Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

المجهر الضوئي الكمية: قياس الخلوية البيوفيزيائية الميزات مع مجهر بصري قياسي

Published: April 7, 2014 doi: 10.3791/50988
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 2Department of Dermatology, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 3Department of Cell & Developmental Biology, Division of Hematology & Medical Oncology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, School of Medicine

Abstract

وصفنا استخدام المجهر الضوئي القياسية لأداء القياسات الكمية من الكتلة والحجم، والكثافة على العينات الخلوية من خلال مزيج من حقل مشرق والتفضيلية تدخل على النقيض الصور. يتم عرض نهجين أساسيين: noninterferometric المرحلة الكمي المجهري (NIQPM)، لأداء القياسات من مجموع كتلة الخلية وتوزيع الكثافة التحت خلوية، وهيلبرت تحويل التدخل النقيض التفاضلية المجهري (HTDIC) لتحديد حجم. ويستند NIQPM على نموذج مبسط لانتشار الموجات، ووصف تقريب مجاور للمحور، مع ثلاثة الافتراضات الأساسية: منخفض الفتحة العددية (NA) الإضاءة، ضعيفة نثر، وامتصاص ضعيفة الضوء من العينة. لحسن الحظ، والعينات الخلوية غير ملوثين تلبية هذه الافتراضات ويتحقق انخفاض NA الإضاءة بسهولة على المجاهر التجارية. يستخدم HTDIC للحصول على معلومات الحجمي من صور مدينة دبي للإنترنت من خلال التركيز تحت عالية NA illuminشروط أوجه. NA إضاءة عالية تمكن تعزيز باجتزاء من العينة على طول المحور البصري. هيلبرت تحويل المعالجة على الصورة DIC مداخن بشكل كبير يعزز حافة خوارزميات الكشف عن توطين حدود العينة في ثلاثة أبعاد من خلال فصل القيم الرمادية من كثافة عينة من تلك الخلفية. المزايا الأساسية لNIQPM وHTDIC يكمن في الوصول التكنولوجية الخاصة بهم باستخدام المجاهر "قبالة الجاهزة للاستخدام". هناك نوعان من القيود الأساسية من هذه الأساليب: بطيئة ض المكدس اكتساب الوقت على نطاقات التجارية يلغي حاليا التحقيق في الظواهر أسرع من الإطار 1 / دقيقة، وثانيا، والآثار الحيود تقييد فائدة NIQPM وHTDIC إلى كائنات من 0.2 إلى 10 (NIQPM) و 20 (HTDIC) ميكرون في القطر، على التوالي. وبالتالي، يجب على عينة والوقت المرتبط به ديناميات الفائدة تلبية حجم معين والقيود الزمنية لتمكين استخدام هذه الأساليب. والمثير أن معظم cellula الثابتةيتم التحقيق العينات ص بسهولة مع هذه الطرق.

Introduction

استخدام المجهر الضوئي هو الآن في كل مكان في التحقيق في الكائنات الحية الخلوية. وترجع الزيادة إلى انخفاض الذاتية الامتصاصية وضعف نثر خصائص الطيف الضوئي على مدى مرئية، والخلايا لا تؤثر بشدة اتساع الموجات الضوئية التي تعبر منها، ويبدو شبه شفاف عندما التقط مع المجاهر حقل مشرق القياسية الآن. العينات الخلوية لا، ومع ذلك، وإبطاء موجات الضوئية السفر من خلالهم بطريقة يرتبط خطيا لكمية من كثافة الإعلام المحلية في منطقة معينة من الفضاء من خلالها الضوء يسافر. وكان أول وصف استخدام هذا الفارق الزمني غير متجانسة أو "مرحلة" لمحة من موجات الضوئية التي تنتقل عن طريق عينات مجهرية في عام 1935 من قبل فريتس Zernike 1 وأدركت تجريبيا بواسطة Zernikein 1942 2. منحت جائزة نوبل Zernike في عام 1953 لتحقيق هذا الإنجاز. زايس تجاريا هذه الطريقة في عام 1945 3. في عام 1955، سميث وNomarskوأود أن تقديم العمل الأولي على استخدام 4 و 5 من نظرية النقيض تدخل الفرق (DIC) المجهري، وهو أسلوب يستخدم التدرج المكاني للمرحلة كآلية التباين. تم تسويقها من قبل مدينة دبي للإنترنت زايس في 1965in بالتعاون الوثيق مع Nomarski 6. في عام 1981، أثبتت مختبرين سجلت أول الخلية الحية DIC الصور مع إدماج كاميرات الفيديو في القطار البصريات المجهر DIC 7، 8. ولدت في عصر التصوير الخلية الحية.

منذ هذا الوقت، وكان إعدام كل من النقيض المرحلة ومدينة دبي للإنترنت على المجاهر التجارية إلى حد كبير دون تغيير. وتستخدم هذه الطرق أساسا من قبل علماء الأحياء لإنتاج صور من الخلايا لأغراض النوعي: رصد التشكل، وتتبع هياكل التحت خلوية، والتحقيق في ديناميات غشاء 9. هذه التقنيات هي النوعية في التكوين الخاصة بهم "الجاهزة" على حد سواء المرحلة وDIالصور C هي وظائف التعسفي من شدة مصدر الضوء، وإعدادات البصريات والإضاءة، وكسب كاميرا CCD، غاما، وإعدادات التعرض.

وقد سعت والفيلق صغيرة من الفيزيائيين والمهندسين البصرية لجعل طرائق التصوير التجاري الكمي. بين الجهود الأولى كانت رسالتين إلى الطبيعة في عام 1952 و 1953 التي الطبيب الذي تحول إلى الفيزياء الحيوية روبرت تظاهر أكثر عريا استخدام المرحلة المجهر لتحديد كتلة جافة الخلوي للخلايا عن طريق تقدير مرحلة التحولات من خلال هذين النوعين من الخلايا باستخدام المجهر المرحلة المتاحة تجاريا 10، 11. وقد وضعت حقل العديد من التقنيات على مدى السنوات التي تلت ذلك القائمة حول ثلاث آليات النقيض خالية من التسمية الأساسية: مرحلة المجهر 10،11، مدينة دبي للإنترنت المجهر 12-17، وحقل مشرق 18-22 لتحديد مسار بصري طول، المرحلة، الشامل الكثافة، معامل الانكسار، وحجم الخلوية.

في الفقرةllel، كما تم تطوير مجموعة كبيرة من الأجهزة البصرية المخصصة منذ 1950s، وجعلت بعيدة المدى القياسات البصرية التي تتراوح بين التطبيقات في النمو الطفيلي 23، لتوثيق دورة الخلية 24 إلى التحقيق ديناميات غشاء خلايا الدم الحمراء 25. على وجه الخصوص، فقد شهدت السنوات العشر الماضية ثروة من التسمية خالية المجهر الكمي في شكل المرحلة حيود المجهري 26، تصوير الشعاعي الطبقي المرحلة المجهري 27، المجهر الرقمي المجسم 28، مرحلة حساسة التماسك البصري المجهري 29، المكاني تدخل ضوء المجهر 30، هيلبرت المرحلة المجهري 31، والكمية المرحلة المجهري 32. على الرغم من نجاحاتهم الجماعية، لم تنشر هذه الصكوك إلى الحقل أكبر من الباحثين البيولوجية بسبب، في الغالب، إلى الأجهزة الخاصة بهم المعقدة والمتطلبات الحاسوبية.

نحن هنا دescribe استخدام المجهر الضوئي القياسية لأداء القياسات الكمية للكتلة، وحجم، وكثافة على العينات الخلوية من خلال مزيج من حقل مشرق وصور مدينة دبي للإنترنت. يتم عرض نهجين أساسيين: noninterferometric المرحلة الكمي المجهري (NIQPM)، لأداء القياسات من مجموع كتلة الخلية وتوزيع الكثافة التحت خلوية، وهيلبرت تحويل التدخل النقيض التفاضلية المجهري (HTDIC)، لتحديد حجم. المزايا الأساسية لNIQPM وHTDIC يكمن في الوصول التكنولوجية. الشروط التصوير اللازمة لتنفيذها الناجحة هي ضمن نطاق العمل العادي لمعظم المجاهر متاحة تجاريا. بالإضافة إلى ذلك، خوارزميات مرحلة ما بعد المعالجة مستقرة، وسريعة، وقوية - بعد أن تم تنفيذها في MATLAB باستخدام تحويل فورييه السريع الخوارزميات (الاتحاد الفرنسي للتنس) استنادا كلما أمكن ذلك.

NIQPM هي طريقة لإعادة المرحلة وكثافة كتلة متكاملة محوريا من سلعينات من الصور lular حقل مشرق. محصلة هذه الكثافة كتلة متكاملة محوريا فوق منطقة العينة يعطي مجموع المحتوى الشامل الجافة للعينة. ويستند البروتوكول NIQPM على الأسس التجريبية التي وضعتها Paganin ونوجنت 18، 19 - الذي أثبت أن الملف الشخصى المرحلة من خلية يمكن بناؤها من الصور مجال مشرق من خلال تركيز العينة - والعمل النظري من فرانك ، Altmeyer، وفيرنيك 20 - على حل نماذج موجة مجاور للمحور بطريقة فعالة تستند الاتحاد الفرنسي للتنس. ويستند اتصال من مرحلة إلى كثافة الكتلة الجافة على العمل من قبل أكثر عريا 10 و 11 و 33 بوبيسكو.

يمكن الحصول على معلومات الحجمي من مدينة دبي للإنترنت من خلال صور عالية التركيز تحت ظروف الإضاءة NA التي تمكن باجتزاء البصرية من العينة على طول المحور البصري. هيلبرت تحويل المعالجة على مداخن صورة مدينة دبي للإنترنت يعزز إلى حد كبيرخوارزميات الكشف عن الحافة لتوطين حدود العينة في ثلاثة أبعاد من خلال فصل القيم الرمادية من كثافة عينة من تلك الخلفية. هذا العمل ينبع مع ​​Arinson وآخرون 34 على الرغم من أننا قد أدخلت كل من طرق تصفية فورييه لتعزيز التباين وحافة طريقة الكشف يستند سوبل للتحليل الحجمي الآلي من العينة. لدينا أيضا التحقق من صحة HTDIC سابقا على المجالات البوليسترين تتراوح في حجمها من الحد الحيود تصل إلى 20 ميكرون في القطر 36.

في حين أن كلا NIQPM وHTDIC يمكن الوصول إليها من الناحية التكنولوجية نظرا لتطورها على المجاهر التجارية، والأساليب تقتصر بشكل أساسي من تكوين الأجهزة من المجاهر أنفسهم. قيود الرئيسي من هذه التقنيات هي ذات شقين: بطيئة ض المكدس اكتساب الوقت على نطاقات التجارية، وذلك بسبب ترجمة المرحلة عينة بأكملها بدلا من مجرد عدسة الهدف، يحد حاليا التحقيق في الظواهر أسرع من ما يقرب من 1 الإطار / دقيقة، وثانيا، والآثار الحيود تقييد فائدة NIQPM وHTDIC إلى كائنات تتراوح في حجمها من 0.2 إلى 10 و 20 ميكرون في القطر، على التوالي. وبالتالي، فإن العينة وديناميات الوقت يرتبط به من الفائدة يجب أن تفي حجم معين والقيود الزمنية لتمكين استخدام هذه الأساليب على صكوك نموذجية "قبالة الجاهزة للاستخدام". والمثير أن يتم التحقيق في معظم العينات الخلوية الثابتة بسهولة مع هذه الطرق.

يتم إعطاء لمحة عامة عن NIQPM والبروتوكولات HTDIC في الشكل 1. في الشكل 2 نحن لتوضيح التصوير الأمثل والأمثل من خلال التركيز على حد سواء في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة والعالية على حد سواء NA حقل مشرق وصور مدينة دبي للإنترنت. أرقام 3 و 4 تدليل على الاعتماد المعلمة من الخوارزمية NIQPM تسليط الضوء على تطبيقات الناجحة وغير الناجحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المجهر المواصفات

لتنفيذ التصوير في الأزياء الصحيح ينبغي أن يكون المجهر المواصفات التالية:

  1. تمتلك كل من النقيض تدخل الفرق (DIC) وbrightfield (BF) التباين.
  2. لديها حركة ض محور الكمبيوتر التي تسيطر عليها.
  3. هل لديك توقف الفتحة قابل للتعديل لتغيير عدسة مكثف الفتحة العددية. مطلوب فتحة مع قاعدة متدرج أو قراءات الإلكترونية لمعرفة قيمة الفتحة العددية. الفتحة العددية ينبغي أن تتراوح بين 0.1 لتصل إلى 0.9 NIQPM (أو أعلى) لHTDIC.
  4. وينبغي أن يكون المجهر الضيقة مرشح الفرقة اللون لاستخدامها للتصوير حقل مشرق. مطلوب هذا الفلتر لإصلاح الزيادة الانكسار والتصدع التي تعتمد على الطول الموجي تستخدم لتحويل المرحلة إلى كثافة الكتلة لNIQP.

2. الفرق التدخل التباين (DIC) اقتناء Z-كومة

  1. فتح SlideBook البرمجيات والثانية إنشاء شريحة جديدة لجمع الصور.
  2. المقبل، فتح نافذة التركيز. تحت المقطع تصفية مجموعة، حدد مدينة دبي للإنترنت. على علامة التبويب نطاق، ضمن المقطع المكثف، وضبط شريط الانزلاق فتحة إلى أبعد الموقف الصحيح (فتح كل وسيلة). وهذا يوفر عالية العددية فتحة إضاءة ويعزز باجتزاء الضوئية للعينة.
  3. التركيز على عينة باستخدام الهدف DIC. ضبط كثافة مصابيح الهالوجين حتى هو عينة مرئية بسهولة. لضمان عدم المشبعة الكاميرا، حدد علامة التبويب كاميرا في نافذة التركيز والتحقق من أن الرسم البياني للكثافة بكسل ضمن مجموعة ديناميكية من الكاميرا.
  4. فتح نافذة التقاط الصور. في قسم التقاط نوع، حدد المربع 3D. في قسم التقاط 3D، وحدد المدى حول مركز والعودة إلى الموقع الحالي
  5. في المقطع تصفية مجموعة من نافذة التقاط الصور، والتحقق من مربع مدينة دبي للإنترنت، وتحديد مدة التعرض. في قسم معلومات الصورة، اسم الصورة (اختياري)، واختر بدء لبدء التصوير.

3. حقل مشرق (BF) اقتناء Z-كومة

  1. بمجرد الانتهاء من جمع المجهر DIC Z-كومة من العينة، وفتح نافذة التركيز وحدد فتح تحت المقطع تصفية مجموعة. ضبط شريط الانزلاق فتحة إلى أبعد الموضع الأيسر (مغلقة كل وسيلة) لتوفير الإضاءة المنخفضة NA.
  2. تغيير فلتر المجهر ضوء مسار إلى اللون الأخضر. ضبط كثافة مصابيح الهالوجين حتى هو عينة مرئية. ضمان عدم وجود تشبع الكاميرا عن طريق تحديد
  3. فتح نافذة التقاط الصور. سوف يتم عرض إعدادات التقاط 3D من اكتساب Z-كومة مدينة دبي للإنترنت.
  4. في المقطع تصفية مجموعة من نافذة التقاط الصور، والتحقق من المربع فتح وتحديد مدة التعرض. في قسم معلومات الصورة، اسم الصورة (اختياري)، واختر بدء لبدء الحصول على الصور Z-المكدس.

4. تصدير Z-كومة الصور

  1. فتح التقاط Z-المكدس. تغيير طريقة العرض إلى 100٪. ضبط الرسم البياني لقيم بكسل ليتم عرضها بين 0 و قيمة بكسل كحد أقصى للكاميرا (4،095 الكاميرات لمدة 12 بت، 16 بت ل65،535).
  2. اختر عرض> تصدير> سلسلة TIFF. وهذا تصدير Z-مكدس على شكل سلسلة من الصور TIFF(واحد لكل طائرة Z). حفظ سلسلة TIFF في مجلد منفصل مع اسم له تسطير في نهاية (أي "مدينة دبي للإنترنت المكدس 1_"). كرر هذا مع كل DIC أو BF Z-المكدس.

5. حجم القياسات

  1. فتح برنامج MATLAB HTDIC بعنوان "JoVE_HTDIC_v1.m".
  2. تحت القسم 0 برنامج HTDIC، تحديث متغير الدليل التبعيات. نسخ ولصق الدليل الذي يحتوي على الملفات وhilbert_transform_dic.m sobel_edge_detect.m من المستكشف (PC) في بين علامات الاقتباس المفردة التالية "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 برنامج JoVE_HTDIC_v1.m.
  3. في القسم 1، تحديث "images_directory". مرة أخرى، ونسخ ولصق الدليل الذي يحتوي على الصور من خلال التركيز في. شكل معرض طرابلس في بين علامات الاقتباس المفردة. فقط RUN القسم 1 مرة واحدة.
  4. المحاذاة وتناوب الصور لهيلبرت تحويل تشغيل القسم 2 من التعليمات البرمجية. سوف يظهر مربع حوار بعنوان "تعريف HTDIC معلمات" تظهر. خمسة numbeويطلب من المستخدم التمرير: عدد البؤري حيث الصورة DIC من العينة هو في التركيز، القرار الوحشي (ميكرون / بكسل في الصورة)، القرار المحوري (هذا هو 0.1 لالتقاط صور في 0.1 ميكرومتر الخطوات المحورية)، زاوية دوران الصورة DIC اللازمة لأداء هيلبرت تحويل والقيم النموذجية هي 45 و -135. أخيرا، يدخل المنطقة من حجم الفائدة، وتحدد هذه المعلمة طول الجانب من المربع الذي سيظهر لاحقا - هو القيمة النموذجية 400. انقر فوق موافق.
  5. وصورة من مدينة دبي للإنترنت البؤري المحدد من قبل عدد البؤري تظهر مع الصندوق الأزرق. ضع مربع عبر ميزة من الفائدة، مثل خلية. مربع لا يلزم أن يكون مربع. مرة واحدة وقد تم وضعه في مربع فوق المنطقة المطلوب، انقر مرتين داخل منطقة الجزاء.
  6. وشخصية أخرى تظهر الآن: يحتوي هذا الرقم على الصورة التي تم اقتصاصها واستدارة في المنطقة ذات الاهتمام المحدد في الخطوة السابقة. وينبغي أن يكون على النقيض من الصورة مثلالميزات التي تظهر داكنة على اليسار بينما تظهر ملامح مشرقة على اليمين. اسحب المربع الأزرق على المنطقة من الفائدة، وإعادة تشكيل الضرورة.
  7. القسم 3 يولد قناع لالمكعب ض المكدس. هناك نوعان من الأقنعة المتاحة: قناع مستطيل لإنشاء مستطيل حول الخلية وأداة اليد خالية من لمخطط خلية من الفائدة باليد.
  8. لإنشاء قناع مستطيل، خط حرر 167 و 170 تعليق الخط (خط التعليق من خلال وضع "٪" في بداية هذا السطر). تنفيذ المادة 3 من البرنامج. انقر في الصورة واسحب الماوس لبدء تحديد قناع مستطيل. انقر مرتين على مربع لقبول ذلك.
  9. لإنشاء قناع مرسومة باليد، تعليق خط 167 وخط 170 وتنفيذ حرر القسم 3. انقر ورسم القناع المطلوب مع الماوس. انقر مرتين على القناع لقبوله.
  10. القسم تشغيل 4to بناء هيلبرت تحول مدينة دبي للإنترنت صورة المكدس والمقابلة DIC صورة كومة من مجال الاهتمام.سيتم تطبيق قناع شيدت في القسم 3 إلى هيلبرت تحويل مدينة دبي للإنترنت وكومة كومة مدينة دبي للإنترنت العادية عند تعيين "maskON" إلى 1 في السطر 179. ووضع "maskON" ل0 بناء مداخن صورة دون تطبيق القناع.
  11. تشغيل القسم 5 لتحسين تجزئة صورة XZ عبر الصور المقطعية المنطقة من الفائدة. الرقم 500، التي تنتجها البرنامج، يظهر عرض ثلاثة أنواع مختلفة من التباين. نجاح خوارزمية لإيجاد حدود الخلية وتعتمد على مزيج من قناع المستخدمة وقيمة "العتبة" في سطر 229 من البرنامج. تبدأ بقيمة 0.5. ضبط قيمة العتبة وإعادة تشغيل هذا القسم من البرنامج حتى يتم تحقيق مخطط تفصيلي السليم في واحدة من الأعمدة.
  12. إذا كانت الخطوط العريضة أفضل في العمود 1، استخدم القسم 6 لتحديد حجم الصورة باستخدام DIC تجزئة. إذا العمود 2 أعطى أفضل النتائج، قم بتشغيل القسم 7 لتحديد حجم الخلية من صور مدينة دبي للإنترنت هيلبرت تحول. إذا العمود 3 غافه على أفضل النتائج، قم بتشغيل القسم 8 لتحديد حجم استخدام فورييه تصفيتها-هيلبرت تحول الصور، مدينة دبي للإنترنت.
  13. ويرد حجم يقاس من العينة، التي أعلن عنها في ميكرون مكعب (فلوريدا) في عنوان الشكل 600، 700، 800 أو ينتجها البرنامج اعتمادا على اختيار قياس مستوى الصوت.

6. القياسات الشامل

  1. فتح برنامج MATLAB NIQPM بعنوان "JoVE_NIQPM_v1.m".
  2. تحت القسم 0 برنامج NIQPM، وتحديث الموقع من ثلاثة الدلائل اللازمة لتشغيل البرنامج. هذه هي "dependencies_directory"، و "brightfield_directory"، و "dic_directory".
  3. المقبل، تشغيل الفرع 1. هذا القسم من التعليمات البرمجية يولد المجال مشرق صورة مكعب من حقل كامل من مجموعة كاملة من الصور. فقط RUN القسم 1 مرة واحدة.
  4. المقبل، تشغيل القسم 2. سوف يظهر مربع حوار بعنوان "تعريف NIQPM معلمات" تظهر. ويطلب أربعة أرقام من المستخدم: الرقم البؤري حيث الصورة حقل مشرق للعينة هو في التركيز، القرار الوحشي (ميكرون / بكسل في الصورة)، القرار المحوري (هذا هو 0.1 لالتقاط صور في 0.1 ميكرومتر الخطوات المحورية)، ومنطقة حجم الفائدة، وتحدد هذه المعلمة طول الجانب من المربع الذي سيظهر لاحقا - قيمة نموذجية هو 200. انقر فوق موافق.
  5. سوف صورة البؤري حقل مشرق المحدد من قبل عدد البؤري تظهر مع الصندوق الأزرق.
    1. إذا كانت الصورة ليست في التركيز، انقر مرتين في القسم باعادة 2 المربع الأزرق و، تأكد من ضبط عدد البؤري في مربع الحوار.
    2. إذا كانت الصورة هو في التركيز، اسحب مربع أزرق حول الصورة وتغيير حجمها عن طريق تحديد العقد من منطقة الجزاء، وسحبها عند الضرورة. وضع مربع حول ميزة من الفائدة، مثل خلية. مربع لا يلزم أن يكون مربع. انقر مرتين داخل منطقة الجزاء لقبوله.
  6. المقبل، تشغيل القسم 3 لبناء كومة من الصور الميدانية مشرق اقتصاص إلى منطقة فيterest.
  7. لتوليد خريطة المرحلة، مدينة دبي للإنترنت صورة الزائفة، ومقارنات لصور حقل مشرق وصورة مدينة دبي للإنترنت صحيح، قم بتشغيل القسم 4.
  8. مع الزائفة مدينة دبي للإنترنت ومدينة دبي للإنترنت الصور الحقيقية مماثلة قدر الإمكان خريطة كثافة الكتلة، الكتلة الكلية، والرسم البياني للكثافة الخلية يمكن تحديده من خلال تشغيل القسم 5A 5B أو. القسم 5A ينفذ الكشف الآلي الحدود من الميدان - الأمثل "العتبة" في سطر 300 - القيم النموذجية تختلف بين 0.1-1. أعد هذا القسم حسب الحاجة لتحسين قيمة العتبة. القسم 5B ينفذ تقرير الشامل، وما إلى ذلك بعد يحدد المستخدم الخلية من الفائدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الصحيح إضاءة العينة خلال الحصول على الصور من خلال التركيز أمر حاسم لنجاح تنفيذ NIQPM خوارزميات HTDIC الثانية. في الشكل 2 نحن لتوضيح المنخفضة والعالية على حد سواء تحت إضاءة NA مدينة دبي للإنترنت وعلى النقيض من حقل مشرق للكرة البوليسترين والقولون والمستقيم خط خلية غدية الإنسان SW620. أرقام 2A، 2C، 2I، و2K إثبات التصوير الأمثل لNIQPM. أرقام 2F، 2H، 2N، وإثبات 2P التصوير الأمثل لHTDIC.

أرقام 3 و 4 تدليل على الاعتماد المعلمة من الخوارزمية NIQPM تسليط الضوء على تطبيقات الناجحة وغير الناجحة على حد سواء. في الشكل 3 نستكشف الشخصى مرحلة من 4.8 ميكرون قطر البوليسترين المجال - ومن المعروف الشخصى المتوقع نظريا وبالتالي يمكن مقارنة مباشرة لإعادة إعمار NIQPM. الشكل 2L.

العينات الخلوية، والتي ليست معروفة مسبقا خصائص المرحلة، يمكن بناؤها باستخدام NIQPM بالتزامن مع إجراء لمقارنة "الزائفة مدينة دبي للإنترنت" صورة - حسابها من مرحلة أعيد بناؤها - لصورة مدينة دبي للإنترنت الفعلية، يتحدد من القياس البصرية المباشرة، للخلية. NIQPM ديه معلمة واحدة مجانا - الطائرة في مشرق صورة كومة الحقل الذي يتم توسيط حساب. ينبغي تعديل هذا المستوى البؤري المركزية حتى الزائفة مدينة دبي للإنترنت ومدينة دبي للإنترنت الصور الحقيقية مشابها قدر الإمكان. أرقام 4E-G إثبات وجود زائف خارج التركيز DIC الصورة، والصورة الزائفة الأمثل مدينة دبي للإنترنت، وcorrespondin ز مدينة دبي للإنترنت صورة الخلية اتخذت مع إضاءة NA 0.9. ومن المثير للاهتمام، وأفضل خريطة المرحلة والمقابلة الزائفة DIC الصورة لا تتطابق بالضرورة إلى التركيز في الصورة حقل مشرق، بمعنى. أرقام 1A و 1B.

أخيرا، يوضح الشكل (5) والخطوات المتبعة في الخوارزمية لمعالجة الصور HTDIC. من مدينة دبي للإنترنت من خلال الصور التركيز في إطار NA = 0.9 الإضاءة، أرقام 5A و 5D، ​​وهيلبرت تحويل وبريفورميد لإزالة نافر من الصور DIC، أرقام 5B و5E. هذا يأتي مع بعض الضبابية على طول المحور البصري التي يمكن إزالتها من تمريرة عالية فورييه الترشيح، وأرقام 5C 5F. وقد تم تقسيم هذه الصور النهائية بسهولة لتحديد منطقة في كل طائرة مقطعية من العينة للاستدلال على إجمالي حجم الخلوية.

her.within صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. NIQPM وHTDIC سير العمل. (1). عينات مجهرية مثل الخلايا يجب أن يتم تنظيمها على شرائح المجهر مع غطاء زجاجي الملصقة على العينة باستخدام Fluoromount G. (2) من خلال التركيز الصور المكتسبة في إطار كل من مدينة دبي للإنترنت وعلى النقيض من حقل مشرق مع معيار "خارج على الرف" المجهر تشكل مدخلات لخوارزميات معالجة الصور. (3) بعد تجهيز الصور في MATLAB لتحديد حجم الخلية من مدينة دبي للإنترنت وتوزيع الكتلة الخلوية من الصور الميدانية مشرق. (4) الكمي المقاييس نقطة النهاية: خرائط الحرارة والرسوم البيانية الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

igure 2 "FO: محتوى العرض =" 5IN "سرك =" / files/ftp_upload/50988/50988fig2highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الشكل 2. من خلال التركيز مدينة دبي للإنترنت وصور حقل مشرق من المجالات البوليسترين وخطوط الخلايا SW620. الشروط التصوير الأمثل لNIQPM هي النقيض حقل مشرق مع 0.1 NA الإضاءة. لHTDIC مدينة دبي للإنترنت، 0.9 NA الإضاءة هو الأمثل. (A، B) أون مواجهة الصور مجال مشرق من 4.8 ميكرون قطر البوليسترين المجال تخضع ل0.1 و 0.9 NA NA الإضاءة، على التوالي. (C، D) عبر قطاعات صور حقل مشرق من 4.8 ميكرون قطر البوليسترين المجال تخضع ل0.1 و 0.9 NA NA الإضاءة، على التوالي. (E، F) أون وجه مدينة دبي للإنترنت 4.8 ميكرومتر التصوير قطر البوليسترين المجال تخضع ل0.1 و 0.9 NA NA الإضاءة، على التوالي. (G، H) عبر قطاعات صور مدينة دبي للإنترنت 4.8 ميكرون قطر البوليسترين المجال قubject إلى 0.1 و 0.9 NA NA الإضاءة، على التوالي. (I، J) أون مواجهة الصور مجال مشرق من SW620 القولون والمستقيم خط الخلايا السرطانية عرضة لل0.1 و 0.9 NA الإضاءة، على التوالي. (K، L) عبر قطاعات صور حقل مشرق من SW620 الخلايا تخضع ل0.1 و 0.9 NA الإضاءة، على التوالي. (M، N) أون وجه DIC الصور من SW620 الخلايا تخضع ل0.1 و 0.9 NA NA الإضاءة، على التوالي. (O، P) عبر قطاعات صور مدينة دبي للإنترنت من SW620 الخلايا تخضع ل0.1 و 0.9 NA NA الإضاءة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. الأمثل والأمثل إعادة بناء المرحلة: 4.8 ميكرون قطر البوليسترين المجال يحقق كل صف الاعتماد البؤري للمشرق أون مواجهة شدة المجال (العمود الأول) والملف الشخصى المرحلة أعيد بناؤها كما يبدأ البؤري في منتصف طريق المجال، ض = 0 ، ويتحرك الماضي هذه الطائرة في 1 ميكرومتر الخطوات. (A، E، I، M) E ن مواجهة شدة المجال مشرق، (B، F، J، N) الموافق إعادة الإعمار المرحلة، (C، G، K، O) مقارنة الشخصى المرحلة أعيد بناؤها على طول قطري للمرحلة الخريطة، الدوائر الزرقاء، لمحة النظرية المرحلة، باللون الأحمر، والخطأ التسامح الشركة المصنعة، وخطوط سوداء، و(D، H، L، P) في المائة (٪) من الخطأ ع أعيد بناؤهاهاسي فيما يتعلق الشخصى المرحلة النظرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. الأمثل والأمثل إعادة بناء المرحلة: خلية SW620 عمودين مقارنة طائرات صورة حقل مشرق الأمثل والأمثل (A، B) من ض المكدس لتوسيط حساب المرحلة. يتم استخدام إعادة البناء مرحلة المقابلة (C، D) لإنشاء مدينة دبي للإنترنت الزائفة صورة (E، F). تتم مقارنة هذه الصورة لمدينة دبي للإنترنت صحيحا، NA = 0.9 الإضاءة، في (G). الزائفة مدينة دبي للإنترنت أفضل صورة مطابقة للصورة مدينة دبي للإنترنت يحدد الصور الإدخال الصحيح من حقل مشرق معهد العالم العربيجنرال الكتريك مكدس لاستخدامها في إعادة الإعمار المرحلة. أخيرا، يتم تعيين المرحلة لكثافة الكتلة المتوقعة (H، I). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. مدينة دبي للإنترنت تعزيز النقيض الأمثل باستخدام HTDIC: مجالات البوليسترين وخلية SW620. (A) مستعرضة صور مدينة دبي للإنترنت لكرة 4.8 البوليسترين، (ب) المقابلة صورة HTDIC، (C) فورييه تصفيتها الصورة HTDIC. تم تحجيم البعد المحوري من الصور المجال لحساب مؤشر الانكسار من عدم تطابق العينة (1.597) وسائل الاعلام تركيب (1.4). (DF) شرح أنواع الصور نفسها لخلية SW620، ومع ذلك، مع عدم وجود ط الانكسارتصحيح عدم تطابق ndex نظرا لضعف مؤشر على النقيض من العينة. ولم يتم إجراء أية مستوى العتبة على هذه الصور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بشكل عام، NIQPM هي تقنية محدودة الحيود على التحقق من صحة مسار بصري أطوال تتراوح ،25-44،7. تم إجراء التحقق من الصحة على ن = 1.596 المجالات البوليسترين تتراوح في القطر ،11-9،8 ميكرون معلقة في Fluoromount G (لا تظهر البيانات). تمتلك الخلايا الضوئية أطوال الطريق التي تتراوح بين ما يقرب من 0-7.

عند قياس توزيع كثافة عينة واحدة قد تجد أن الصورة الزائفة مدينة دبي للإنترنت تبدو على ما يرام في حين أن خريطة الكثافة تمتلك مساهمات الخلفية غير المرغوب فيها. ومن المقرر أن الضوضاء في الصور مجال مشرق من العينة تستخدم كمدخل لخوارزمية NIQPM هذا. اثنين التعديلات المحتملة على طريقة NIQPM يمكن استخدامها للقضاء على المساهمات الخلفية غير المرغوب فيها: أولا، يمكن للمرء استخدام مرات التعرض أطول لتعزيز إشارة إلى الضجيج في الصور الحقل مشرق. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا عندما التصوير العينات رقيقة بصريا. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يقلل من التباعد المحوري للacquisit ض المكدسأيون ،1-0،05 ميكرون ومتوسط ​​2-3 طائرات معا قبل إدخال لهم في خوارزمية NIQPM.

تم التحقق من صحة تقرير حجم HTDIC على أساس المجالات البوليسترين تتراوح في القطر 1-20 ميكرون وتم التحقق من صحة الصليب مع متحد البؤر المجهري مضان 35. تقنية يغالي في حجم الكائنات أقل من الحد حيود النظام بسبب تأثيرات الحيود المرتبطة بالوظيفة انتشار نقطة البصريات.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها تحديد حجم HTDIC ربما المطلوبة لعينات صغيرة أو رقيقة. المصدر الرئيسي للالخطأ يأتي من تجزئة الصورة باستخدام الكشف عن الحافة المدمج في MATLAB سوبل المستندة المستخدمة لتحديد حدود الخلية في الصور المقطعية. قيمة "العتبة" في القسم 4 من برنامج HTDIC أمر حاسم في الحصول على أفضل تجزئة. النتائج تميل إلى التفاوت بطريقة غير الخطية - مع تغييرات صغيرة في "عتبة" drasticallذ تغيير المنطقة المغلقة الناجم عن الكشف عن الحافة. يعرض البرنامج الحالي للمستخدم مع خيارات لتنفيذ تجزئة الصورة إما من مدينة دبي للإنترنت ض المكدس، وHTDIC ض المكدس، أو F-HTDIC ض المكدس.

مدينة دبي للإنترنت وحدها غالبا ما يكون أفضل لعينات كبيرة حين HTDIC والعمل F-HTDIC لعينات أصغر (<5 ميكرون في القطر).

قناع يمكن أن تعزز قدرة طريقة لشريحة الصورة. القسم 2 يسمح للمستخدم لتحديد قناع لتطبيقه على صورة مكعب. نوصي استخدام قناع مستطيل باقتطاع أفقي (س مدى) من المكعب مع الحفاظ على العمودي (ص مدى) من المكعب.

باختصار، NIQPM وHTDIC هي طرائق التصوير الكمي الوصول إليها من الناحية التكنولوجية التي يمكن القيام بها على مستوى "الجاهزة" المجاهر البصرية، وعلى النقيض من معظم الطرق القائمة. المركزية لهذه التقنيات هي الصور من خلال تركيز العينة تحت APPRظروف التصوير opriate: إضاءة منخفضة NA لNIQPM، وإضاءة عالية NA لHTDIC. الأساليب المقدمة هنا يمكن تعميمها للاستخدام على أنظمة أخرى غير تلك تظاهر هنا. المعايير الأساسية المطلوبة لهذه الإجراءات هو المجهر الذي كان المستخدم لديه سيطرة على ض حركة المسرح والقدرة على الحصول على صور لأن الموقف البؤري للعدسة الهدف هو متنوعة. الأساليب المقدمة هي مناسبة لتصوير خلايا ثابتة أو تتحرك ببطء العينات البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم مصالح مالية في العمل المقدم.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (U54CA143906 لKGP، OJTM وR01HL101972 لOJTM) ومؤسسة أبحاث أوريغون الطبية جائزة الباحث السريرية المبكرة (KGP). OJTM هو محقق جمعية القلب الأمريكية تأسست (13EIA12630000). نشكر الدكتور اريك اندرسون من معهد السرطان فارس لإعداد عينات الخلايا المستخدمة في هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany Axio Imager D2 Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm) Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont D540/25x Green filter
SlideBook 5.5 software Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado Image acquistion software
Polystyrene microspheres Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN PS06N Polystyrene spheres
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, Alabama 0100-01 Mounting media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
  2. Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
  3. Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
  4. Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
  5. Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
  6. Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
  7. Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
  8. Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
  9. Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
  10. Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
  11. Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
  12. Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
  13. Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
  14. Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
  15. Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
  16. Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
  17. Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
  18. Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
  19. Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
  20. Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
  21. Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
  22. Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
  23. Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
  24. Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
  25. Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
  26. Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
  27. Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  28. Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
  29. Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
  30. Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
  31. Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
  32. Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
  33. Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
  34. Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
  35. Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 86، والبصريات خالية من التسمية، المجهري الكمي، الفيزياء الحيوية الخلوية، كتلة الخلايا، حجم الخلية، كثافة الخلية
المجهر الضوئي الكمية: قياس الخلوية البيوفيزيائية الميزات مع مجهر بصري قياسي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S.… More

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S. M., McCarty, O. J. T. Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope. J. Vis. Exp. (86), e50988, doi:10.3791/50988 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter