Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

Published: April 7, 2014 doi: 10.3791/50988
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 2Department of Dermatology, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 3Department of Cell & Developmental Biology, Division of Hematology & Medical Oncology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, School of Medicine

Abstract

Bu, parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntüleri bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun sayısal ölçümler için standart bir optik mikroskop kullanılmasını tarif eder. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. Düşük sayısal açıklık (NA) aydınlatma, zayıf saçılma ve numune tarafından ışığın zayıf emilimi: NIQPM dalga yayılımının basitleştirilmiş bir modeline dayanan, üç temel varsayımlar ile, paraksiyel yaklaşım olarak adlandırılır. Neyse ki, boyanmamış hücre örnekleri bu varsayımları karşılamak ve düşük NA aydınlatma kolayca ticari mikroskopları üzerinde elde edilir. HTDIC yüksek NA aydinlatma altında odak-boyunca DIC görüntüleri hacimsel bilgileri elde etmek için kullanılıration koşulları. Yüksek aydınlatma NA optik eksen boyunca numunenin geliştirilmiş bölümlendirilmeleri sağlar. Hilbert DIC görüntü işleme dönüşümü büyük ölçüde yığınlarının arka olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları artırır. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları "off-the-raf" mikroskop kullanarak teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Ticari kapsamları yavaş z-yığını alma zamanı henüz hızlı 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma lağvetti, ve ikincisi, kırınım etkileri 10'a kadar 0.2 ila nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak: Bu yöntemlerin iki temel sınırlamaları vardır sırasıyla (NIQPM) ve çapı 20 (HTDIC) um. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, çoğu sabit cellular örnekler hali hazırda, bu yöntemler ile incelenmiştir.

Introduction

Optik mikroskop kullanımı artık hücresel organizmaların araştırılmasında her yerde. Nedeniyle görünür optik spektrum üzerinde düşük endojen absorbans ve zayıf saçılma özellikleri, hücreler güçlü onları geçme optik dalgaların genlik etkileyebilir ve böylece standart parlak alan mikroskopları ile görüntülenmiş zaman yarı saydam görünmüyor. Hücresel örnekleri, bununla birlikte, doğrusal ışık hareket ettiği alanı belirli bir bölgede yerel bir kütle yoğunluğunun miktarı ile ilgili bir şekilde, kendi içinde seyahat eden optik dalgalar aşağı yavaş yok. Bu heterojen gecikmeyle veya mikroskobik yoluyla bulaşan optik dalgaların "faz" profilinin yararlanması ilk Fritleri Zernike 1 tarafından 1935 yılında tarif edilen ve deneysel Zernikein 1942 2 tarafından gerçekleştirilmiştir. Zernike bu başarı için 1953 yılında Nobel ödülü aldı. Zeiss 1945 3 bu yöntemi ticari. 1955 yılında Smith ve Nomarski diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi, bir kontrast mekanizması olarak faz uzaysal gradyanı kullanan bir yöntem kullanımıyla 4 ve 5 teorisi üzerindeki ilk çalışma mevcut olacaktır. DIC Nomarski 6 ile 1965in yakın işbirliği içinde Zeiss tarafından ticari oldu. 1981 yılında, iki laboratuvar DIC mikroskop 7, 8 optik trenin içine video kameralar eklenmesi ile kaydedilmiş ilk canlı hücre DIC görüntüleri gösterdi. Canlı hücre görüntüleme çağı doğdu.

O tarihten bu yana, ticari mikroskoplar üzerinde faz kontrast ve DIC hem yürütme büyük ölçüde değişmeden olmuştur. Morfolojisi, hücre altı yapıların takibi, ve membran dinamikleri 9 soruşturmalarının izlenmesi: Bu yöntemler esas nitel amaçlar için hücrelerin görüntülerini üretmek için biyologlar tarafından kullanılmaktadır. Bu teknikler faz ve dı olarak "off-the-raf" konfigürasyonunda nitelC görüntüleri keyfi ışık kaynağı yoğunluğu fonksiyonları, aydınlatma optik ayarları ve CCD kamera kazanç, gama ve pozlama ayarları vardır.

Fizikçiler ve optik mühendisleri küçük bir lejyon ticari görüntüleme yöntemleri nicel yapmak için çaba harcadı. İlk çabaları arasında hekim-açık-Biyofizikçi Robert Barer piyasada bulunan bir fazlı mikroskop kullanarak bu hücre türleri ile faz değişimleri tahmin ederek hücrelerin hücre kuru kütlesini belirlemek için faz mikroskobu kullanımı gösterilmiş olan 1952 ve 1953 yılında Nature iki mektup vardı 10, 11. Faz mikroskopi 10,11, DIC mikroskopi 12-17, ve optik yol uzunluğu, faz, kütlesini belirlemek için parlak bir alan 18-22: alan üç temel etiket ücretsiz kontrast mekanizmaları etrafında dayalı takip eden yılda teknikleri çok sayıda geliştirdi yoğunluk, kırılma indeksi ve hücre hacmi.

Paragraftallel, özel optik araçlar geniş bir koleksiyon da 1950'lerden beri geliştirilmiştir ve parazit büyüme 23 uygulamalar, kırmızı kan hücrelerinin 25 membran dinamikleri soruşturma hücre döngüsünü 24 belgeleyen değişen optik ölçümler geniş kapsamlı yaptık. Özellikle, son on yıl kırınım faz mikroskobu 26 şeklinde, tomografik faz mikroskopi 27, dijital holografik mikroskopi 28, faz duyarlı optik koherens mikroskopi 29, uzaysal ışık girişim mikroskopisi 30, Hilbert etiket içermeyen nicel mikroskopi bir zenginlik gördü faz mikroskopi 31, ve kantitatif faz mikroskopi 32. Toplu başarılara rağmen, bu araçlar onların karmaşık enstrümantasyon ve hesaplama gereksinimleri, çoğunlukla nedeniyle biyolojik araştırmacıların büyük alana saçılmış olmamıştır.

Burada biz dAydınlık saha ve DIC görüntülerinin bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun niceliksel ölçümlerini gerçekleştirmek için bir optik mikroskop kullanımını escribe. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için, diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Başarılı yürütülmesi için gerekli olan görüntüleme koşulları en ticari olarak temin edilebilir mikroskoplar normal çalışma kapsamı içindedir. Ayrıca, post-işleme algoritmaları, istikrarlı, hızlı ve sağlam - mümkün hızlı Fourier (FFT) tabanlı algoritmaları dönüşümü kullanılarak MATLAB uygulanmakta olan.

NIQPM faz ve cel, eksensel olarak entegre kütle yoğunluğu oluşturmak için bir yöntemdirparlak bir alan görüntülerinden lular örnekleri. Numunenin bu alan üzerinde eksensel olarak entegre kütle yoğunluğunun toplamı numunenin toplam kuru kütle içeriği verir. Bir hücrenin faz profili numunenin odak-boyunca parlak bir alan görüntülerinin yeniden inşa edilebileceği gösterilmiştir edildiği - - NIQPM protokol Paganin ve Nugent 18, 19 döşediği deneysel temellere dayanmakta ve Frank teorik çalışma , Altmeyer ve Wernicke 20 - verimli bir FFT-tabanlı şekilde paraksiyel dalga modellerini çözme. Kuru kütle yoğunluğuna fazın bağlantı Barer 10, 11 ve 33 ile Popescu çalışma üzerine dayanır.

Hacimsel bilgiler optik eksen boyunca numunenin optik olarak kısımlara sağlayan yüksek NA aydınlatma koşulları altında odak-boyunca DIC görüntü elde edilebilir. Hilbert DIC görüntü yığınlarının üzerinde işlem dönüşümü büyük ölçüde artırırArka plan olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları. Bu kontrast ve numunenin otomatik analizi için bir hacimsel sobel dayalı kenar algılama yöntemi geliştirmek için her iki Fourier filtreleme sebep olacak, ancak bu çalışma Arinson et al. 34 ile kaynaklanmaktadır. Biz de kırınım sınırından yukarı çapı 36, 20 mikron boyutu arasında değişen polistiren küreler daha önce HTDIC geçerliliği var.

NIQPM ve HTDIC hem ticari mikroskopları onların gelişimine nedeniyle teknolojik erişilebilir olmakla birlikte, yöntemler temelde mikroskopları kendilerini donanım konfigürasyonu ile sınırlıdır. Bu tekniklerin temel sınırlamalar iki kat vardır: aksine nedeniyle tüm numune aşamasında çeviri, ticari Kabinlerdekilerden yavaş z-yığını alma zamanı sadece objektif lens içinŞu anda hızlı kabaca 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma sınırlar, ve ikincisi, kırınım etkileri sırasıyla, çapı 10 ve 20 mikron kadar 0.2 arasında değişen büyüklüklerde nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri tipik "off-the-raf" enstrümanlar üzerinde bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, en sabit hücresel örnekleri kolayca bu yöntemler ile incelenmiştir.

NIQPM ve HTDIC protokollerin bir genel görünüşü Şekil 1'de verilmiştir. Şekil 2 biz, parlak alan ve DIC görüntüleri hem düşük hem de yüksek NA aydınlatma koşulları altında optimal ve optimal yoluyla odak görüntüleme göstermektedir. 3 ve 4 başarılı ve başarısız uygulamaları vurgulayarak NIQPM algoritmasının parametre bağımlılığını göstermektedir Rakamlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Mikroskop Özellikleri

Doğru şekilde görüntüleme yürütmek için mikroskop aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır:

  1. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve aydınlık (BF) kontrast hem de sahip.
  2. Bilgisayar kontrollü z-eksen hareketi var.
  3. Yoğunlaştırıcı mercek sayısal açıklık değişeceği için ayarlanabilir diyafram durak var. Derecelendirilmiş bir kural veya elektronik okuma bir diyafram sayısal diyafram değerini bilmek gereklidir. Sayısal açıklık NIQPM için 0.1 HTDIC için 0.9 (veya daha yüksek) kadar aralık olmalıdır.
  4. Mikroskop parlak bir alan görüntüleme için kullanılmak üzere bir dar bant renk filtresi olmalıdır. Bu filtre, kırılma artış, NIQP kütle yoğunluğuna faz dönüştürmek için kullanılan bir dalga boyuna bağımlı facture gidermek için gereklidir.

2. Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Z-yığın Edinme

  1. Slidebook yazılım a açınnd resim koleksiyonu için yeni bir slayt oluşturmak.
  2. Sonra, Odak penceresi açmak. Filtre Seti bölümünde, DIC seçin. Kapsam sekmesinde, Kondenser bölümünde, uzak doğru pozisyonda (tüm yol açmak) için Diyafram kaydırma çubuğunu ayarlayın. Bu yüksek sayısal açıklık aydınlatma sağlar ve numunenin optik bölümlendirilmeleri artırır.
  3. Bir DIC objektif kullanılarak numune odaklanın. Örnek kolayca görünür oluncaya kadar halojen lamba yoğunluğunu ayarlayın. Kamera doymuş varlık değildir sağlamak için, Odak Penceresinde Kamera sekmesini seçin ve piksel yoğunluğunun histogram kameranın dinamik aralığında olduğunu kontrol edin.
  4. Görüntü Yakalama penceresini açın. Yakalama Türü bölümünde, 3D kutusunu işaretleyin. 3D Capture bölümünde, merkez etrafında Aralığı seçmek ve mevcut yere geri dönün
  5. Görüntü Yakalama penceresinin Filtre Seti bölümünde, DIC kutusunu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü Bilgisi bölümünde, (isteğe bağlı) resmi adı ve görüntüleme başlatmak için Başlat seçeneğini belirleyin.

3. Parlak Field (BF) Z-yığın Edinme

  1. Mikroskop numunenin DIC Z-yığını toplama bittikten sonra, Odak penceresi açmak ve Filtre Seti bölümünde Aç seçeneğini seçin. Düşük NA aydınlatma sağlamak için (tüm yol kapalı) uzak sol konumuna Diyafram kaydırma çubuğunu ayarlayın.
  2. Yeşil mikroskop ışık yolu filtresini değiştirin. Örnek görünür oluncaya kadar halojen lamba yoğunluğunu ayarlayın. Seçerek kamera doygunluk var olun
  3. Görüntü Yakalama penceresini açın. DIC Z-yığın iktisabından 3D Çekim ayarları görüntülenir.
  4. Görüntü Yakalama penceresinin Filtre Seti bölümünde, AÇIK kutusunu işaretleyin ve pozlama süresini belirtin. Görüntü Bilgisi bölümünde, (isteğe bağlı) resmi adı, ve Z-yığın görüntü toplama başlatmak için Başlat seçeneğini belirleyin.

4. Z-yığın Görüntüler İhracat

  1. Z-yığın yakalama açın. % 100 görünümünü değiştirin. 0 arasında görüntülenecek piksel değerlerinin histogram ve kameranın maksimum piksel değeri (4.095 12 bit kameralar, 16 bit için 65.535.) Ayarlayın.
  2. Görünüm> Dışa Aktar> TIFF Seri seçin. Bu TIFF görüntüleri bir dizi olarak Z-yığını ihraç edecek(Her Z düzlemi için bir tane). Sonunda (yani "DIC Stack 1_") da bir çizgi bir adla ayrı bir klasörde TIFF dizi kaydedebilirsiniz. Her DIC veya BF Z-yığını ile bu işlemi tekrarlayın.

5. Hacim Ölçümleri

  1. "JoVE_HTDIC_v1.m" başlıklı HTDIC MATLAB programını açın.
  2. HTDIC programın Bölüm 0 altında, bağımlılıkları dizin değişkeni güncelleştirmek. Kopyala ve "dependencies_directory =" Aşağıdaki tek tırnak arasındaki explorer hilbert_transform_dic.m ve sobel_edge_detect.m dosyaları (PC) içeren dizini yapıştırın. JoVE_HTDIC_v1.m program ExecuteSection 0.
  3. Bölüm 1, "images_directory" güncelleyin. Yine, kopyalama ve tek tırnak arasında. Tif biçiminde yoluyla odak görüntüleri içeren dizini yapıştırın. SADECE BİR KEZ BÖLÜM 1. RUN.
  4. Hizalama ve Hilbert için görüntülerin dönme çalıştırın kod Bölüm 2. dönüşümü. "HTDIC parametreleri tanımlayın" başlıklı bir iletişim kutusu açılacaktır. Beş numbers kullanıcı gereklidir: numune DIC görüntü odakta odak düzlemi sayısı, yanal çözünürlük (görüntüde mm / piksel), eksenel çözünürlük (bu 0.1 mikron eksenel adımda görüntü alımı için 0.1), DIC görüntünün dönüş açısı Hilbert dönüşümü gerçekleştirmek için gerekli tipik değerler 45 ve -135 bulunmaktadır. Son olarak, ilgi boyutta bölge girmek, bu parametre, daha sonra görünür bir kutunun bir yan uzunluğunu tanımlayan - tipik değer 400'dür. Ok tıklayın.
  5. Odak düzlemi sayısına göre belirlenen DIC odak düzlemi bir görüntü mavi bir kutu ile belirir. Bir hücrenin, örneğin, ilgi özelliği üzerinde kutusunu yerleştirin. Kutu kare olması gerekmez. Kutu arzu edilen bölgeye, kutunun içinde çift tıklayarak üzerinde konumlandırılmış edildikten sonra.
  6. Başka bir rakam şimdi görünecektir: Bu rakam bir önceki adımda seçilen ilgi bölgenin bir kırpılmış ve döndürülmüş görüntüsünü içerir. Görüntünün kontrast şekilde olmalıdırparlak özellikleri sağ tarafta görünür iken o karanlık özellikleri solda görünür. Ilgi bölgesi üzerinde mavi kutuyu sürükleyin, gerektiğinde yeniden şekillendirmek.
  7. Bölüm 3 z-yığın küp için bir maske oluşturur. Dikdörtgen bir maske hücrenin etrafına bir dikdörtgen ve elle ilgi hücre anahat ücretsiz bir el aracı oluşturmak için: Mevcut İki maske türü vardır.
  8. Dikdörtgen bir maske, dosyamıza hattı 167 ve açıklama satırı 170 (bu çizginin başında bir "%" koyarak bir satırı yorum) oluşturmak için. Programın Bölüm 3. yürütün. Görüntüdeki tıklayın ve dikdörtgen maske tanımlayarak başlamak için fareyi sürükleyin. Bunu kabul etmek kutuya çift tıklayın.
  9. Elle çizilmiş bir maske, Yorum satırı 167 ve yorumsuz hattı 170 oluşturmak ve Bölüm 3. yürütün. Tıklayın ve fare ile istenen maske çizin. Bunu kabul etmek maskesi üzerine çift tıklayın.
  10. Hilbert inşa 4to çalıştırın Bölüm DIC Görüntü yığını ve ilgi alanının tekabül DIC görüntü yığınını dönüştürdü.Bölüm 3 inşa maske DIC yığını ve "Maskon" satırında 179 1'e set edilir düzenli DIC yığını dönüştürmek Hilbert uygulanacaktır. 0 "Maskon" ayarı maske uygulamadan görüntü yığınlarının inşa edecek.
  11. Ilgi bölgenin xz kesit görüntülerin görüntü segmentasyon optimize Bölüm 5 çalıştırın. Program tarafından üretilen rakam 500, kontrast, üç farklı görüntüleme görünür. Hücrenin sınırları bulmak için algoritmanın başarısı, kullanılan maske ve program doğrultusunda 229 at "eşik" değerinin bir kombinasyonu ile bağımlıdır. 0.5 bir değerle başlar. Eşik değerini ayarlamak ve doğru özetleyen sütunlardan birinde elde edilinceye kadar programın bu bölümü yeniden çalıştırın.
  12. Anahat 1. sütunda iyi olsaydı, DIC görüntü segmentasyon kullanarak ses seviyesini belirlemek için Bölüm 6 kullanın. Sütun 2 optimum sonuçlar verdiyse, Hilbert-dönüştürülmüş DIC görüntüleri hücre hacmini belirlemek için Bölüm 7 çalıştırın. Eğer sütun 3 gave optimal sonuçları, koşmak Bölüm 8 Fourier-filtreden Hilbert-dönüştürülmüş DIC görüntüleri kullanarak hacmini belirlemek.
  13. Küp mikron (fl) rapor numunenin ölçülen hacim, hacim ölçümü seçildiği bağlı olarak program tarafından üretilen Şekil 600, 700, veya 800 başlığında sunulmuştur.

6. Kütle Ölçümleri

  1. "JoVE_NIQPM_v1.m" başlıklı NIQPM MATLAB programını açın.
  2. NIQPM programın Bölüm 0 altında, programı çalıştırmak için gerekli üç dizin konumunu güncelleştirmek. Bunlar "dependencies_directory," "brightfield_directory," ve vardır "dic_directory."
  3. Sonraki Bölüm 1. çalıştırın. Bu kod bölüm görüntüler tüm setinin tam alanında parlak bir alan görüntü küp oluşturur. SADECE BİR KEZ BÖLÜM 1. RUN.
  4. Sonraki Bölüm 2. çalıştırın. "NIQPM parametreleri tanımlayın" başlıklı bir iletişim kutusu açılacaktır. Dört numaraları kullanıcı gereklidir: odak düzlemi numarası nerede ve parlak alan görüntüörnek odakta olduğu, yanal çözünürlük (görüntüde mm / piksel), eksenel çözünürlük (bu 0.1 mikron eksenel adımda görüntü alımı için 0.1), ve faiz boyutu bölgesi, bu parametre bir tarafı uzunluğunu belirler sonradan görünecektir kutusu - tipik bir değer 200'dür. Ok tıklayın.
  5. Odak düzlemi sayısına göre belirlenen aydınlık alan odak düzlemi bir görüntü mavi bir kutu ile belirir.
    1. Görüntü odakta değilse, mavi kutu ve tekrar çalıştırın Bölüm 2 çift tıklayın, iletişim kutusunda odak düzlemi sayısını ayarlamak için emin olun.
    2. Görüntü odakta ise, resmin etrafında mavi kutuyu sürükleyin ve kutunun düğümlerin seçimi ve gerektiğinde bunları sürükleyerek yeniden boyutlandırmak. Bir hücrenin, örneğin, ilgi özelliği etrafında kutu yerleştirin. Kutu kare olması gerekmez. Bunu kabul etmek kutunun içini çift tıklatın.
  6. Sonraki çalıştırmak parlak alan görüntülerin bir yığın oluşturmak için Bölüm 3 içinde bölgeye kırpılmışterest.
  7. Faz haritası, sözde DIC görüntü ve parlak bir alan görüntüler ve gerçek DIC görüntüye karşılaştırmalar oluşturmak için, Bölüm 4 çalıştırın.
  8. Sözde ile DIC ve kütle yoğunluğu haritası, toplam kütle ve hücre yoğunluğu histogram mümkün olduğunca benzer doğru DIC görsel bölüm 5a veya 5b çalıştırarak belirlenebilir. Hattında 300 at optimize "eşik" - - Bölüm 5a alanının otomatik yatılı tespitini gerçekleştiren tipik değerleri 0,1-1 arasında değişmektedir. Eşik değerini optimize etmek gerektiği gibi, bu bölümü yeniden çalıştırın. Kullanıcı ilgi hücresini özetliyor sonra bölüm 5b vb kitle belirlenmesi, yürütmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Odak-boyunca görüntü alımı sırasında doğru örnek aydınlatma NIQPM nd HTDIC algoritmaları başarılı bir şekilde uygulanması için önemlidir. Şekil 2 biz DIC ve polistiren küre ve insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı SW620 için parlak bir alan kontrast altında hem düşük hem de yüksek NA aydınlatma göstermektedir. 2A Şekiller, 2C, 2I, ve 2K NIQPM için optimal görüntüleme göstermektedir. 2F, 2H Rakamlar, 2N, ve 2P HTDIC için en uygun görüntüleme göstermektedir.

Şekiller 3 ve 4, başarılı ve başarısız uygulamaları vurgulama NIQPM algoritma parametresi bağımlılığını göstermektedir. Beklenen profili teorik bilinen ve bu nedenle yeniden NIQPM doğrudan karşılaştırılabilir - Şekil 3, bir 4.8 mikron çapında polistiren kürenin faz profilini incelemek. Şekil 2L% hata ile NIQPM ile yakalanabilir.

, Direkt bir optik ölçüm belirlenen gerçek bir DIC görüntü için - yeniden fazdan bilgisayarlı - kimin faz özellikleri, a priori olarak bilinmemektedir hücresel örnekleri, bir "sözde DIC" görüntüyü karşılaştırmak için bir prosedür ile birlikte NIQPM kullanılarak yeniden inşa edilebilir hücrenin. Hesaplama merkezli hangi parlak alan görüntü yığınında uçak - NIQPM ücretsiz bir parametresi vardır. Bu merkezi odak düzlemi correspondin sözde DIC ve gerçek DIC görüntüleri. Şekil 4E-G bir out-of-focus sözde DIC görüntü, optimal bir pseudo DIC görüntü göstermek mümkün olduğunca benzer kadar ayarlanır, ve olmalıdır0.9 bir aydınlatma NA ile alınan hücrenin g DIC görüntüsü. İlginçtir, en faz harita ve gelen sözde DIC görüntü mutlaka bir odak parlak alan görüntüde, yani. Şekil 1A ve 1B uymamaktadır.

Son olarak, Şekil 5, HTDIC görüntü işleme algoritması dahil adımları göstermektedir. NA altında DIC odak-boyunca görüntü = 0.9 aydınlatma itibaren, 5A ve 5D Rakamlar, Hilbert dönüşümü DIC görüntülerin bas rahatlama kaldırmak için önceden oluşturulmuş olan, 5B ve 5E Rakamlar. Bu, bazı yüksek geçiren Fourier filtreleme çıkarılabilir optik eksen boyunca bulanıklığı ile gelir, 5C ve 5F Rakamlar. Bu son görüntüleri kolayca toplam hücre hacmi anlaması için numunenin her bir kesit düzleminde alanı belirlemek için bölümlenmiştir.

her.within-page = "always"> Şekil 1
Şekil 1. NIQPM ve HTDIC iş akışı. (1). Gibi hücreleri mikroskobik örneklerin mikroskop üzerine monte edilmelidir Fluoromount G. kullanılarak numune üzerine yapıştırılmış cam kapak ile slaytlar (2). DIC ve bir standart ile aydınlık alan aksine hem edinilen sayesinde odaklama görüntüleri "off-the-raf" mikroskop görüntü işleme algoritmaları girişi oluşturur. (3). MATLAB görüntüleri post-processing DIC hücre hacmini ve parlak alan görüntüleri hücresel kütle dağılımını belirlemek. (4). Kantitatif bitiş noktası ölçümleri:. Isı haritaları ve çubuk grafikler bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

ŞEKIL 2 "fo: İçerik-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50988/50988fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 2. Through-odak DIC ve polistiren küreler ve SW620 hücre hatlarının parlak alan görüntüleri. NIQPM için en uygun görüntüleme koşulları 0.1 NA aydınlatma ile aydınlık alan kontrastı vardır. HTDIC DIC için, 0.9 NA aydınlatma uygunudur. (A, B) En sırasıyla, 0.1 NA 0.9 NA aydınlatma için 4.8 mikron çaplı polistiren küre konunun parlak alan görüntüleri karşıya. (C, D) 0.1 NA ve 0.9 NA aydınlatma için 4.8 mikron çaplı polistiren küre konu kesit parlak alan görüntüleri, sırasıyla. (E, F) En yüz DIC 0.1 NA 0.9 NA aydınlatma için 4.8 mikron çaplı polistiren küre konu görüntüleri, sırasıyla. (G, H) 4.8 mikron çaplı polistiren küre s kesit DIC görüntülerisırasıyla, 0.1 NA 0.9 NA aydınlatma için ubject. (I, J) En sırasıyla, 0.1 ve 0.9 NA aydınlatma için SW620 kolorektal kanser hücre hattı konusunun parlak alan görüntüleri karşıya. (K, L) sırasıyla kesit 0.1 SW620 hücre konunun parlak bir alan görüntü ve 0.9 NA aydınlatma,. (M, N) En yüz DIC 0.1 NA 0.9 NA aydınlatma için SW620 hücre konu görüntüleri, sırasıyla. (O, P) 0.1 NA ve 0.9 NA aydınlatma için SW620 hücre konu kesit DIC görüntüleri. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3,. Optimal ve optimal faz rekonstrüksiyon:. 4.8 mikron çaplı polistiren küre Her satır, odak düzlemi küre aracılığıyla orta başlar gibi en parlak alan yoğunluğunu (ilk sütun) ve yeniden faz profil yüz odak düzlemi bağımlılığı araştırır, z = 0 ve 1 um adımlarla bu düzleme geçen hareket eder. Fazın çapraz boyunca yeniden faz profilinin (A, E, I, M) E n parlak bir alan yoğunluğu yüz, (B, F, J, N) 'e uygun faz yeniden oluşturma, (C, G, K, O) karşılaştırma harita, mavi daireler, teorik kırmızı faz profili, ve üreticinin hata toleransı, siyah çizgiler ve (D, H, L, P) yüzde (%) yeniden p hatasıhase teorik faz profili açısından. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Optimal ve optimal faz rekonstrüksiyon:. SW620 hücre iki sütun faz hesaplama ortalamak için z-yığından optimal ve optimal parlak alan görüntü uçakları (A, B) karşılaştırın. Mukabil faz rekonstrüksiyonlar (C, D), bir sahte DIC görüntü (E, F) üretmek için kullanılır. Bunlar gerçek DIC resim modeli ile kıyaslanır, NA (G) 'in, 0.9 aydınlatma =. Iyi DIC görüntüyü uyan sahte DIC görüntü parlak alanında ima gelen doğru giriş görüntüleri belirlerge yığın faz yeniden kullanmak. Son olarak, faz öngörülen kütle yoğunluğu (H, I) eşleştirilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5,. HTDIC kullanarak Optimal DIC kontrast: polistiren küreler ve SW620 hücre. 4.8 polistiren kürenin (A) Kesit DIC görüntüleri, (B) HTDIC görüntüyü gelen, (C) Fourier HTDIC görüntü süzülür. Küre görüntülerin eksenel boyut numune (1,597) kırılma indeksi uyumsuzluğu ve montaj medya (1.4) için hesap ölçekli edilmiştir. (DF) hiçbir refraktif i ile, ancak, bir SW620 hücre için aynı görüntü türlerini göstermekNumunenin zayıf endeksi kontrast sayesinde nDex uyuşmazlığı düzeltme. Hiçbir eşikleme bu görüntüler üzerinde yapılmıştır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Genel olarak, NIQPM ,25-44,7 değişen optik yol uzunlukları üzerinde doğrulanmış bir kırınım-sınırlı bir tekniktir. Doğrulama n gerçekleştirilmiştir = Fluoromount G içinde süspansiyon haline 0.11-9.8 um çap arasında değişen 1,596 polistiren küreler (veriler gösterilmemiştir). Hücreler yaklaşık 0-7 aralığında optik yol uzunluklarına sahip.

Bir numunenin yoğunluk dağılımını ölçerken bir yoğunluk haritası, arka plandaki istenmeyen katkıları sahip iken sözde DIC görüntü daha ince görünüyor bulabilirsiniz. Bu NIQPM algoritmasına girdi olarak kullanılan numunenin parlak alan görüntüleri gürültü kaynaklanmaktadır. NIQPM yöntem için iki olası değişiklikler istenmeyen arka plan katkıları ortadan kaldırmak için kullanılabilir: birincisi, bir sinyal-gürültü parlak bir alan görüntülerde geliştirmek için daha uzun pozlama süreleri kullanabilirsiniz. Optik olarak ince örnekler görüntüleme olduğunda bu durum özellikle önemlidir. Alternatif olarak, bir z-yığın acquisit eksensel boşluk azaltabilirNIQPM algoritma içine girerek önce birlikte 0.1-0.05 um ve ortalama, 2-3 uçakları iyon.

HTDIC tabanlı hacim belirleme 1-20 mikron çap arasında değişen polistiren küreler üzerinde valide edilmiştir ve konfokal floresan mikroskobu ile 35 arası valide edilmiştir. Bu teknik nedeniyle optik nokta dağılım fonksiyonu ile ilişkili kırınım etkilere sistemin kırılma sınırının altında nesnelerin ses olduğundan yük.

Belki küçük veya ince numuneler için gerekli HTDIC hacim kararlılığını Giderme. Hatanın birincil kaynağı kesit görüntüleri hücrenin sınırlarını belirlemek için kullanılan yerleşik MATLAB Sobel dayalı kenar algılama kullanarak görüntü segmentasyonu geliyor. HTDIC Programın 4. bölümde "eşik" değeri iyi segmentasyon elde edilmesinde çok önemlidir. Sonuçlar doğrusal olmayan bir şekilde değişebilir eğilimindedir - "eşik" drasticall küçük değişikliklerley kenar algılama kaynaklanan kapalı alanı değişiyor. Mevcut program DIC z-yığını, HTDIC z-yığını, ya da F-HTDIC z yığının birinden görüntü segmentasyon yapmak için seçenekleri ile kullanıcıya sunuyor.

Yalnız DIC büyük numuneler için genellikle daha iyi ise HTDIC ve küçük numuneler (çapı <5 mikron) F-HTDIC çalışma.

Bir maske segmente yöntemin yeteneğini görüntü artırabilir. Bölüm 2 kullanıcı görüntü küp uygulamak için bir maske belirlemenize olanak sağlar. Küp dikey (y-ölçüde) korurken Biz küpün yatay (x-ölçüde) keser dikdörtgen maske kullanılmasını öneriyoruz.

Özetle, NIQPM ve HTDIC çoğu mevcut yöntemlerin aksine, standart "off-the-raf" optik mikroskoplar yapılabilir teknolojik erişilebilir kantitatif görüntüleme yöntemleridir. Bu tekniklerin merkezinde yak altında numunenin odak-boyunca görüntü olduğunuopriate görüntüleme koşulları: NIQPM düşük NA aydınlatma ve HTDIC için yüksek NA aydınlatma. Burada sunulan yöntemler burada gösterdi dışındaki sistemlerde kullanılmak üzere genel olabilir. Bu işlemler için gerekli olan birincil kriter, kullanıcının kademesinin z-hareketi ile objektif merceğin odak pozisyonu farklı olduğu gibi görüntü elde etmek için yetenekleri üzerinde kontrole sahip olduğu için bir mikroskop. Sunulan yöntemler ile sabitleştirilmiş hücreler görüntüleme ya da yavaş hareket eden biyolojik numuneler için uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar sunulan çalışmalarında hiçbir maddi çıkarları var.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (OJTM için KGP, OJTM ve R01HL101972 için U54CA143906) ve Oregon Tıbbi Araştırma Vakfı Erken Klinik Araştırmacı Ödülü (KGP) hibe tarafından desteklenmiştir. OJTM bir Amerikan Kalp Derneği Kuruldu Araştırmacı (13EIA12630000) 'dir. Biz bu çalışmada kullanılan hücre örnekleri hazırlamak için Şövalye Kanser Enstitüsü'nden Dr Eric Anderson teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany Axio Imager D2 Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm) Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont D540/25x Green filter
SlideBook 5.5 software Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado Image acquistion software
Polystyrene microspheres Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN PS06N Polystyrene spheres
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, Alabama 0100-01 Mounting media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
  2. Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
  3. Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
  4. Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
  5. Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
  6. Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
  7. Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
  8. Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
  9. Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
  10. Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
  11. Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
  12. Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
  13. Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
  14. Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
  15. Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
  16. Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
  17. Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
  18. Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
  19. Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
  20. Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
  21. Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
  22. Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
  23. Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
  24. Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
  25. Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
  26. Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
  27. Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  28. Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
  29. Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
  30. Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
  31. Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
  32. Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
  33. Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
  34. Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
  35. Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).

Tags

Biyomühendislik Sayı 86 Etiket-optikler kantitatif mikroskopi hücresel biyofizik hücre kütlesi hücre hacmi hücre yoğunluğu
Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S.… More

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S. M., McCarty, O. J. T. Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope. J. Vis. Exp. (86), e50988, doi:10.3791/50988 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter