Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop

Published: April 7, 2014 doi: 10.3791/50988
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 2Department of Dermatology, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 3Department of Cell & Developmental Biology, Division of Hematology & Medical Oncology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, School of Medicine

Abstract

We beschrijven het gebruik van een standaard optische microscoop kwantitatieve metingen van gewicht, volume en dichtheid op cellulaire monsters uitgevoerd door een combinatie van helderveld en differentieel interferentie contrast beelden. Twee primaire benaderingen worden gepresenteerd: noninterferometric kwantitatieve fase microscopie (NIQPM), op de metingen van de totale celmassa en subcellulaire distributie dichtheid te voeren, en Hilbert transformeren differentieel interferentie contrast microscopie (HTDIC) om het volume te bepalen. NIQPM is gebaseerd op een vereenvoudigd model van de voortplanting van golven, aangeduid als de paraxiale benadering, met drie onderliggende veronderstellingen: lage numerieke apertuur (NA) verlichting, zwak verstrooiing, en zwakke absorptie van licht door het monster. Gelukkig unstained cellulaire monsters aan deze veronderstellingen en lage NA verlichting is gemakkelijk te bereiken op de commerciële microscopen. HTDIC wordt gebruikt om volumetrische informatie te verkrijgen van door-focus DIC beelden onder hoge NA illuminatie voorwaarden. Hoge NA-verlichting kunnen verbeterde opdeling van het monster langs de optische as. Hilbert transformatie proces op de afbeelding DIC stapels verbetert randdetectie algoritmen voor het lokaliseren van het monster grenzen in drie dimensies door het scheiden van de grijswaarden van het monster intensiteit van die van de achtergrond. De belangrijkste voordelen van NIQPM en HTDIC lag in hun technologische toegankelijkheid met "off-the-shelf" microscopen. Er zijn twee fundamentele beperkingen van deze methoden: slow z-stack overname tijd op commerciële scopes heft momenteel het onderzoek naar verschijnselen sneller dan 1 frame / minuut, en ten tweede, diffractie effecten beperken het nut van NIQPM en HTDIC om objecten van 0,2 tot 10 (NIQPM) en 20 (HTDIC) micrometer in doorsnede, respectievelijk. Daarom moet het model en de bijbehorende tijdsdynamiek plaats aan bepaalde grootte en temporele beperkingen op het gebruik van deze werkwijzen mogelijk. Opwindend, de meeste vaste cellular exemplaren worden gemakkelijk onderzocht met deze methoden.

Introduction

Het gebruik van optische microscopie is nu alomtegenwoordig in het onderzoek naar de cellulaire organismen. Door hun lage endogene absorptie en verstrooiing zwakke eigenschappen over het zichtbare optische spectrum, worden cellen niet sterk beïnvloeden de amplitude van de optische golven te doorkruisen en lijken derhalve semi wanneer afgebeeld met standaard helderveld microscopen. Cellulaire specimens Wel vertragen optische golven reizen door hen op een wijze die recht evenredig is met de hoeveelheid lokale massadichtheid in een bepaald gebied van de ruimte waardoor het licht reist. Benutting van deze heterogene vertraging of "fase" profiel van optische golven die via microscopische preparaten werd voor het eerst beschreven in 1935 door Frits Zernike 1 en experimenteel gerealiseerd door Zernikein 1942 2. Zernike werd bekroond met de Nobelprijs in 1953 voor deze prestatie. Zeiss gecommercialiseerd deze modaliteit in 1945 3. In 1955, Smith en NomarskIk zou hun eerste werkzaamheden op het gebruik 4 en theorie 5 van differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie is een modaliteit die de ruimtelijke gradiënt van fase gebruikt als contrast mechanisme presenteren. DIC werd gecommercialiseerd door Zeiss in 1965in nauwe samenwerking met Nomarski 6. In 1981, twee laboratoria aangetoond dat de eerste geregistreerde levende cellen DIC beeldspraak met de opname van video-camera's in de optiek trein van de DIC microscoop 7, 8. Het tijdperk van live cell imaging werd geboren.

Sinds die tijd heeft de uitvoering van zowel fase-contrast-en DIC op commerciële microscopen grotendeels ongewijzigd geweest. Deze methoden worden voornamelijk gebruikt door biologen om beelden van cellen te produceren voor de kwalitatieve doelen: monitoring van de morfologie, het volgen van subcellulaire structuren, en onderzoeken van membraan dynamica 9. Deze technieken zijn kwalitatief van hun "off-the-shelf" configuratie zowel fase en DIC afbeeldingen zijn willekeurig functies van de lichtbron intensiteit, de verlichting optiek instellingen, en CCD-camera te krijgen, gamma, en belichtingsinstellingen.

Een klein legioen van fysici en optische ingenieurs heeft getracht om commerciële beeldvormende modaliteiten kwantitatieve maken. Een van de eerste pogingen waren twee brieven aan de natuur in 1952 en 1953, waarin de arts-draaien-biofysicus Robert Naakter aangetoond dat het gebruik van fase microscopie om cellulaire droge massa van cellen te bepalen door een schatting fase verschuivingen door middel van deze celtypen met een algemeen verkrijgbare fase microscoop 10, 11. Fase microscopie 10,11, DIC microscopie 12-17, en helder veld 18-22 optische weglengte, fase, de massa te bepalen: Het veld heeft een veelheid aan technieken in de daaropvolgende jaren gebaseerd op drie basis-label-free contrast mechanismen ontwikkeld dichtheid, brekingsindex en celvolume.

In parallel, een grote collectie aangepaste optische instrumenten zijn ook ontwikkeld sinds de jaren 1950, en hebben vergaande optische metingen, variërend van toepassingen in parasiet groei 23, aan het documenteren van de celcyclus 24 te onderzoeken membraan dynamiek van rode bloedcellen 25 gemaakt. In het bijzonder, heeft de afgelopen tien jaar een schat aan label-free kwantitatieve microscopie zien in de vorm van diffractie fase microscopie 26, tomografische fase microscopie 27 digitale holografische microscopie 28, fase gevoelige optische coherentie microscopie 29, ruimtelijke licht interferentiemicroscopie 30, Hilbert fase microscopie 31 en kwantitatieve fase microscopie 32. Ondanks hun gezamenlijke successen, zijn deze instrumenten niet verspreid naar het grotere gebied van biologische onderzoekers gevolg, meestal, hun complexe instrumentatie en computationele vereisten.

Hierin we drenderen het gebruik van een standaard optische microscoop kwantitatieve metingen van gewicht, volume en dichtheid op cellulaire monsters uitgevoerd door een combinatie van helderveld en DIC beelden. Twee primaire benaderingen worden gepresenteerd: noninterferometric kwantitatieve fase microscopie (NIQPM), op de metingen van de totale celmassa en subcellulaire distributie dichtheid te voeren, en Hilbert transformeren differentieel interferentie contrast microscopie (HTDIC), om het volume te bepalen. De belangrijkste voordelen van NIQPM en HTDIC lag in hun technologische toegankelijkheid. De beeldvormende voorwaarden voor de succesvolle uitvoering binnen het bereik van de normale werking van de meeste commercieel beschikbare microscopen. Daarnaast is de post-processing algoritmes zijn stabiel, snel en robuust - hebben in MATLAB geïmplementeerd met behulp van snelle Fourier-transformatie (FFT) gebaseerde algoritmen waar mogelijk.

NIQPM is een methode om fase en de axiaal geïntegreerde massadichtheid van cel reconstruerenlaire exemplaren uit helder veld beeldspraak. Sommatie van deze axiaal geïntegreerd massadichtheid over het gebied van het model geeft de totale droge massa gehalte van het monster. De NIQPM protocol is gebaseerd op de fundamenten van Paganin en Nugent 18, 19 experimentele basis - waarbij werd aangetoond dat de fase profiel van een cel kan worden gereconstrueerd door-focus helderveld beeld van het monster - en theoretisch werk van Frank , Altmeyer en Wernicke 20 - op het oplossen van de asparallelle golfmodellen op een efficiënte FFT-gebaseerde manier. De aansluiting van fase naar de droge massa dichtheid is gebaseerd op het werk van Barer 10, 11 en Popescu 33.

Volumetrische informatie kan worden verkregen bij door-focus DIC beelden onder hoge NA verlichting omstandigheden die optische sectie van het monster staat langs de optische as. Hilbert transformatie proces op het DIC afbeelding stapels vergrootranddetectie algoritmen voor het lokaliseren van het monster grenzen in drie dimensies door het scheiden van de grijswaarden van het monster intensiteit van die van de achtergrond. Dit werk is afkomstig van Arinson et al.. 34 hoewel we beiden Fourierfiltering methoden geïntroduceerd om contrast en een Sobel-gebaseerde Edge-detectiemethode voor geautomatiseerde volumetrische analyse van het monster te verbeteren. We hebben ook eerder gevalideerde HTDIC op polystyreen bolletjes variërend in grootte van de diffractie limiet tot 20 urn diameter 36.

Terwijl zowel NIQPM en HTDIC technologisch toegankelijk vanwege hun ontwikkeling op commerciële microscopen, worden de methoden fundamenteel beperkt door de hardware configuratie van de microscopen zelf. De belangrijkste beperkingen van deze technieken zijn tweeledig: slow z-stack overname tijd op commerciële scopes, als gevolg van de vertaling van het gehele monster etappe in tegenstelling tot enkel het objectief, Beperkt momenteel onderzoek verschijnselen sneller dan ongeveer 1 frame / minuut en tweede diffractie effecten beperken de bruikbaarheid van NIQPM en HTDIC voorwerpen variërend in grootte van 0,2 tot 10 en 20 micrometer in doorsnede, respectievelijk. Daarom moet het model en de bijbehorende tijdsdynamiek plaats aan bepaalde grootte en temporele beperkingen op het gebruik van deze methoden op typische "off-the-shelf" instrumenten mogelijk. Opwindend, zijn de meeste vaste cellulaire exemplaren gemakkelijk onderzocht met deze methoden.

Een overzicht van de NIQPM en HTDIC protocollen zijn aangegeven in figuur 1. In figuur 2 illustreren we optimale en suboptimale door-focus beeldvorming onder zowel lage als hoge NA verlichting voorwaarden voor zowel helderveld en DIC beelden. Figuren 3 en 4 tonen de parameter-afhankelijkheid van de NIQPM algoritme markeren geslaagde en mislukte implementaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Microscoop Specificaties

Om beeldvorming uit te voeren op de juiste wijze de microscoop moet aan de volgende specificaties:

  1. Bezitten zowel differentieel interferentie contrast (DIC) en helderveld (BF) contrast.
  2. Laat computergestuurde z-as beweging.
  3. Hebben een verstelbare opening halte naar de condensor lens numerieke lensopening te variëren. Een opening met een gegradeerde regel of elektronische uitlezing moet de waarde van de numerieke apertuur kennen. De numerieke apertuur uiteen van 0,1 tot NIQPM tot 0.9 (of hoger) voor HTDIC.
  4. De microscoop moet een smalle band kleur filter moet worden gebruikt voor helderveld beeldvorming. Dit filter is vereist om de refractie-increment, een golflengte-afhankelijke facture gebruikt om fase omzetten massadichtheid voor NIQP vast.

2. Differentieel Interferentie Contrast (DIC) Z-stack Acquisitie

  1. Open de SlideBook software eennd een nieuwe dia voor het verzamelen.
  2. Open vervolgens de Focus Window. Selecteer DIC onder de sectie Filter Set. Op het tabblad Bereik in de sectie condensor, past de schuifbalk Aperture naar de verste juiste positie (helemaal open). Dit zorgt voor een hoge numerieke apertuur verlichting en verbetert de optische sectie van het monster.
  3. Focus op het monster met behulp van een DIC doelstelling. Stel de halogeenlamp intensiteit totdat het monster goed zichtbaar. Om ervoor te zorgen de camera niet wordt verzadigd is, selecteert u het tabblad Camera in de Focus Venster en controleer of het histogram van pixel intensiteiten binnen het dynamische bereik van de camera.
  4. Open het venster Fotolader. In de sectie Capture type, controleert u de 3D-box. In de sectie 3D Capture, selecteer het bereik rond centrum en terugkeren naar de huidige locatie
  5. In de sectie Filter Set van het venster Fotolader, vinkt u het vakje DIC en geef belichtingstijd. In de sectie beeldinformatie, de naam van de afbeelding (optioneel), en selecteer Start om de beeldvorming te starten.

3. Bright Field (BF) Z-stack Acquisitie

  1. Zodra de microscoop klaar is met het verzamelen van de DIC Z-stack van het monster, opent de Focus Venster en selecteer Open in het gedeelte Filter Set. Pas de schuifbalk Aperture naar de verste linker positie (helemaal gesloten) naar laag NA verlichting te bieden.
  2. Wijzig de microscoop lichtpad filter naar groen. Stel de halogeenlamp intensiteit totdat het monster zichtbaar. Zorg dat er geen verzadiging van de camera door de optie
  3. Open het venster Fotolader. De 3D Capture instellingen uit de DIC Z-stack overname wordt weergegeven.
  4. In de sectie Filter Set van het venster Fotolader, vinkt u het vakje te openen en belichtingstijd. In de sectie beeldinformatie, de naam van de afbeelding (optioneel), en selecteer Start om Z-stack beeldverwerving initiëren.

4. Exporteren Z-stack Afbeeldingen

  1. Open een Z-stack capture. De weergave 100%. Stel het histogram van de pixelwaarden te geven tussen 0 en de maximale pixelwaarde van de camera (4095 voor 12 bits camera 65.535 16 bits.).
  2. Selecteer Weergave> Exporteer> TIFF Series. Dit zal de Z-stack exporteren als een reeks TIFF-afbeeldingen(Een voor elke Z vlak). Sla het TIFF-serie in een aparte map met een naam die een underscore aan het eind (dwz "DIC Stack 1_") heeft. Herhaal dit met elke DIC of BF Z-stack.

5. Volume Metingen

  1. Open het HTDIC MATLAB programma met de titel "JoVE_HTDIC_v1.m".
  2. Op grond van artikel 0 van het HTDIC programma, het actualiseren van de afhankelijkheden directory variabele. Kopieer en plak de map met de hilbert_transform_dic.m en sobel_edge_detect.m bestanden van explorer (PC) in tussen de enkele aanhalingstekens volgende "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 van het JoVE_HTDIC_v1.m programma.
  3. In paragraaf 1, het actualiseren van de "images_directory". Nogmaals, kopieer en plak de map met de door-focus afbeeldingen in. Tif vorm tussen de enkele aanhalingstekens. Alleen loopt DEEL 1 ONCE.
  4. Uitlijning en rotatie van beelden voor Hilberttransformatie Run afdeling 2 van de code. Er verschijnt een dialoogvenster met de titel "Definieer HTDIC parameters" verschijnt. Vijf numbers zijn vereist van de gebruiker: het brandvlak nummer waar het DIC beeld van het monster in focus, laterale resolutie (micrometer / pixel in het beeld), de axiale resolutie (dit is 0,1 voor het acquisitie in 0,1 micrometer axiale stappen), de draaihoek van het imago van de DIC nodig om te presteren de Hilbert transformatie, typische waarden zijn 45 en -135. Ten slotte voert de regio van belang de grootte, deze parameter bepaalt de lengte van een zijde van een doos die later zal verschijnen - typische waarde is 400. Klik op Ok.
  5. Een beeld van de DIC focal plane door de focal plane nummer zal verschijnen met een blauwe doos. Plaats de doos over de functie van belang zijn, bijvoorbeeld een cel. De box hoeft niet vierkant. Zodra de doos is gepositioneerd boven de gewenste regio, dubbelklik binnen het strafschopgebied.
  6. Een ander cijfer zal nu verschijnen: een bijgesneden en geroteerd beeld van de regio geselecteerd in de vorige stap belang dit cijfer bevat. Het contrast van het beeld moet zodanig zijndie donkere functies verschijnen links terwijl heldere functies verschijnen aan de rechterkant. Sleep het blauwe vak over de regio van belang, opnieuw vorm te geven als dat nodig is.
  7. Paragraaf 3 genereert een masker voor de z-stack kubus. Er zijn twee soorten maskers beschikbaar: een rechthoekig masker een rechthoek rond de cel en een vrije hand hulpmiddel om de cel van belang overzicht handmatig maken.
  8. Om een ​​rechthoekig masker, uncomment lijn 167 en commentaar lijn 170 (commentaar van een lijn door het plaatsen van een "%" aan het begin van die lijn) te genereren. Uitvoeren hoofdstuk 3 van het programma. Klik in de afbeelding en sleep de muis om te beginnen met het definiëren van de rechthoekige masker. Dubbelklik op het vakje om het te accepteren.
  9. Om een ​​hand-drawn masker, commentaar lijn 167 en lijn 170 uncomment genereren en uitvoeren van sectie 3. Klik en teken de gewenste masker met de muis. Dubbelklik op het masker om het te accepteren.
  10. Run Sectie 4to construeren de Hilbert getransformeerd DIC afbeelding stapel en de bijbehorende DIC afbeelding stapel van het gebied van belang.Het masker gebouwd in hoofdstuk 3 zal worden toegepast op de hilberttransformatie DIC stack en de reguliere DIC stack wanneer "maskON" is ingesteld op 1 op lijn 179. Instelling "maskON" naar 0 zal image stacks bouwen zonder toepassing van het masker.
  11. Run Afdeling 5 om het beeld segmentatie van de xz dwarsdoorsneden van het gebied van belang te optimaliseren. Figuur 500, die door het programma verschijnt met drie verschillende soorten contrast. Het succes van het algoritme om de randen van de cel voorbeeld afhankelijk van een combinatie van de gebruikte masker en de waarde "drempel" op regel 229 van het programma. Begin met een waarde van 0,5. Stel de waarde van de drempel en herhaald dit deel van het programma tot de juiste schetsen bereikt in een van de kolommen.
  12. Als het schetsen was beste in kolom 1, gebruiken Hoofdstuk 6 om het volume te bepalen met behulp van DIC afbeelding segmentatie. Als kolom 2 gaf een optimaal resultaat, lopen hoofdstuk 7 naar cel volume van Hilbert-getransformeerde DIC beelden bepalen. Als kolom 3 gave optimale resultaten, rennen sectie 8 volume bepalen met behulp van Fourier-gefilterde Hilbert-getransformeerd DIC beelden.
  13. De afgemeten hoeveelheid van het monster, gerapporteerd in kubieke urn (fl) wordt gepresenteerd in de titel van fig. 600, 700 of 800 door het programma afhankelijk van volumemeting gekozen.

6. Massa Metingen

  1. Open het NIQPM MATLAB programma met de titel "JoVE_NIQPM_v1.m".
  2. Op grond van artikel 0 van het NIQPM programma, het actualiseren van de locatie van drie mappen die nodig zijn om het programma uit te voeren. Dit zijn de "dependencies_directory," de "brightfield_directory," en de "dic_directory."
  3. Vervolgens, ren Sectie 1. Dit gedeelte van de code genereert een helder beeldveld kubus van het volledige gebied van de volledige set van beelden. Alleen loopt DEEL 1 ONCE.
  4. Vervolgens, ren Sectie 2. Er verschijnt een dialoogvenster met de titel "Definieer NIQPM parameters" verschijnt. Vier getallen nodig van de gebruiker: het brandvlak nummer waar het helder veld beeld van desteekproef is in focus, laterale resolutie (micrometer / pixel in het beeld), de axiale resolutie (dit is 0,1 voor het acquisitie in 0,1 micrometer axiale stappen), en de regio van belang de grootte, deze parameter bepaalt de lengte van een zijde van een doos die later zal verschijnen - een typische waarde is 200. Klik op Ok.
  5. Een beeld van de heldere veld focal plane door de focal plane nummer zal verschijnen met een blauwe doos.
    1. Als het beeld niet scherp is, dubbelklikt u in het blauwe vak en herhaling deel 2, moet u het brandvlak nummer aanpassen in het dialoogvenster.
    2. Als het beeld is scherpgesteld, sleept u het blauwe vak rond het beeld en het formaat ervan wijzigen door het selecteren van de knooppunten van de doos en ze zo nodig te slepen. Plaats de doos rond de functie van belang zijn, bijvoorbeeld een cel. De box hoeft niet vierkant. Dubbelklik in het vak om het te accepteren.
  6. Vervolgens, ren afdeling 3 een stapel helder veld beelden construeren bijgesneden om de regio inlangstelling.
  7. Om de fase kaart, afbeelding pseudo DIC, en vergelijkingen met heldere getrouw beeld van de DIC veld beelden en genereren, rennen Sectie 4.
  8. Met de pseudo DIC en ware DIC beelden zo veel mogelijk een plan massadichtheid, totale massa en histogram van de celdichtheid kan worden bepaald door het uitvoeren punt 5a of 5b. Sectie 5a op geautomatiseerde kostganger detectie van het veld - optimize "drempel" op lijn 300 - kenmerkende waarden variëren tussen de 0,1-1. Herhaald dit gedeelte als nodig is om de waarde van de drempel optimaliseren. Artikel 5b, voert bepaling van de massa, etc. nadat de gebruiker de cel van belang schetst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Juiste monster verlichting bij door-aandacht beeld acquisitie is cruciaal voor de succesvolle implementatie van de NIQPM een nd HTDIC algoritmen. In figuur 2 illustreren we lage en hoge NA verlichting zowel onder DIC en helder veld contrast voor een polystyreen bol en de humane colorectale adenocarcinoomcellijn SW620. Figuren 2A, 2C, 2I en 2K demonstreren optimale beeldvorming voor NIQPM. Figuren 2F, 2H, 2N en 2P demonstreren optimale beeldvorming voor HTDIC.

Figuren 3 en 4 tonen de parameter-afhankelijkheid van de NIQPM algoritme belicht zowel geslaagde en mislukte implementaties. Het verwachte profiel is theoretisch bekend en kunnen dus rechtstreeks worden vergeleken met de NIQPM reconstructie - In figuur 3 de fase profiel van een 4,8 urn diameter polystyreen bol onderzoeken we. figuur 2L.

Cellulaire specimens, waarvan fase eigenschappen a priori niet bekend, kan worden gereconstrueerd met NIQPM in samenhang met een procedure om een "pseudo DIC" beeld vergelijken - berekend uit het gereconstrueerde fase - tot een werkelijke beeld DIC, bepaald uit een directe optische meting van de cel. NIQPM heeft een vrije parameter - het vliegtuig in de heldere beeldveld stapel waarop de berekening wordt gecentreerd. Deze centrale focal plane moet worden aangepast totdat de pseudo DIC en ware DIC beelden zien zo veel mogelijk. Figuren 4E-G tonen een out-of-focus pseudo afbeelding DIC, een beeld DIC optimale pseudo en de corresponding DIC beeld van de cel genomen met een verlichting NA van 0,9. Interessant is dat de beste fase afbeelding overeenkomstige pseudo DIC kaart en komen niet noodzakelijk overeen met het beeld helder veld focus op, namelijk. Figuren 1A en 1B.

Tenslotte Figuur 5 illustreert de stappen in het HTDIC beeld-algoritme. Uit de DIC door-focus beelden onder NA = 0.9 verlichting, figuren 5A en 5D, de Hilbert transformatie is voorgevormd om de bas-reliëf van de DIC beelden te verwijderen, figuren 5B en 5E. Dit komt met enkele vervaging langs de optische as die van high-pass Fourierfiltering kan worden verwijderd, figuren 5C en 5F. Deze uiteindelijke beelden gemakkelijk gesegmenteerd voor het gebied elke dwarsdoorsnede vlak van het monster te bepalen om het totale celvolume afleiden.

her.within-page = "altijd"> Figuur 1
Figuur 1. NIQPM en HTDIC Workflow. (1.) Microscopische preparaten zoals cellen moeten op microscoop worden gemonteerd schuift met deksel glas aangebracht op het monster met behulp van Fluoromount G. (2.) Through-focus beelden zowel onder DIC en helder veld contrast met een standaard verworven "off-the-shelf" microscoop vormen de input voor de algoritmen voor beeldverwerking. (3.) Post-verwerking van afbeeldingen in MATLAB naar cel volume van DIC en cellulaire massaverdeling van helder veld beeldspraak te bepalen. (4.) Kwantitatieve eindpunt metrics:. Heat maps en staafdiagrammen Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

igure 2 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50988/50988fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 2. Via-focus DIC en helder veld beeld van polystyreen bolletjes en SW620 cellijnen. De optimale beeldvorming voorwaarden voor NIQPM zijn helder veld contrast met 0,1 NA verlichting. Voor HTDIC DIC, 0.9 NA verlichting is optimaal. (A, B) En gezicht helder gebied beeldtaal van 4,8 micrometer diameter polystyreen bol onder 0.1 NA en 0.9 NA verlichting, respectievelijk. (C, D) dwarsdoorsnede helderveld beeld van 4,8 urn diameter polystyreen bol onder 0.1 en 0.9 NA NA verlichting respectievelijk. (E, F) En face DIC beeldtaal van 4,8 micrometer diameter polystyreen bol onder 0.1 NA en 0.9 NA verlichting, respectievelijk. (G, H) dwarsdoorsnede DIC beeldtaal van 4,8 micrometer diameter polystyreen bol sOnder voorbehoud van 0.1 NA en 0.9 NA verlichting, respectievelijk. (I, J) En gezicht helder veld beeld van SW620 colorectale kanker cellijn onder 0.1 en 0.9 NA verlichting, respectievelijk. (K, L) dwarsdoorsnede helder veld beeld van SW620 cel onder 0.1 en 0.9 NA verlichting, respectievelijk. (M, N) En face DIC beeldtaal van SW620 cel onder 0,1 en 0,9 NA NA verlichting, respectievelijk. (O, P) dwarsdoorsnede DIC beeldtaal van SW620 cel onder 0,1 en 0,9 NA NA verlichting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Optimale en suboptimale fase reconstructies. 4,8 urn diameter polystyreen bol Elke rij onderzoekt het brandvlak afhankelijkheid van het gezicht helder en veldsterkte (eerste kolom) en de gereconstrueerde fase profiel als het brandvlak begint bij het ​​middelpunt door de bol, z = 0 , en beweegt zich voorbij dit vliegtuig in 1 micrometer stappen. (A, E, I, M) E n gezicht helder veldsterkte, (B, F, J, N) overeenkomstige fase reconstructie, (C, G, K, O) vergelijking van de gereconstrueerde fase profiel langs de diagonaal van de fase kaart, blauwe cirkels, theoretische fase profiel, in het rood, en fouttolerantie fabrikant, zwarte lijnen, en (D, H, L, P) procent (%) fout van de gereconstrueerde phase met betrekking tot de theoretische fase profiel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Optimale en suboptimale fase reconstructies:. SW620 cel De twee kolommen vergelijken suboptimale en optimale helder beeldveld vliegtuigen (A, B) van de z-stack naar de fase rekencentrum. Deze fase reconstructies (C, D) wordt gebruikt om een pseudo DIC beeld (E, F) genereren. Deze worden vergeleken met True Image het DIC, NA = 0.9 verlichting, in (G). De DIC afbeelding pseudo beeld DIC beste matching bepaalt de juiste ingang beelden van de heldere veld image stack voor gebruik in fase reconstructie. Tenslotte wordt fase toegewezen aan de verwachte massa dichtheid (H, I). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Optimale DIC contrast enhancement gebruik HTDIC: polystyreen bolletjes en SW620 cel. (A) Cross-sectionele DIC beelden van een 4.8 polystyreen bol, (B) die overeenkomt HTDIC image, (C) Fourier gefilterd HTDIC afbeelding. De axiale afmeting van de bol beelden zijn geschaald om rekening te houden brekingsindex mismatch van het monster (1,597) en de montage media (1.4). (DF) aantonen dat dezelfde soorten afbeelding voor een SW620 cel, echter zonder refractieve index mismatch correctie als gevolg van de zwakke index contrast van het monster. Geen drempelwaarden is uitgevoerd op de afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In het algemeen, NIQPM is een buigingsbegrensde techniek gevalideerd op optische pad-lengtes variërend ,25-44,7. Validering werd bij n = 1,596 polystyreen bolletjes variërend in diameter van 0,11-9,8 urn gesuspendeerd in Fluoromount G (gegevens niet getoond). Cellen bezitten optische pad-lengtes die variëren van bijna 0-7.

Bij het meten van de verdeling dichtheid van een monster kan men vinden dat het imago van de pseudo DIC ziet er prima uit, terwijl de kaart dichtheid bezit ongewenste achtergrondgeluiden bijdragen. Dit is te wijten aan ruis in het helder veld beeld van het gebruikt als input voor de NIQPM algoritme monster. Twee mogelijke wijzigingen van de NIQPM methode kan worden gebruikt om de ongewenste achtergrond geschreven elimineren: ten eerste kan een langere belichtingstijden gebruiken ter verbetering signaal-ruis in het helderveld beelden. Dit is vooral van belang wanneer de beeldvorming optisch dunne exemplaren. Als alternatief kan men de axiale afstand van de z-stack acquisit verminderenion 0,1-0,05 micrometer en gemiddeld 2-3 vliegtuigen samen voor invoeren van hen in de NIQPM algoritme.

HTDIC gebaseerd volume bepaling is gevalideerd op polystyreen bolletjes, variërend in diameter van 1-20 um en is cross-gevalideerd met confocale fluorescentie microscopie 35. De techniek overschat het volume van voorwerpen hieronder de diffractie limiet van het systeem door diffractie effecten geassocieerd met de puntspreidingsfunctie van de optiek.

Problemen met de HTDIC volume bepaling misschien nodig is voor kleine of dunne exemplaren. De primaire bron van fout afkomstig is van image segmentatie met behulp van de ingebouwde MATLAB Sobel-gebaseerde Edge-detectie gebruikt om de grenzen van de cel te bepalen in de dwarsdoorsneden. De waarde van de "drempel" in hoofdstuk 4 van het HTDIC programma is van cruciaal belang bij het verkrijgen van de beste segmentatie. Resultaten lijken te variëren in een niet-lineaire manier - met kleine wijzigingen in de "drempel" drastically veranderen van de afgesloten ruimte als gevolg van de randdetectie. Het huidige programma stelt de gebruiker met opties om beeldsegmentatie uitvoeren van zowel de DIC z-stack, de HTDIC z-stack, of de F-HTDIC z-stack.

DIC alleen is vaak beter voor grote exemplaren terwijl HTDIC en F-HTDIC werk voor kleinere exemplaren (<5 micrometer in doorsnede).

Een masker kan het vermogen van de methode segment het beeld te verbeteren. Deel 2 kan de gebruiker een masker bepalen toe op de afbeelding kubus. Wij raden het gebruik van een rechthoekig masker dat de horizontale (x-hoogte) kapt van de kubus met behoud van de verticale (y-mate) van de kubus.

Samengevat, NIQPM en HTDIC zijn technologisch toegankelijk kwantitatieve beeldvormende technieken die kunnen worden uitgevoerd op standaard "off-the-shelf" Optische microscopen, in tegenstelling tot de meeste bestaande methoden. Centraal in deze technieken is door-focus beelden van het monster onder de ca.opriate beeldvorming voorwaarden: laag NA verlichting voor NIQPM en hoge NA verlichting voor HTDIC. De hier gepresenteerde methoden gegeneraliseerd kan worden voor gebruik op andere dan de hier gedemonstreerd systemen. De voor deze procedures primaire criteria een microscoop waarvoor de gebruiker heeft over de z-beweging van de fase en het vermogen om beelden te verkrijgen als focale positie van de objectieflens is gevarieerd. De gepresenteerde methoden zijn geschikt voor beeldvorming van gefixeerde cellen of langzaam biologische monsters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen financiële belangen in het gepresenteerde werk.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (U54CA143906 naar KGP, OJTM en R01HL101972 te OJTM) en een Oregon Medical Research Foundation Early Clinical Investigator Award (KGP). OJTM is een American Heart Association Established Investigator (13EIA12630000). Wij danken dr. Eric Anderson van de Ridder Cancer Institute voor het bereiden van cel samples gebruikt in dit werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany Axio Imager D2 Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm) Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont D540/25x Green filter
SlideBook 5.5 software Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado Image acquistion software
Polystyrene microspheres Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN PS06N Polystyrene spheres
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, Alabama 0100-01 Mounting media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
  2. Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
  3. Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
  4. Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
  5. Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
  6. Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
  7. Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
  8. Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
  9. Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
  10. Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
  11. Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
  12. Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
  13. Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
  14. Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
  15. Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
  16. Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
  17. Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
  18. Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
  19. Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
  20. Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
  21. Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
  22. Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
  23. Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
  24. Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
  25. Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
  26. Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
  27. Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  28. Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
  29. Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
  30. Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
  31. Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
  32. Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
  33. Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
  34. Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
  35. Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).

Tags

Biotechniek Label-free optica kwantitatieve microscopie cellulaire biofysica celmassa celvolume celdichtheid
Kwantitatieve Optische Microscopie: Meting van Cellulaire biofysische eigenschappen met een standaard optische microscoop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S.… More

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S. M., McCarty, O. J. T. Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope. J. Vis. Exp. (86), e50988, doi:10.3791/50988 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter