Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kvantitative optisk mikroskopi: Måling af Cellular Biophysical Features med en standard optisk mikroskop

Published: April 7, 2014 doi: 10.3791/50988
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 2Department of Dermatology, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 3Department of Cell & Developmental Biology, Division of Hematology & Medical Oncology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, School of Medicine

Abstract

Vi beskriver brugen af ​​en standard optisk mikroskop til at udføre kvantitative målinger af masse, volumen og densitet på cellulære prøver gennem en kombination af lys felt og differentieret interferens kontrast billedsprog. To primære tilgange præsenteres: noninterferometric kvantitativ fase mikroskopi (NIQPM), til at udføre målinger af total cellemasse og subcellulære tæthed distribution og Hilbert omdanne differential interferens kontrast mikroskopi (HTDIC) for at bestemme lydstyrken. NIQPM er baseret på en forenklet model af bølgeudbredelse, kaldet paraksiale tilnærmelse, med tre underliggende antagelser: lav numerisk blænde (NA) belysning, svag spredning og svag absorption af lys ved prøven. Heldigvis ufarvede cellulære prøver opfylde disse antagelser og lav NA belysning opnås let på kommercielle mikroskoper. HTDIC anvendes til at opnå volumetrisk oplysninger fra gennemgående fokus DIC billedsprog under højt NA Illumination forhold. Høj NA belysning muliggør udvidet sektionering af prøven langs den optiske akse. Hilbert omdanne behandling på DIC billedet stakke i høj grad øger kantdetektering algoritmer til lokalisering af prøven grænser i tre dimensioner ved at adskille de grå værdier af modellen intensiteten fra dem af baggrunden. De primære fordele ved NIQPM og HTDIC lå i deres teknologiske tilgængelighed ved hjælp af "off-the-shelf" mikroskoper. Der er to grundlæggende begrænsninger af disse metoder: langsom z-stak erhvervelse tid på kommercielle Scopes øjeblikket ophæver undersøgelse af fænomener hurtigere end 1 frame / minut, og for det andet, diffraktion effekter begrænser nytten af ​​NIQPM og HTDIC til objekter fra 0,2 op til 10 (NIQPM) og 20 (HTDIC) um i diameter, hhv. Derfor skal prøven og dens tilhørende tids dynamik interesse mødes vis størrelse og tidsmæssige begrænsninger for at aktivere brugen af ​​disse metoder. Spændende, mest fast cellulaR Enheder let undersøgt med disse metoder.

Introduction

Brugen af ​​optisk mikroskopi er nu er allestedsnærværende i undersøgelse af cellulære organismer. På grund af deres lave endogene absorbans og svag spredende egenskaber i forhold til det synlige optiske spektrum, kan cellerne ikke kraftigt påvirke amplituden af ​​optiske bølger gennemkører og således synes semitransparent når afbildes med standard lyse felt mikroskoper. Cellular prøver er dog bremse optiske bølger rejser gennem dem på en måde, som er lineært relateret til mængden af ​​lokale massefylde i et bestemt område af rummet, hvorigennem lyset bevæger sig. Udnyttelse af denne heterogene forsinkelse eller "fase" profil af optiske bølger transmitteres gennem mikroskopiske prøver blev første gang beskrevet i 1935 af Frits Zernike 1 og eksperimentelt realiseret ved Zernikein 1942 2. Zernike blev tildelt Nobelprisen i 1953 for denne præstation. Zeiss kommercialiseret denne modalitet i 1945 3. I 1955 Smith og NomarskJeg vil præsentere deres indledende arbejde vedrørende anvendelse 4 og teori 5 af differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, en modalitet, der bruger den rumlige gradient af fase som en kontrast mekanisme. DIC blev kommercialiseret af Zeiss i 1965in tæt samarbejde med Nomarski 6. I 1981 to laboratorier viste den første optaget live celle DIC billedsprog med indarbejdelsen af videokameraer i optik toget af DIC mikroskop 7, 8. Den æra af levende celler blev født.

Siden dette tidspunkt har udførelsen af ​​både fasekontrast og DIC på kommercielle mikroskoper stort set været uændret. Disse metoder er hovedsagelig anvendes af biologer til at producere billeder af celler til kvalitative formål: overvågning af morfologi, sporing af subcellulære strukturer, og undersøgelser af membran dynamik 9. Disse teknikker er kvalitative i deres "off-the-shelf" konfiguration som både fase og DIC-billeder er vilkårlige funktioner af lyskilden intensitet, belysningsoptikken indstillinger og CCD-kamera gain, gamma og eksponering indstillinger.

En lille hær af fysikere og optiske ingeniører har forsøgt at gøre kommercielle billeddiagnostiske modaliteter kvantitativ. Blandt de første indsats var to breve til naturen i 1952 og 1953, hvor lægen-turned-biofysiker Robert Barer demonstreret brugen af fase mikroskopi for at bestemme cellulær tørvægt af celler ved at anslå faseskift gennem disse celletyper ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt fase mikroskop 10, 11. Feltet har udviklet et væld af teknikker end de efterfølgende år baseret omkring tre grundlæggende label-fri kontrast mekanismer: fasemikroskopi 10,11, DIC mikroskopi 12-17, og lyse felt 18-22 for at bestemme optisk vejlængde, fase, masse densitet, brydningsindeks og cellulære volumen.

I parallel, har en stor samling af brugerdefinerede optiske instrumenter også blevet udviklet siden 1950'erne, og har gjort vidtrækkende optiske målinger lige fra applikationer i parasit vækst 23, at dokumentere cellecyklus 24 til at undersøge membran dynamik røde blodlegemer 25. Især har de seneste ti år set et væld af etiket-fri kvantitativ mikroskopi i form af diffraktion fasemikroskopi 26, tomografisk fasemikroskopi 27, digital holografisk mikroskopi 28, fasesensitiv optisk kohærens mikroskopi 29, rumlig mikroskopi lys indblanding 30, Hilbert fasemikroskopi 31, og kvantitativ fasemikroskopi 32. På trods af deres kollektive succeser, har disse instrumenter ikke er blevet formidlet til de større område af biologiske forskere grund, for det meste, at deres komplekse instrumentering og beregningsmæssige krav.

Heri vi describe brugen af ​​en standard optisk mikroskop til at udføre kvantitative målinger af masse, volumen og densitet på cellulære prøver gennem en kombination af lys felt og DIC billedsprog. To primære fremgangsmåder er præsenteret: noninterferometric kvantitativ fasemikroskopi (NIQPM), til at udføre målinger af totale cellemasse og subcellulær tæthed distribution og Hilbert transformation differential interferens kontrast mikroskopi (HTDIC) for at bestemme volumen. De primære fordele ved NIQPM og HTDIC lå i deres teknologiske tilgængelighed. De billeddiagnostiske betingelser for deres vellykkede gennemførelse ligger inden for rammerne af normal drift af de fleste kommercielt tilgængelige mikroskoper. Derudover post-algoritmer er stabile, hurtig og robust - der er blevet implementeret i MATLAB hjælp af Fast Fourier transformation (FFT) baserede algoritmer når det er muligt.

NIQPM er en metode til at rekonstruere fase og den aksialt integreret massefylde cellular prøver fra lyse felt billedsprog. Opsummering af denne aksialt integreret massefylde over det område af prøven giver det totale tørstofindhold af prøven masse. Den NIQPM Protokollen er baseret på de eksperimentelle fundament lagt af Paganin og Nugent 18, 19 - hvori det blev påvist, at den fase profil af en celle kunne rekonstrueres fra gennemgående fokus lyse felt billedsprog af prøven - og det teoretiske arbejde, Frank , Altmeyer og Wernicke 20 - om at løse de paraksiale bølge modellerne på en effektiv FFT-baserede måde. Tilslutningen af fase til den tørre massefylde er baseret på arbejde af Barer 10, 11 og Popescu 33..

Volumetrisk oplysninger kan fås ved henvendelse gennem fokus DIC billedsprog under høje NA lysforhold, der muliggør optisk sektionering af prøven langs den optiske akse. Hilbert omdanne behandling på DIC billedstakke høj grad øgerflankeidentificering algoritmer til lokalisering af prøven grænser i tre dimensioner ved at adskille de grå værdier af modellen intensitet fra de af baggrunden. Dette arbejde stammer med Arinson et al. 34 selvom vi har indført både Fourier filtrering metoder til at forbedre kontrast og en Sobel-baserede kantdetektering metode til automatiseret volumetrisk analyse af prøven. Vi har også valideret HTDIC tidligere på polystyren kugler varierer i størrelse fra diffraktion grænsen op til 20 um i diameter 36.

Mens både NIQPM og HTDIC er teknologisk tilgængelige på grund af deres udvikling på kommercielle mikroskoper, er de metoder, der fundamentalt begrænset af den hardware konfiguration af mikroskoper selv. De primære begrænsninger af disse teknikker er dobbelt: slow z-stak erhvervelse tid på kommercielle anvendelsesområder, på grund af oversættelse af hele prøven scenen i modsætning til blot objektivlinsenBegrænser i øjeblikket undersøgelsen af ​​fænomener hurtigere end omkring 1 ramme / minut, og for det andet diffraktionseffekter begrænse nytten af ​​NIQPM og HTDIC genstande spænder i størrelse fra 0,2 op til 10 og 20 um i diameter, hhv. Derfor skal prøven og tilhørende tid dynamik af interesse mødes vis størrelse og tidsmæssige begrænsninger for at muliggøre anvendelsen af ​​disse metoder på typiske "off-the-shelf" instrumenter. Spændende er de fleste faste cellulære prøver let undersøgt med disse metoder.

En oversigt over NIQPM og HTDIC protokoller er givet i figur 1. I figur 2 illustrerer vi optimal og suboptimal gennem fokus billeddannelse under både lave og høje NA lysforhold for både lyse felt og DIC billedsprog. Figur 3 og 4 demonstrere parameter afhængighed af NIQPM algoritmen fremhæve vellykkede og mislykkede implementeringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Mikroskop Specifikationer

At udføre billedbehandling i den korrekte måde mikroskop skal have følgende specifikationer:

  1. Besidder både kontrast differential interferens (DIC) og lysfelt (BF) kontrast.
  2. Har computer-kontrollerede z-aksen bevægelse.
  3. Har en justerbar blænde stop for at variere kondensatorlinseenheden numeriske åbning. En åbning med en gradueret regel eller elektronisk udlæsning ønskes at kende værdien af ​​den numeriske åbning. Den numeriske åbning bør ligge mellem 0,1 for NIQPM op til 0,9 (eller højere) for HTDIC.
  4. Mikroskopet skal have et snævert bånd farvefilter at blive udnyttet til lyse felt billeddannelse. Dette filter er forpligtet til at fastsætte det refraktive tilvækst, en bølgelængde-afhængige fremstilling anvendes til at konvertere fase til massefylde for NIQP.

2. Differential Interference Contrast (DIC) Z-stack Acquisition

  1. Åbn SlideBook software ennd oprette et nyt dias til billedsamling.
  2. Dernæst åbner Focus Window. Under Filter Set skal du vælge DIC. På fanen Omfang under kondensatoren sektionen justere blænden skyderen til længst til højre position (åbne hele vejen). Dette giver høj numerisk blænde belysning og forbedrer optisk sektionering af prøven.
  3. Fokus på prøve ved hjælp DIC mål. Juster halogenlampen intensitet indtil prøven er let synlige. For at sikre, at kameraet ikke bliver mættet, skal du vælge fanen kamera i Focus Window og kontrollere, at histogrammet af pixel intensiteter er inden for det dynamiske område af kameraet.
  4. Åbn Billedoverførsel vinduet. I Capture sektionen, kontrollere 3D-kassen. I 3D Capture skal du vælge Range omkring centrum og vend tilbage til den aktuelle placering
  5. I Filter Set sektion af Image Capture-vinduet, skal du markere DIC og angiv eksponeringstid. I Billede afsnittet Oplysninger, navngive billedet (valgfrit), og vælg Start for at starte scanning.

3. Bright Field (BF) Z-stack Acquisition

  1. Når mikroskopet er færdig indsamle DIC Z-stak af prøven, skal du åbne Focus Window og vælg Åbn under Filter Set sektionen. Justere blænden skyderen til den længst til venstre position (lukket hele vejen) for at give lav NA belysning.
  2. Skift mikroskopet lysbanen filter til grøn. Juster halogenlampen intensitet indtil prøven er synlig. Sørg for der er ingen mætning af kameraet ved at vælge den
  3. Åbn Billedoverførsel vinduet. 3D Capture indstillinger fra Z-stack købet af DIC vil blive vist.
  4. I Filter Set sektion af Image Capture-vinduet, tjekker åbne boksen og angiv eksponeringstid. I Billede afsnittet Oplysninger, navngive billedet (valgfrit), og vælg Start for at starte Z-stack billede erhvervelse.

4.. Eksport af Z-stack billeder

  1. Åbn en Z-stack fange. Ændre visningen til 100%. Juster histogrammet af pixelværdier, der skal vises mellem 0 og den maksimale pixel værdien af ​​kameraet (4.095 til 12 bit-kameraer, 65.535 for 16 bit.).
  2. Vælg Vis> Eksporter> TIFF Series. Dette vil eksportere Z-stack som en serie af TIFF-billeder(Én for hver Z-plan). Gem TIFF-serien i en separat mappe med et navn, der har en understregning i slutningen (dvs. "DIC Stack 1_"). Gentag dette med hver DIC eller BF Z-stack.

5.. Volumenmålinger

  1. Åbn HTDIC MATLAB program med titlen "JoVE_HTDIC_v1.m".
  2. I henhold til § 0 i HTDIC program, opdatere afhængigheder biblioteket variabel. Kopier og indsæt mappe, der indeholder den hilbert_transform_dic.m og sobel_edge_detect.m filer fra explorer (PC) i mellem de enkelte anførselstegn efter "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 i JoVE_HTDIC_v1.m programmet.
  3. I § ​​1, opdatere "images_directory". Igen, kopiere og indsætte den mappe, der indeholder de gennemgående fokus billeder i. Tif form mellem de enkelte anførselstegn. Kør kun AFSNIT 1 gang.
  4. Justering og rotation af billeder til Hilbert omdanne Run § 2 i koden. En dialogboks med titlen "Define HTDIC parametre" vises. Fem numbers er påkrævet fra brugeren: brændplanet nummer, hvor DIC billede af prøven er i fokus, lateral opløsning (mM / pixel i billedet), den aksiale opløsning (dette er 0,1 for billede erhvervelse i 0,1 um aksiale trin), rotationsvinkel DIC billedet nødvendig for at udføre Hilbert transformation, typiske værdier er 45 og -135. Endelig indtaste regionen af ​​interesse størrelse, denne parameter definerer længden af ​​en side af en kasse, der efterfølgende vil blive vist - typisk værdi er 400. Klik på OK.
  5. Et billede af DIC fokusplan angivet af brændplanet vil blive vist med en blå boks. Placer kassen over den funktion af interesse, fx en celle. Boksen behøver ikke at være firkantet. Når kassen er blevet placeret over det ønskede område, dobbeltklik inde i boksen.
  6. Et andet tal vil nu blive vist: dette tal indeholder en beskåret og drejet billede af regionen af ​​interesse valgt i det foregående trin. Kontrasten i billedet skal være sådanat mørke funktioner vises til venstre, mens lyse funktioner vises til højre. Træk den blå boks over regionen af ​​interesse, omforme nødvendigt.
  7. Afsnit 3 genererer en maske til z-stak terning. Der er to typer af masker til rådighed: en rektangulær masker til at skabe et rektangel omkring cellen og en fri hånd værktøj til at skitsere cellen af ​​interesse ved hånden.
  8. For at generere en rektangulær maske, uncomment linie 167 og kommentar linie 170 (kommentere en linje ud ved at placere et "%" i starten af ​​denne linje). Udfør afsnit 3 i programmet. Klik på billedet og trække med musen for at begynde at definere den rektangulære maske. Dobbeltklik på boksen for at acceptere det.
  9. For at generere en håndtegnet maske, kommentar linie 167 og udkommentere linje 170 og udføre Afsnit 3. Klik og trække den ønskede maske med musen. Dobbeltklik på masken til at acceptere det.
  10. Kør Section 4to konstruere Hilbert transformerede DIC billedstak og den tilsvarende DIC billedstak af området af interesse.Masken bygget i afsnit 3, vil blive anvendt på Hilbert omdanne DIC stak og regelmæssig DIC stakken, når "maskON" er sat til 1 ved linie 179. Indstilling "maskON" til 0, vil konstruere billedstakke uden at anvende masken.
  11. Kør afsnit 5 for at optimere billedkvaliteten segmentering af xz tværsnitsarealet billeder af området af interesse for. Figur 500, produceret af programmet, synes at vise tre forskellige typer af kontrast. Succesen af ​​algoritmen til at finde grænserne af cellen er afhængig af en kombination af den brugte mask, og værdien af ​​"tærskel" på linje 229 i programmet. Begynd med en værdi på 0,5. Juster værdien af ​​tærsklen, og gentag denne del af programmet indtil den korrekte skitserer opnås på en af ​​kolonnerne.
  12. Hvis Disposition var bedst i kolonne 1, brug § 6 til at bestemme lydstyrken ved hjælp DIC billede segmentering. Hvis kolonne 2 gav optimale resultater, køre § 7 til at bestemme celle volumen fra Hilbert-transformeret DIC billedsprog. Hvis kolonne 3 GAVe de optimale resultater, køre Afsnit 8 for at bestemme lydstyrken ved hjælp Fourier-filtreret Hilbert-transformerede DIC billedsprog.
  13. Den målte volumen af ​​prøven, rapporteret i kubisk um (FL) er præsenteret i titlen på figur 600, 700 eller 800 er produceret af programmet, afhængigt af hvor måling volumen er valgt.

6.. Masse Målinger

  1. Åbn NIQPM MATLAB program med titlen "JoVE_NIQPM_v1.m".
  2. I henhold til § 0 i NIQPM programmet opdatere placeringen af ​​tre mapper, der er nødvendige for at køre programmet. Disse er "dependencies_directory," den "brightfield_directory" og "dic_directory".
  3. Dernæst, kør Afsnit 1. Denne sektion af kode genererer et lysfelt billede terning af hele området af det samlede sæt af billeder. Kør kun AFSNIT 1 gang.
  4. Dernæst, kør § 2.. En dialogboks med titlen "Define NIQPM parametre" vises. Fire numre er påkrævet fra brugeren: brændplanet nummer, hvor den lyse felt imagePrøven er i fokus, lateral opløsning (mM / pixel i billedet), den aksiale opløsning (dette er 0,1 for billede erhvervelse i 0,1 um aksiale trin), og området af interesse størrelse, denne parameter definerer længden af ​​en side af en boks, der efterfølgende vil blive vist - en typisk værdi er 200. Klik på OK.
  5. Et billede af den lyse felt fokusplan angivet af brændplanet vil blive vist med en blå boks.
    1. Hvis billedet ikke er i fokus, dobbeltklik på den blå boks og gentagelsen afsnit 2, skal du sørge for at justere brændplanet nummer i dialogboksen.
    2. Hvis billedet er i fokus, skal du trække den blå boks omkring billedet og ændre størrelse på det ved at vælge knudepunkter i kassen og trække dem om nødvendigt. Placer boks omkring funktionen af interesse, fx en celle. Boksen behøver ikke at være firkantet. Dobbeltklik inde i boksen for at acceptere det.
  6. Dernæst, kør § 3 for at konstruere en stak af lyse felt billeder beskåret til regionen irente.
  7. For at generere den fase kortet, pseudo DIC billede, og sammenligninger til lyse felt billedsprog og den sande DIC billede, køre afsnit 4.
  8. Med pseudo DIC og sande DIC billeder som lignende som muligt massetætheden kortet, samlede masse og histogram celletætheden kan bestemmes ved at køre afsnit 5a eller 5b. § 5a udfører automatiseret boarder påvisning af feltet - optimere "tærskel" på linje 300 - typiske værdier varierer mellem 0,1-1. Gentages dette afsnit efter behov for at optimere værdien af ​​tærsklen. § 5b udfører masse beslutsomhed, osv. efter at brugeren skitserer cellen af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Korrekt prøve belysning under billedet erhvervelse gennemgående fokus er afgørende for en vellykket gennemførelse af NIQPM en nd HTDIC algoritmer. I figur 2 illustrerer vi lav og høj NA belysning under både DIC og lyse felt kontrast til en polystyren kugle og den menneskelige kolorektal adenocarcinomcellelinie SW620. 2A, 2C, 2I, og 2K demonstrere optimal billeddannelse til NIQPM. Figurerne 2F, 2H, 2N, og 2P demonstrere optimal billeddannelse til HTDIC.

Figur 3 og 4 demonstrere parameter afhængighed af NIQPM algoritmen fremhæve både vellykkede og mislykkede implementeringer. I figur 3 vi udforske den fase profil af en 4,8 um diameter polystyren sfære - den forventede profil er kendt teoretisk og kan derfor sammenlignes direkte til NIQPM genopbygning. figur 2L.

Cellular prøver, hvis fase egenskaber er ikke kendt på forhånd, kan rekonstrueres ved hjælp NIQPM i forbindelse med en procedure for at sammenligne en "pseudo DIC" billede - beregnet ud fra den rekonstruerede fase - til en egentlig DIC billede, bestemt ud fra en direkte optisk måling, af cellen. NIQPM har en fri parameter - flyet i den lyse felt billedstak hvor beregningen er centreret. Dette centrale fokalplan bør justeres, indtil pseudo DIC og sande DIC billeder ser så ens som muligt. Figur 4E-G demonstrere en out-of-fokus pseudo DIC billede, et optimalt pseudo DIC billede og corresponding DIC billede af cellen taget med en belysning NA på 0,9. Interessant nok den bedste fase kort og tilsvarende pseudo DIC billedet ikke nødvendigvis svarer til en i fokus lyse felt billede, dvs. Figur 1A og 1B.

Endelig Figur 5 illustrerer de trin, der er involveret i HTDIC billedbehandlings-algoritme. Fra DIC gennem fokus billedsprog under NA = 0,9 belysning, 5A og 5D, Hilbert omdanne præformes at fjerne bas relief af DIC billederne, figur 5B og 5E. Dette kommer med nogle sløring langs den optiske akse, der kan fjernes fra high pass Fourier filtrering, figur 5C og 5F. Disse endelige billeder er nemt segmenteret for at bestemme det område i hvert tværsnit plan af prøven til at udlede det samlede cellulære volumen.

her.within-side = "altid"> Figur 1
Figur 1. NIQPM og HTDIC Workflow. (1). Mikroskopiske prøver såsom celler bør monteres på objektglas med dækglas anbringes over prøven hjælp Fluoromount G. (2). Gennem fokus billeder erhvervet under både DIC og lyse felt kontrast med en standard "off-the-shelf" mikroskop danner input til billedbehandling algoritmer. (3). Post-behandling af billeder i Matlab til at bestemme celle volumen fra DIC og cellulære massefordeling fra lyse felt billedsprog. (4). Kvantitative endpoint målinger:. Heat Maps og søjlediagrammer Klik her for at se en større version af dette tal.

igur 2 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50988/50988fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Gennem fokus DIC og lyse felt billeder af polystyren kugler og SW620 cellelinjer. De optimale billeddiagnostiske betingelser for NIQPM er lyse felt kontrast med 0,1 NA belysning. For HTDIC DIC, 0,9 NA belysning er optimal. (A, B) En står lysfelt billeder på 4,8 um diameter polystyren kugle underkastet 0,1 NA og 0,9 NA belysning, hhv. (C, D) Tværsnitsareal lyse felt billedsprog på 4,8 um diameter polystyren kugle underlagt 0,1 NA og 0,9 NA belysning, hhv. (E, F) En face DIC billedsprog på 4,8 um diameter polystyren kugle underlagt 0,1 NA og 0,9 NA belysning, hhv. (G, H) Tværsnitsareal DIC billedsprog på 4,8 um diameter polystyren kugle sed forbehold 0,1 NA og 0,9 NA belysning, hhv. (I, J) en Face lyse felt billeder af SW620 colorectal cancer cellelinie emne til 0,1 og 0,9 NA belysning, hhv. (K, L) Tværsnitsareal lyse felt billeder af SW620 celle underlagt 0,1 og 0,9 NA belysning, hhv. (M, N) En face DIC billeder af SW620 celle underlagt 0,1 NA og 0,9 NA belysning, hhv. (O, P) Tværsnitsareal DIC billeder af SW620 celle underlagt 0,1 NA og 0,9 NA belysning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Optimale og suboptimale fase rekonstruktioner:. 4,8 um diameter polystyren kugle Hver række undersøger brændplan afhængighed af en Face lyse felt intensitet (første søjle) og den rekonstruerede fase profil som brændplanet begynder ved midtpunktet gennem kuglen, z = 0 , og bevæger sig forbi dette plan i 1 um trin. (A, E, I, M) E n står lysfelt intensitet, (B, F, J, N) svarende fase genopbygning, (C, G, K, O) sammenligning af den rekonstruerede fase profil langs diagonalen af fase kort, blå cirkler, teoretisk fase profil i rødt, og producentens fejl tolerance, sorte streger, og (D, H, L, P) procent (%) fejl af den rekonstruerede phase med hensyn til den teoretiske fase profilen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4.. Optimale og suboptimale fase rekonstruktioner:. SW620 celle De to kolonner sammenligne suboptimale og optimale lyse felt billede fly (A, B), fra z-stakken til at centrere beregning fasen. De tilsvarende fase rekonstruktioner (C, D) anvendes til at generere en pseudo DIC billede (E, F). Disse er i forhold til den sande DIC billede, NA = 0,9 belysning i (G). Den pseudo DIC billede bedst matcher DIC billedet bestemmer de korrekte input billeder fra den lyse felt image stak til brug i fase genopbygning. Endelig fase kortlagt til den forventede massefylde (H, I). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Optimal DIC kontrastforbedring hjælp HTDIC: polystyrenkugler og SW620-celle. (A) Tværsnit DIC billeder af en 4,8 polystyren sfære, (B) svarende HTDIC billede, (C) Fourier filtreret HTDIC billede. Den aksiale dimension af kuglen billederne er blevet skaleret til at redegøre for brydningsindeks misforhold af prøven (1.597) og montering medier (1.4). (DF) viser de samme typer billede for en SW620 celler, dog med nogen refraktiv iVERSIGT mismatch korrektion på grund af den svage indeks kontrast af prøven. Ingen tærskling er udført på disse billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generelt NIQPM er en diffraktionsbegrænset teknik valideret på optiske sti-længder der spænder fra 0,25 til 44,7. Validering udførtes på n = 1,596 polystyrenkugler varierer i diameter fra 0,11 til 9,8 um suspenderet i Fluoromount G (data ikke vist). Celler besidder optiske sti-længder, der spænder fra næsten 0-7.

Ved måling af tæthed fordeling af en prøve kan man finde, at den pseudo DIC billedet ser fint, mens tætheden kortet besidder uønskede baggrund bidrag. Dette er på grund af støj i den lyse felt billedsprog af prøven bruges som input til NIQPM algoritme. To mulige ændringer af NIQPM metode kan bruges til at fjerne de uønskede baggrund bidrag: For det første kan man bruge længere eksponeringstider på at forbedre signal-støj i den lyse felt billedsprog. Dette er især kritisk, når billeddannelse optisk tynde prøver. Alternativt kan man reducere den aksiale afstand z-stak acquisition 0,1 til 0,05 m og gennemsnitlig 2-3 fly sammen, før indlæst dem i NIQPM algoritme.

HTDIC baserede volumen bestemmelse er blevet valideret på polystyren kugler spænder i diameter 1-20 um og er blevet cross-valideret med konfokal fluorescens mikroskopi 35.. Teknikken overvurderer mængden af ​​objekter under diffraktionsgrænsen af ​​systemet på grund af diffraktion virkninger forbundet med punktspredningsfunktionen af ​​optik.

Fejlfinding af HTDIC volumen beslutsomhed måske nødvendigt for små eller tynde prøver. Den primære kilde til fejl kommer fra billedet segmentering ved hjælp af den indbyggede Matlab Sobel-baserede kantdetektion anvendes til at bestemme grænserne af cellen i tværsnitsarealet billeder. Værdien for "tærskel" i afsnit 4 i den HTDIC program er afgørende for at opnå den bedste segmentering. Resultaterne tendens til at variere i en ikke-lineær måde - med små ændringer i "tærskel" drastically ændrer det lukkede område som følge af kantdetektering. Det nuværende program præsenterer brugeren med muligheder for at udføre billede segmentering fra enten DIC z-stak, det HTDIC z-stak, eller F-HTDIC z-stak.

DIC alene er ofte bedre for store prøver, mens HTDIC og F-HTDIC arbejde for mindre prøver (<5 um i diameter).

En maske kan øge effektiviteten af ​​fremgangsmåden til at segmentere billedet. Afsnit 2 giver brugeren mulighed for at bestemme en maske anvendes til billedet terningen. Vi anbefaler anvendelse af en rektangulær maske, der afkorter den horisontale (x-grad) af terningen, mens den lodrette (y-grad) konservering af terningen.

Sammenfattende NIQPM og HTDIC er teknologisk tilgængelige kvantitative billeddiagnostiske metoder, der kan udføres på standard "off-the-shelf" optiske mikroskoper, i modsætning til de fleste eksisterende metoder. Centralt for disse teknikker er gennem fokus billedsprog af prøven under caopriate billedbehandling betingelser: lav NA belysning til NIQPM, og højt NA belysning til HTDIC. De metoder, der præsenteres her, kan generaliseres til brug på andre end de viste her-systemer. De primære kriterier, der kræves for disse procedurer er et mikroskop, som brugeren har kontrol over z-bevægelse af scenen og evnen til at erhverve billeder som fokuspositionen i objektivlinsen varieres. De metoder, der præsenteres, er egnede til billeddannelse faste celler eller langsomt bevæger biologiske prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske interesser i det arbejde, præsenteres.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (U54CA143906 til KGP, OJTM og R01HL101972 til OJTM) og en Oregon Medical Research Foundation tidlige kliniske Investigator Award (KGP). OJTM er en American Heart Association Etableret Investigator (13EIA12630000). Vi takker Dr. Eric Anderson fra Knight Cancer Institute til at forberede celleprøver, der anvendes i dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany Axio Imager D2 Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm) Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont D540/25x Green filter
SlideBook 5.5 software Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado Image acquistion software
Polystyrene microspheres Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN PS06N Polystyrene spheres
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, Alabama 0100-01 Mounting media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
  2. Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
  3. Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
  4. Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
  5. Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
  6. Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
  7. Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
  8. Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
  9. Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
  10. Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
  11. Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
  12. Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
  13. Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
  14. Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
  15. Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
  16. Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
  17. Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
  18. Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
  19. Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
  20. Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
  21. Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
  22. Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
  23. Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
  24. Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
  25. Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
  26. Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
  27. Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  28. Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
  29. Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
  30. Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
  31. Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
  32. Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
  33. Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
  34. Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
  35. Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).

Tags

Bioteknik Label-fri optik kvantitativ mikroskopi cellulære biofysik cellemasse celle volumen celledensitet
Kvantitative optisk mikroskopi: Måling af Cellular Biophysical Features med en standard optisk mikroskop
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S.… More

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S. M., McCarty, O. J. T. Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope. J. Vis. Exp. (86), e50988, doi:10.3791/50988 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter