개의 관상 동맥 조각(슬라이스 #2, #3 및 #4)의 오른쪽 반구에서 가장 풍부하며 주사 시력은 #3 코로나 슬라이스에 일상적으로 함유되어 있습니다. 실험적 필요에 따라, 물질은 종양 통로, 냉동 조직 섹션, 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 섹션, 해리 된 조직의 흐름 세포 측정, 세포 배양 또는 DNA, RNA 또는 단백질 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 종양의 부분은 80-95%의 세포 생존가능성으로 미래의 필요를 위해 냉동 보존될 수 있다.
- 이산화탄소에 장기간 노출되어 자궁 경부 탈구가 생쥐를 안락사시합니다.
- 더 큰 외과 가위를 가진 뇌의 기지에서 안락사 된 마우스 (foramen magnum 수준)를 참수하고 두개골을 완전히 노출하기 위해 절개에서 피부를 앞으로 당깁니다.
- 뇌를 제거합니다.
- 두개골의 왼쪽을 따라 목선 뼈를 잘라 왼쪽 외부 청각 고기의 수준에 foramen 매그넘의 측면 측면에 미세 수술 가위 한 쌍의 한 끝을 삽입합니다. 오른쪽에 동일한 컷을 수행합니다.
- 관상 동맥 평면을 따라 후두 뼈를 한 외부 청각 고기에서 다른 쪽으로 자르고 뼈를 제거하여 소뇌를 드러냅니다.
- 눈 사이에 비강 뼈 판을 잘라.
- 비강 뼈 판에서 bregma에 처진 봉합사를 따라 후방절단하여 처진 봉합사를 잘라. 람다에서 브레그마까지 전방으로 절단하여 궁합봉을 따라 중간선 절개를 완료합니다.
- 각 면의 처질 개구를 따라 미세한 쌍의 집게 끝을 조심스럽게 삽입하여 두개골의 두폐색을 뇌에 찢어낸 다음 두 개의 두개골반을 옆으로 껍질을 벗기고 뇌와 후각 전구를 뒤갈아 노출시합니다.
- 후각 전구의 복부 측면과 두개골 사이의 집게를 밀어 부착을 해제합니다.
- 두개골을 다시 기울여 뇌가 후퇴하여 광학 및 기타 두개골 신경이 노출되도록 합니다. 두개골 신경을 세서멸 PBS를 함유 한 접시에 뇌를 방출하십시오.
- 계량 주걱으로 뇌를 매트릭스 슬라이서로 옮기고 면도날로 2mm 관상 동맥 슬라이스를 생성합니다.
- 추가 육안 검사 및 추가 조직 처리를 위해 멸균 PBS를 포함하는 접시에 관상 슬라이스를 정렬합니다.
7. 종양 냉동 보존
- 냉동 보존 매체의 재고 용액을 준비합니다.
- 증식 보충제 50ml, 페니실린 100x 페니실린 및 연쇄절제술용액 5ml, 기저형 450ml에 0.2% 헤파린 450 μl을 추가합니다.
- 재고 용액을 빛으로부터 보호하여 4°C로 보관하십시오.
- 냉동 보존 매체의 작업 솔루션을 준비합니다.
- 47.5 ml의 냉동 보존 매체와 멸균 DMSO 2.5 ml를 50ml 폴리 프로필렌 원내 튜브에 결합하고 잘 섞어보십시오.
- 각 극저온에 대한 작업 용액 의 Aliquot 1.0 ml를 저장하고 빛으로부터 보호 4 ° C에 저장합니다.
- 이노그래프로 된 뇌의 2mm 관상 동맥 슬라이스를 얼음 위에 냉동 보존 매체가 함유된 극저온에 넣습니다.
- 유리병을 단단히 캡하고 -80 °C의 냉동 용기에 놓습니다. 냉동극을 액체 질소 탱크로 이송하여 더 오래 보관합니다.
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Representative Results
해리된 신경종 세포는 1 차적인 직교 이종 이식 선을 얻기 위하여 면역 손상한 마우스의 두뇌로 직접 이식됩니다. 각 종양 시편은 이식 전에 무작위 번호를 할당하고, 보호된 건강 정보를 제거하기 위한 탈부착 과정의 일부로 할당된다. 이를 위해 5자리 REDcap 데이터베이스 번호를 사용합니다. 도 1은 이소염 탈수소효소 1(IDH1) 돌연변이 아르기닌(132)을 히스티딘(R132H)으로 교모세포종(GBM 17182)으로부터 이종이이식 라인을 확립하기 위한 공정 및 명명율을 보여 준다. 이식 후 "X"는 종양 식별 번호에 첨가되어 xenografted 종양을 나타내고, 그 다음에는 통과 수를 추적하는 "P"가 뒤따릅니다. P0은 초기 이식 수령인을 지정하고 P1은 첫 번째 이종이식 통과의 수신자 마우스를 지정합니다. 전형적으로, 3-5 마우스는 선과 이종이 이식된 종양을 확립하기 위해 처음에 이식된 다음 10명의 수신자 마우스(P1)로 전달되어 향후 연구를 위한 선을 확장한다.
치열 교정 이식 다음, 받는 사람 마우스는 종양 이식 및 성장의 징후와 증상에 대 한 모니터링. 종양 이식의 가장 민감한 표시는 중요하고 지속적인 체중 감소입니다. 쥐는 젊은 나이에 이식, 수술 후 체중 증가 예상 된다. 마우스 무게는 주단위로 겉보기에 극적인 방식으로 변동할 수 있습니다, 그러나 3 g 보다는 더 큰 지속적인손실은 일반적으로 종양 이식의 좋은 표시입니다. 전형적으로, xenograft 코호트의 마우스의 대부분은 종양에 따라 60 일에서 350 일까지 에 이르는 유사한 기간 동안 체중 감소를 개발한다. 주어진 종양에 대한 중간 생존 시간은 일반적으로 동일한 수의 종양 세포가 매번 이식될 때 통로에서 통과까지 유사합니다. 도 2에 도시된 5마우스는 이전에 이식되고 한 번 이식되었던 GBM(17182XP2)으로 이식된 마우스 5개집단이다. 5개의 17182XP2 마우스의 4개는 이식 후에 17 주 상당한 체중 감소를 보여주었습니다. 나머지 마우스(mouse 3)는 체중 감소를 나타내지 않았고 사후 검사에서 종양이 발견되지 않았으며, 이는 수용자의 80%에서만 종양 이식을 나타낸다.
증상 마우스의 뇌를 수확할 때 뇌 슬라이서 매트릭스는 조직 처리를 위한 매우 귀중한 도구입니다. 각 뇌의 다중 해부학적으로 정의된 섹션의 생성은 조직의 다른 부분의 일부 및 냉동 보존을 통해 여러 가지 분석 모드를 허용합니다. 예를 들어, IDH1의 돌연변이 상태는 다른 한 부분 또는 면역 조직 화학물질로 Sanger 시퀀싱에 의해 평가될 수있다(도 3). 종양 이식은 관상 측면의 육안 검사에 의해 쉽게 명백할 수 있지만, 일부 이노이식(그림4 및 5)에대해 면역 조직화학을 가진 조직학이 필요할 수 있다. 직렬 통로 또는 기타 연구를 위해 이종이 이식을 해리할 때, 골린과 파편이 적절하게 제거될 수 있도록 물질의 작고 정의된 부분으로 시작하는 것이중요하다(도 6). 파팡 해리 시스템의 불연속 그라데이션은 성인 마우스 뇌의 작은 부분을 처리하는 데 가장 적합합니다. 각 코로날 섹션을 미드라인을 따라 절단하고 각 반쪽마다 두 개의 불연속 그라데이션을 사용하는 것이 좋습니다.
그림 1. 1 차적인 치열 교정 이종이 이식 선은 면역 손상마우스의 두뇌로 직접 해리된 신경교종 세포를 이식하고 연쇄 이식에 의해 확장해서 설치됩니다. IDH1 유전자의 아르기닌 132에서 이테로지구스 체세포 돌연변이는 확산 성구 세포종, 올리고드렌드로글리오마, 올리고아스트로시토마 및 이차 교모세포종의 70% 이상에서 발생하며, 1차 교모세포종의 7% 미만이다. GBM 17182는 가장 일반적인 IDH1 돌연변이, 아르기닌 132를 히스티딘(R132H)에 함유하고 있다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. GBM 17182XP1의 직렬 이식 수혜자의 성장 곡선은 5GBM 17182XP2 마우스 중 4에서 수술 후 130-150 일 상당한 체중 감소를 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 이테로지구우스, 체세포 IDH1 R132H 돌연변이 환자 종양(GBM 17182) 및 1차 이노이식(17182XP0)은 Sanger 시퀀싱 또는 항체 염색에 의해 검출될 수 있다. IDH1 R132H 특이적 항체를 사용한 면역히스토케는 혈관 주위또는 환자 표본 및 마우스 뇌의 더 확산침투 된 영역에서 조밀하게 클러스터된 돌연변이 신경교종 세포를 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 1차 직교 성 이종이이식은 헤마톡시린과 에오신(H & E)이 단독으로 염색하여 완전히 이해하기 어려울 수 있는 매우 침투적인 성장을 나타내고 있습니다. 인간 특이적 항체를 이용한 면역 조직 화학은 이식된 인간 세포를 식별하는 데 특히 유용한 방법입니다. 항성균 올리고성구세포종 제노이식(14175XP2)의 항인간 비멘틴 염색은 주입된 오른쪽 반구에서 확산 종양 질량을 가진 잠입성 신경종의 전형적인 특징을 보여줍니다. 코퍼스 캘로섬 (별표) 및 스트트리아토펠리달 섬유 (검은 화살촉) 및 렙토멘탈 보급 (검은 화살표)의 골수화 된 지역을 따라 침략적 인 성장. 이 배율에서 평가되지 않음 (1.25X) 마우스 뉴런 (복막 사텔리토증) 주위 인간의 종양 세포의 클러스터링은 침략 된 피질에서. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 항성균 올리고성지방세포종 14175XP2 코로나 섹션을 박스형 지역에서 A-C는 혈관(지역 A) 주위의 IDH 돌연변이 인간 세포를 나타내며, 스트라아토폴리달 지역("연필 섬유;" 지역 B) 및 코퍼스 캘로섬(C 지역)에서 확인할 수 있다. GBM 17182XP2와 마찬가지로, IDH1 R132H 아나플라스틱 올리고아스트로시토마 14175XP2의 염색은 IDH 돌연변이가 수신자 마우스의 연쇄 통로에 따라 1차 직교 식 제노이식에서 유지된다는 것을 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 인간 종양 세포는 크기에 따라 해리된 이종이이식에 있는 마우스 세포와 구별될 수 있습니다. 직렬 통로를 위한 해리된 이종이이식에서 인간 종양 세포를 정량화하기 위하여는, 인간 세포는 그들의 큰 크기와 어두운 녹색 발광 (arrowheads)에 의하여 빛 현미경 검사의 밑에 혈전계에서 확인됩니다. 유동 세포측정에 의하여, 인간 세포는 마우스 물질과 구별되는 산란 특성을 가지고 있으며 추가 분석을 위해 게이트될 수 있다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
배양 세포주, 이노이식 및 유전자 조작 마우스는 진모를 모델링하는 가장 일반적인 방법이며, 각 모델 시스템에 대한 뚜렷한 이점과 한계가있다 3,13,14. 1 차성 직립 성 신경종 xenografts의 관련 이득은 확산 교모를 대표하는 잠입 성장 및 유전 변경및 배양된 신경교종 세포에서 유지하기 가 극히 어려울 수 있는 중요한 신호 메커니즘의 보존을 포함합니다. 예를 들어, isocitrate 탈수소 효소 돌연변이 및 소닉 고슴도치 리간드 생산은 1차 직교 제노이식15,16에서 유지될 수 있지만 배양된 신경교종세포14,17-19에서는거의 유지되지 않는다. 그러나 실험적 필요에 따라 기본 치열 교정 이종이의 중요한 단점을 고려하는 것이 중요합니다. 적절한 환자 물질에 대한 액세스에도 불구하고, 이종화 부위보다 뇌의 시간이 지남에 따라 신경교종 성장을 측정하는 것이 더 어렵습니다. 추가적으로, 1 차 치열 교정 이종 이식은 이성애 이종이식보다는 현저하게 느린 속도로 증가합니다. 따라서 조사자는 중요한 조직학적 및 분자 특징이 또한4를유지될 수 있는 면역 손상마우스의 측면으로 세포를 이식하는 것을 선호할 수 있습니다.
1 차 적인 직교 이종이 이식을 설치하기 위한 2개의 중요한 고려 사항은 면역 손상마우스 수령인의 모형 및 신경교종 악성의 등급입니다. 우리는 아티믹 (nu-nu) 마우스에 있는 1 차적인 이종이식을 설치하는 것을 심각하게 제한했습니다 및 NOD/SCID 및 NSG(NOD/SCID/Interleukin-2 수용체 g암마 사슬 결핍) 마우스를 가진 동등하게 좋은 성공을 했습니다. NSG 마우스는 NOD/SCID 마우스20,21에비해 종양 생성 세포 및 긴 수명 증가의 이식 속도 때문에 바람직한 수신자이다. WHO 종양 등급에 관해서는, 우리는 학년 III와 IV 종양의 신경종 이식을 관찰했지만 I와 II 등급을 받지 는 않았습니다.
1차 직립성 신경교종 xenografts의 경우, 해리된 종양 세포는 면역절량된 마우스9 또는 종양 개시 세포의 뇌로 직접 이식될 수 있으며(예를 들어 CD133-발현 세포를 선택하여)이식(22). 세포의 어느 근원든지 우리의 경험에서 성공적인 종양 이식에 적합 합니다15,16,비록 CD133 농축 된 세포의 사용 더 많은 시작 물질을 필요로. 이식을 위해 정렬되거나 분류되지 않은 세포를 준비하든, 해리된 신경종 표본에서 골수린과 이물질을 적절히 제거하는 것이 중요합니다. myelin과 파편을 적절히 제거하지 못하면 서스펜션을 해밀턴 주사기로 끌어들이고 각 수령인에게 균일 한 수의 세포를 이식하는 기능을 현저하게 방해합니다. 파아플 해리에 따라, 골린과 이물질을 충분히 제거하는 데 필요한 불연속 그라데이션 튜브의 수를 결정하기 위해 혈종계를 사용하여 작은 알리쿼시를 평가하는 것이 도움이 된다. 완전한 제거는 가능하지 않지만, 미엘린 제거 전에 해리된 표본에서 세포를 정량화하는 어려움에 대한 감사를 얻을 수 있으며 불연속 그라데이션으로 제거 한 다음 상대적 용이성을 얻을 수 있습니다.
해리된 환자 표본으로부터 실행 가능한 세포의 수율은 매우 가변적일 수 있다. 최적으로,105 세포는 우리가 3,000의 세포/동물로 이식을 얻었더라도 5명의 수령마우스의 각으로 이식됩니다. 우리가 이식한 1 차악성 신경종 표본의 대략 반 (WHO 등급 III 및 IV) 초기 수령마우스의 40-100%에 이식했습니다. 치열 교정 이식 다음, 받는 사람 마우스매주 무게와 종양 이식 및 성장의 징후와 증상에 대 한 정기적으로 모니터링 해야 합니다. 1 차적인 치열 교정 이종이식은 확산, 침투 성장 및 중피 또는 발작과 같은 초점 신경 학적 증상을 드문 경우에만 관찰합니다. 종양 이식의 가장 민감한 표시는 구부러진 자세, 거친 머리 털 또는 돔 두개골의 발달을 동반할 수 있는 중요하고 지속적인 체중 감소입니다. 마우스가 지속적인 체중 감소를 개발하는 비율은 환자 표본에 따라 매우 가변적이며 60-350 일 범위일 수 있습니다. NSG 마우스는 전형적으로 이식시 18-25 g의 무게를 측정하고 수술 후 28-33 g의 성인 무게를 달성합니다. 침구 재료는 케이지 조건이 동물의 무게를 상당 부분 변경할 수 있기 때문에 정기적으로 변경되어야 합니다. 동물의 무게는 1 주일에서 다음 까지 그램만큼 변동할 수 있고, 이것이 종양 이식을 나타내는지 여부를 결정하는 것은 어려울 수 있습니다. 성인 체중을 달성한 NSG 마우스에서 종양 이식의 좋은 표시는 3 g 이상의 체중 감소를 지속한다. 이식된 마우스는 전형적으로 몇몇 주 기간에 걸쳐 측정될 수 있는 점진적인 체중 감소를 개발하더라도, 때때로 동물의 건강은 예를 들면, 또는 감염과 같은 관련없는 원인에서, 종양 성장 때문에 급속하게 감소할 수 있습니다.
안락사 에 이어, 종양 이식은 뇌의 총 검사에 의해 쉽게 명백하지 않을 수 있으며 조직학적 확인이 필수적입니다. 초기 종양 수신자의 경우, 각 뇌를 동일한 방식으로 처리하여 한 부분이 조직학적으로 평가되고 다른 부분은 이식이 확인되면 후속 종양 통과를 위해 냉동 보존됩니다. 위에서 설명한 바와 같이, 뇌는 전방축을 따라 뇌의 정의된 영역을 나타내는 각 슬라이스와 함께 2mm 관상 슬라이스를 생성하는 매트릭스 슬라이서에 배치된다. 정기적으로 주입 부위를 포함하는 코로나 슬라이스 #3 포르말린에 고정되어 있으며 나머지 조각은 각각 1 ml의 극저온 보존 매체를 포함하는 별도의 표지된 극저온에 배치됩니다. 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 슬라이드는 헤마톡시린과 에오신으로 염색되어 키67 및 인간 비멘틴에 대한 항체를 평가하여 이식된 세포를 시각화한다.
이식이 확인되면 종양이 통과될 수 있으며 이차 수혜자의 이식 비율은 80-100%에서 전형적으로 더 높습니다. 향후 연구를 위해 낮은 통로(2-5)에서 주어진 종양 라인을 유지하기 위해 적절한 저온 보존 물질이 생성될 수 있도록 더 많은 수의 수신자 마우스에서 처음으로 종양을 전달하는 것이 좋습니다. 주어진 종양에 대한 중간 생존 시간은 일반적으로 동일한 수의 종양 세포가 매번 이식될 때 통로에서 통과까지 유사합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 분자 신경 외과 조직 은행에 대한 귀중한 연구 자료를 제공 밴더빌트 대학 의료 센터에서 환자에게 특히 빚이있다. 티슈 뱅크, 리드 C. 톰슨 MD(수석 연구원), 체리 킨나드 RN(연구 간호사), 래리 A. 피어스 MS(매니저)를 설립하고 유지 관리하는 분들께 감사드립니다. 조직학적 서비스는 밴더빌트 대학 의료 센터 (VUMC) 번역 병리학 공유 자원 (밴더빌트 잉그램 암 센터에 수여 5P30 CA068485에 의해 지원)에 의해 부분적으로 수행되었다. 이 작품은 NINDS (1R21NS070139), 버로우스 웰컴 펀드 및 VMC 개발 기금의 MKC보조금에 의해 지원되었습니다. MKC는 재향 군인 사무부, 재향 군인 보건 행정, 연구 개발 사무소, 생물 의학 실험실 연구 및 개발 보조금 1 I01 BX000744-01에 의해 지원됩니다. 내용은 재향 군인 국무부 또는 미국 정부의 견해를 나타내지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A.
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
