Abstract
Vi beskriver användning av en vanlig optiskt mikroskop för att utföra kvantitativa mätningar av massa, volym och densitet på cellprover genom en kombination av ljusa fält och differential interferens kontrast bildspråk. Två primära ansatser presenteras: noninterferometric kvantitativ fas mikroskopi (NIQPM), för att utföra mätningar av total cellmassa och subcellulära densitetsfördelning, och Hilbert trans differential interferens kontrast mikroskopi (HTDIC) för att bestämma volymen. NIQPM bygger på en förenklad modell av vågutbredning, benämnd paraxiala approximation, med tre underliggande antaganden: låg numerisk apertur (NA) belysning, svag spridning och svagt ljus absorberas av provet. Lyckligtvis ofärgade cellprover uppfyller dessa antaganden och låg NA belysning är lätt uppnås på kommersiella mikroskop. HTDIC används för att få volymetriska information från genom-fokus DIC bildspråk under högt NA Illumination förhållanden. Hög NA belysning möjliggör förbättrad sektione av provet längs den optiska axeln. Hilbert trans behandling på DIC bilden stackar kraftigt förbättrar kantdetekteringsalgoritmer för lokalisering av prov gränser i tre dimensioner genom att separera de grå värden för provintensiteten från dem i bakgrunden. De främsta fördelarna med NIQPM och HTDIC låg i sin tekniska tillgängligheten med hjälp av "off-the-shelf" mikroskop. Det finns två grundläggande begränsningar av dessa metoder: slow z-stack förvärvstiden på kommersiella omfattningar upphäver nu utredningen av fenomen snabbare än 1 frame / minut, och för det andra, diffraktionseffekter begränsar nyttan av NIQPM och HTDIC till objekt från 0,2 upp till 10 (NIQPM) och 20 (HTDIC) im i diameter, respektive. Därför måste provet och dess tillhörande tidsdynamik intresse möta viss storlek och tidsmässiga begränsningar för att möjliggöra användning av dessa metoder. Spännande, de flesta fasta cellular exemplar lätt undersökas med dessa metoder.
Introduction
Användning av optisk mikroskopi är nu överallt i utredningen av cellulära organismer. På grund av deras låga endogena absorbans och svag spridande egenskaper över det synliga optiska spektrumet, har cellerna inte starkt påverkar amplituden av optiska vågor som trafikerar dem och på så sätt verkar halv när avbildas med vanliga ljusa fält mikroskop. Cellulära prover gör dock bromsa optiska vågor som färdas genom dem på ett sätt som är linjärt relaterad till mängden av lokala massdensitet i en speciell region av utrymme genom vilket ljus färdas. Utnyttjande av denna heterogena tidsfördröjning eller "fas" profil för optiska vågor som sänds genom mikroskopiska prover beskrevs första gången 1935 av Frits Zernike 1 och experimentellt realiseras av Zernikein 1942 2. Zernike fick Nobelpriset 1953 för denna bedrift. Zeiss kommersialiserade denna stödform 1945 3. 1955, Smith och NomarskJag skulle presentera sitt inledande arbete om användningen 4 och teori 5 av differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, en modalitet som använder den rumsliga gradienten av fas som en kontrast mekanism. DIC kommersialiserades av Zeiss i 1965in nära samarbete med Nomarski 6. År 1981, två laboratorier visade den första inspelade levande cell DIC bildspråk med införlivandet av videokameror i optik tåget av DIC mikroskop 7, 8. En tid präglad av levande cell imaging föddes.
Sedan dess har utförandet av både faskontrast och DIC på kommersiella mikroskop i stort sett varit oförändrad. Dessa metoder är huvudsakligen används av biologer för att producera bilder av celler för kvalitativa syften: övervakning av morfologi, spårning av subcellulära strukturer, och undersökningar av membrandynamik 9. Dessa tekniker är kvalitativ i deras "off-the-shelf"-konfiguration som både fas och DIC-bilder är godtyckliga funktioner av ljuskällan intensitet, optiken inställningar belysning, och CCD-kamera vinst, gamma, och exponeringsinställningar.
En liten legion av fysiker och optiska ingenjörer har strävat efter att göra kommersiella avbildningsmetoder kvantitativ. Bland de första försök var två brev till naturen i 1952 och 1953 där läkaren som blev biofysiker Robert Barer visat att användningen av fas mikroskopi för att bestämma celltorrvikt celler genom att uppskatta fasförskjutningar genom dessa celltyper med hjälp av en kommersiellt tillgänglig fas mikroskop 10, 11. Fältet har utvecklat en mångfald av tekniker under de följande åren uppbyggd kring tre grundläggande märkningsfria kontrastmekanismer: fas mikroskopi 10,11, DIC mikroskopi 12-17, och ljusa fält 18-22 för att bestämma optisk väg-längd, fas, mass densitet, brytningsindex, och cellulär volym.
I parallel, en stor samling av anpassade optiska instrument har också utvecklats sedan 1950-talet, och har gjort långtgående optiska mätningar allt från applikationer i parasittillväxten 23, att dokumentera cellcykeln 24 att utreda membran dynamiken i röda blodkroppar 25. Framför allt har de senaste tio åren sett en uppsjö av etikett-fri kvantitativ mikroskopi i form av diffraktion fas mikroskopi 26, tomografisk fas mikroskopi 27, digital holografisk mikroskopi 28, fas känslig optisk koherens mikroskopi 29, Spatial Light störningar mikroskopi 30, Hilbert fasmikroskopi 31, och kvantitativ fas-mikroskopi 32. Trots deras kollektiva framgångar, har dessa instrument inte spridits till det större området biologiska forskare som grund, för det mesta, till deras komplexa instrument och beräkningskraven.
Häri vi describe att använda en vanlig optiskt mikroskop för att utföra kvantitativa mätningar av massa, volym och densitet på cellprover genom en kombination av ljusa fält och DIC bildspråk. Två primära metoder presenteras: noninterferometric kvantitativ fas-mikroskopi (NIQPM), för att utföra mätningar av den totala cellmassan och subcellulära fördelningen densitet och Hilbert-trans differentiell interferenskontrast mikroskopi (HTDIC), för att bestämma volymen. De främsta fördelarna med NIQPM och HTDIC låg i sin tekniska tillgängligheten. De avbildnings villkor som krävs för ett framgångsrikt genomförande ligger inom ramen för normal drift av de flesta kommersiellt tillgängliga mikroskop. Dessutom är efterbehandlings algoritmer är stabil, snabb och robust - efter att ha implementerats i MATLAB med hjälp av snabb Fouriertransform (FFT) baserade algoritmer när det är möjligt.
NIQPM är en metod för att rekonstruera fasen och den axiellt integrerad massdensitet av cellular exemplar från ljusa fält bildspråk. Summering av detta axiellt integrerade massa densitet över området av provet ger den totala torrvikt halt av provet. Den NIQPM Protokollet är baserat på de experimentella grunden lagts av Paganin och Nugent 18, 19 - där det visades att fasen profilen för en cell kan rekonstrueras från genom-fokus ljusa fält bilder av provet - och det teoretiska arbetet av Frank , Altmeyer, och Wernicke 20 - på att lösa de axelparallella våg modellerna på ett effektivt FFT-baserade sätt. Anslutningen av fasen till den torra massdensitet är baserad på arbete av Barer 10, 11 och Popescu 33.
Volumetric information kan erhållas från genom-fokus DIC bildspråk under höga NA belysningsförhållanden som möjliggör optisk sektionering av provet längs den optiska axeln. Hilbert trans bearbetning på DIC bildstaplar kraftigt förbättrarkantdetekteringsalgoritmer för lokalisering av de preparat gränser i tre dimensioner genom att separera de gråa värdena för provet intensiteten från de hos bakgrunden. Detta arbete har sitt ursprung med Arinson et al. 34 även om vi har infört både Fourier filtreringsmetoder för att öka kontrasten och en Sobel-baserade kantdetekteringsmetod för automatiserad volyme analys av provet. Vi har även validerat HTDIC tidigare på sfärer polystyren varierar i storlek från diffraktionsgränsen upp till 20 nm i diameter 36.
Medan både NIQPM och HTDIC är tekniskt tillgängliga på grund av sin utveckling på kommersiella mikroskop, är de metoder som i grunden begränsas av hårdvarukonfigurationen av mikroskop själva. De primära begränsningar av dessa tekniker är tvåfaldigt: slow z-stack förvärvstiden på kommersiella tillämpningsområden, till följd av omräkning av hela provet scenen och inte bara objektiv, Begränsar för närvarande utredningen av fenomen snabbare än ungefär 1 bild / minut, och för det andra, diffraktionseffekter begränsar nyttan av NIQPM och HTDIC till objekt som varierar i storlek från 0,2 upp till 10 och 20 nm i diameter. Därför måste provet och dess tillhörande tidsdynamik av intresse möta viss storlek och tidsmässiga begränsningar för att möjliggöra användning av dessa metoder på typiska "off-the-shelf" instrument. Spännande, de flesta fasta cellulära prover lätt undersökas med dessa metoder.
En översikt av NIQPM och HTDIC protokoll ges i figur 1. I figur 2 illustrerar vi optimal och suboptimal genom-fokus avbildning i både låg och hög NA belysningsförhållanden för både ljusa fält och DIC bildspråk. Figur 3 och 4 visar parameterberoendet av NIQPM algoritmen lyfta lyckade och misslyckade implementeringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroskop Specifikationer
För att utföra bildbehandling på rätt sätt mikroskopet ska ha följande specifikationer:
- Besitter både differential interferens kontrast (DIC) och ljusfält (BF) kontrast.
- Har datorstyrd z-axelrörelse.
- Har en justerbar bländare för att variera kondensorlins numerisk apertur. En öppning med en graderad regel eller elektronisk avläsning krävs för att veta värdet på den numeriska aperturen. Den numeriska bländaröppningen bör sträcka sig från 0,1 till NIQPM upp till 0,9 (eller högre) för HTDIC.
- Mikroskopet bör ha ett smalt band färgfilter för att utnyttjas för ljust fält avbildning. Detta filter krävs för att fixa brytningssteg, en våglängdsberoende ning som används för att konvertera fas till masstätheten för NIQP.
2. Differential interferenskontrast (DIC) Z-stack Förvärv
- Öppna Slidebook mjukvara ennd skapa en ny bild till bildsamling.
- Därefter öppnar Focus fönstret. Under Filter Set, välj DIC. På fliken Omfattning, under kondensor avsnittet, justerar bländar reglaget till längst rätt läge (öppna hela vägen). Detta ger hög numerisk apertur belysning och förbättrar optisk sektionering av provet.
- Fokus på provet med hjälp av ett DIC mål. Justera halogenlampa intensitet tills provet är väl synlig. För att säkerställa att kameran inte är mättad, välj fliken Camera i Focus fönstret och kontrollera att histogrammet för pixelintensiteter ligger inom det dynamiska området för kameran.
- Öppna fönstret Bildinsamling. I Capture Type sektionen, kontrollera 3D-rutan. I 3D Fånga avsnittet, markera området runt centrum och tillbaka till nuvarande plats
- I Filter Set delen av fönstret Bildinsamling, kontrollera DIC och ange exponeringstiden. I avsnittet Bildinformation, namnge bilden (valfritt) och välj Starta för att starta bild.
3. Ljusa fält (BF) Z-stack Förvärv
- När mikroskopet har slutat samla DIC Z-stack av provet, öppnar Focus fönstret och välj Öppna under Filter Set avsnittet. Justera bländar reglaget till längst vänster läge (stängt hela vägen) för att ge låg NA belysning.
- Ändra mikroskop Ijusväg filter till grönt. Justera halogenlampa intensitet tills provet är synlig. Se till att det inte finns någon mättnad av kameran genom att välja
- Öppna fönstret Bildinsamling. 3D Fånga inställningar från DIC Z-stack förvärvet kommer att visas.
- I Filter Set delen av fönstret Bildinsamling, kontrollera OPEN och ange exponeringstiden. I avsnittet Bildinformation, namnge bilden (valfritt) och välj Start för att initiera Z-stack bildtagning.
4. Exportera Z-stack bilder
- Öppna en Z-stack capture. Ändra vyn till 100%. Justera histogram av pixelvärden som ska visas mellan 0 och det maximala pixelvärdet på kameran (4095 för 12 bit-kameror, 65.535 för 16 bit.).
- Välj Visa> Exportera> TIFF-serien. Detta kommer att exportera Z-stack som en serie av TIFF-bilder(En för varje Z-planet). Spara TIFF-serien i en separat mapp med ett namn som har ett understreck i slutet (dvs. "DIC Stack 1_"). Upprepa detta med varje DIC eller BF Z-stack.
5. Volume Measurements
- Öppna HTDIC MATLAB program med titeln "JoVE_HTDIC_v1.m".
- Enligt § 0 av HTDIC programmet, uppdatera beroenden katalog variabeln. Kopiera och klistra in den katalog som innehåller hilbert_transform_dic.m och sobel_edge_detect.m filer från Explorer (PC) i mellan apostrof efter "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 av JoVE_HTDIC_v1.m programmet.
- I avsnitt 1, uppdatera "images_directory". Återigen, kopiera och klistra in den katalog som innehåller genom-fokus bilder i. Tif form i mellan enkla citationstecken. BARA KÖR AVSNITT 1 GÅNG.
- Justering och rotation av bilder för Hilbert-trans Kör avsnitt 2 i koden. En dialogruta med titeln "Definiera HTDIC parametrar" visas. Fem numbers krävs från användaren: fokalplanet nummer där DIC bild av provet är i fokus,, (det är 0,1 för bildtagning i 0,1 ìm axiella steg) lateral upplösning (nm / pixel i bilden) den axiella upplösning, rotationsvinkeln av DIC-bild krävs för att utföra den Hilbert-transformen, är typiska värden 45 och -135. Slutligen anger regionen av intresse storlek, definierar denna parameter längden av en sida av en låda som senare kommer att visas - typiskt värde är 400. Klicka på Ok.
- En bild av DIC fokalplan anges av fokalplanet numret kommer att visas med en blå låda. Placera rutan över området av intresse, t.ex. en cell. Lådan behöver inte vara fyrkantig. När boxen har placerats över den önskade regionen, dubbelklicka inuti lådan.
- En annan siffra visas nu: denna siffra innehåller en beskuren och roterade bilden av regionen av intresse som valts i föregående steg. Kontrasten i bilden bör vara sådanatt mörka funktioner visas till vänster medan ljusa funktioner visas till höger. Dra den blå rutan över det intressanta området, omforma behov.
- Avsnitt 3 genererar en mask för z-stack kub. Det finns två typer av masker tillgängliga: en rektangulär mask för att skapa en rektangel runt cellen och en fri hand verktyg för att beskriva cellen av intresse för hand.
- För att generera en rektangulär mask, kommentera bort linje 167 och kommentarsrad 170 (kommentera en rad ut genom att placera ett "%" i början av den raden). Utför avsnitt 3 i programmet. Klicka i bilden och dra musen för att börja definiera rektangulära masken. Dubbelklicka på rutan för att acceptera det.
- För att generera en handritade mask, kommentarsrad 167 och kommentera bort linje 170 och exekvera Avsnitt 3. Klicka och dra önskad mask med musen. Dubbelklicka på masken för att acceptera det.
- Kör § 4to konstruera Hilbert förvandlas DIC bildstapel och motsvarande DIC bildstapel av det intressanta området.Masken konstruerade i avsnitt 3 kommer att tillämpas på den Hilbert trans DIC stacken och den vanliga DIC stacken när "maskON" är satt till 1 på linje 179. Inställning "maskON" till 0 kommer att bygga bildstaplar utan att masken.
- Kör 5 § för att optimera bildsegmentering av xz tvärsnittsbilder av regionen av intresse. Figur 500, producerad av programmet, öppnas som visar tre olika typer av kontrast. Framgången av algoritmen för att finna gränserna för cellen är beroende av en kombination av den mask som används för och värdet av "tröskel" på rad 229 av programmet. Börja med ett värde på 0,5. Justera värdet på tröskeln och köra denna del av programmet tills korrekt skisse uppnås i en av kolumnerna.
- Om Disposition var bäst i kolumn 1, använd 6 § för att bestämma volymen med DIC bildsegmentering. Om kolumn 2 gav optimala resultat, kör 7 § för att bestämma cellvolym från Hilbert-trans DIC bildspråk. Om kolumn 3 GAVe de optimala resultat, kör 8 § för att bestämma volym med Fourier-filtrerad Hilbert-trans DIC bildspråk.
- Den uppmätta volymen av provet redovisas i kubisk xm (fl) presenteras i rubriken till fig 600, 700 eller 800 som produceras av programmet beroende på vilken volymmätning väljs.
6. Mass Mätningar
- Öppna NIQPM MATLAB program med titeln "JoVE_NIQPM_v1.m".
- Enligt § 0 i NIQPM programmet, uppdatera placeringen av tre kataloger som behövs för att köra programmet. Dessa är de "dependencies_directory," den "brightfield_directory" och "dic_directory."
- Därefter kör Avsnitt 1. Denna sektion av koden alstrar en ljus fältbild kuben på fullt fält av hela den uppsättning av bilder. BARA KÖR AVSNITT 1 GÅNG.
- Därefter kör 2 §. En dialogruta med titeln "Definiera NIQPM parametrar" visas. Fyra siffror krävs från användaren: fokalplanet nummer där det ljusa fältet bilden avprovet är i fokus,, (det är 0,1 för bildtagning i 0,1 ìm axiella steg) lateral upplösning (nm / pixel i bilden) den axiella upplösning, och det intressanta området storlek, definierar denna parameter längden av en sida av en box som senare kommer att visas - ett typiskt värde är 200. Klicka på Ok.
- En bild av det ljusa fältet fokalplan anges av fokalplanet numret kommer att visas med en blå låda.
- Om bilden inte är i fokus, dubbelklicka på den blå rutan och repris avsnitt 2, se till att justera fokalplanet numret i dialogrutan.
- Om bilden är i fokus, dra den blå rutan runt bilden och ändra storlek på den genom att välja noder i lådan och dra dem vid behov. Placera ruta runt kännetecknet av intresse, t.ex. en cell. Lådan behöver inte vara fyrkantig. Dubbelklicka i rutan för att acceptera det.
- Därefter kör 3 § att bygga en stapel av ljusa fält bilder beskärs för att regionen itresse.
- För att generera fas kartan, pseudo DIC bild, och jämförelser med ljusa fält bildspråk och den sanna DIC bild, kör 4 §.
- Med pseudo DIC och sanna DIC bilder så lika som möjligt masstätheten kartan, totalvikten och histogram av celltätheten kan bestämmas genom att köra Avsnitt 5a eller 5b. Avsnitt 5a utför automatiserad gränsen upptäckt av fältet - optimera "tröskel" på rad 300 - typiska värden varierar mellan 0,1-1. Repris detta avsnitt som behövs för att optimera värdet på tröskeln. Avsnitt 5b utför bestämning av massan etc. efter att användaren beskriver cellen av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt provbelysning under genom-fokus bilden förvärvet är avgörande för ett framgångsrikt genomförande av NIQPM en nd HTDIC algoritmer. I figur 2 illustrerar vi låg och hög NA belysning i både DIC och ljusa fält kontrast för en polystyren sfär och den mänskliga kolorektal adenocarcinom cellinje SW620. Figurerna 2A, 2C, 2I, och 2K demonstrera optimal avbildning för NIQPM. Figurerna 2F, 2H, 2N, och 2P visar optimal avbildning för HTDIC.
Figurerna 3 och 4 visar parameterberoendet hos NIQPM algoritm belysa både lyckade och misslyckade implementeringar. I fig 3 vi utforska fasen profilen av en polystyren sfär 4,8 fim diameter - den förväntade profilen är känt teoretiskt och kan därför jämföras direkt till NIQPM rekonstruktion.
Cellular exemplar, vars fas egenskaper är inte kända på förhand, kan rekonstrueras med hjälp NIQPM i samband med ett förfarande för att jämföra en "pseudo DIC" image - beräknad från den rekonstruerade fas - till en faktisk DIC bild, bestäms utifrån en direkt optisk mätning, av cellen. NIQPM har en fri parameter - planet i den ljusa fältbildstapel där beräkningen är centrerad. Denna centrala fokalplanet justeras tills pseudo DIC och sanna DIC bilder ser så lika som möjligt. Figurerna 4E-G visar en out-of-fokus pseudo DIC bild, en optimal pseudo DIC bild, och corresponding DIC bild av cellen tas med en belysning NA på 0,9. Intressant, gör den bästa fasen kartan och motsvarande pseudo DIC bild inte nödvändigtvis motsvara en i fokus ljusa fält bild, dvs. Figurerna 1A och 1B.
Slutligen Figur 5 illustrerar de steg som ingår i HTDIC bildbehandlingsalgoritm. Från DIC genom fokusbildspråk i NA = 0,9 belysning, figurer 5A och 5D, Hilbert-trans sker ofta för att ta bort bas relief av DIC bilder, figurer 5B och 5E. Detta kommer med en del oskärpa längs den optiska axeln som kan tas bort från högpass Fourier-filtrering, figurerna 5C och 5F. De sista bilderna är lätt segmenterad att bestämma området i varje tvärsnittsplan av provet för att sluta den totala cellvolymen.
her.within-page = "alltid"> 
Figur 1. NIQPM och HTDIC Workflow. (1.) Mikroskopiska prover såsom celler ska monteras på objektglas med täckglas som fästs över provet med hjälp Fluoromount G. (2.) Genom oskärpa förvärvats enligt både DIC och ljusa fält kontrast med en standard "off-the-shelf" mikroskop bildar ingången till bildbehandlingsalgoritmer. (3.) Efterbehandling av bilder i MATLAB för att bestämma cellvolym från DIC och cellmassfördelning från ljusa fält bildspråk. (4.) Kvantitativa endpoint mått:. Värmekartor och stapeldiagram Klicka här för att se en större version av denna siffra.
igure 2 "fo: innehåll-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/50988/50988fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Genom fokus DIC och ljusa fält bilder av polystyren sfärer och SW620 cellinjer. De optimala avbildningsvillkor för NIQPM är ljusa fält kontrast med 0,1 NA belysning. För HTDIC DIC, är 0,9 NA belysning optimal. (A, B) En möter ljusa fält bilder på 4,8 ìm diameter polystyren sfär föremål för 0,1 NA och 0,9 NA belysning, respektive. (C, D) Tvärsnitts ljusa fält bilder på 4,8 ìm diameter polystyren sfär föremål för 0,1 NA och 0,9 NA belysning, respektive. (E, F) en face DIC bilder av 4,8 | im diameter polystyren sfär med förbehåll för 0,1 NA och 0,9 NA belysning, respektive. (G, H) Tvärsnitts DIC bildspråk på 4,8 ìm diameter polystyren sfär sm inte annat följer 0,1 NA och 0,9 NA belysning, respektive. (I, J) Sv möter ljusa fält bilder av SW620 kolorektal cancer cellinje föremål för 0,1 och 0,9 NA belysning, respektive. (K, L) Tvärsnitts ljusa fält bilder av SW620 cell föremål för 0,1 och 0,9 NA belysning, respektive. (M, N) En yta DIC bilder av SW620 cell föremål för 0,1 NA och 0,9 NA belysning, respektive. (O, P) tvärsnitts DIC bilder av SW620 cell föremål för 0,1 NA och 0,9 NA belysning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Optimala och suboptimala fas rekonstruktioner:. 4,8 ìm diameter polystyren sfär Varje rad undersöker fokalplan beroende av en ansikte ljusa fältstyrka (första kolumnen) samt den rekonstruerade fas profil som fokalplanet börjar vid mittpunkten genom sfären, z = 0 , och rör sig förbi detta plan i en ìm steg. (A, E, I, M) E n ansikte ljust fältintensitet, (B, F, J, N) motsvarande fas rekonstruktion, (C, G, K, O) jämförelse av den rekonstruerade fas profilen längs diagonalen av fas karta, blå cirklar, teoretisk fas profil, i rött, och tillverkarens feltolerans, svarta linjer, och (D, H, L, P) procent (%) fel av den rekonstruerade phase i förhållande till den teoretiska fasen profilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Optimala och suboptimala fas rekonstruktioner:. SW620 cell De två kolumner jämföra suboptimala och optimala ljus fältbildplanen (A, B) från z-stack för att centrera beräkningsfasen. Motsvarande fas rekonstruktioner (C, D) används för att generera en pseudo DIC bild (E, F). Dessa jämförs med den verkliga DIC bild, NA = 0,9 belysning, i (G). Den pseudo DIC bild bäst matchar DIC bilden bestämmer rätt ingångsbilder från den ljusa fält imaGE stacken för användning i fas rekonstruktion. Slutligen fas mappas till den planerade massdensitet (H, I). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Optimal DIC kontrastförstärkning med hjälp HTDIC: polystyren sfärer och SW620 cell. (A) Tvärsnitts DIC bildspråk av en 4,8 polystyren sfär, (B) motsvarande HTDIC bild, (C) Fourier filtrerad HTDIC bild. Den axiella dimensionen av sfären bilderna har skalats till svars för brytningsindex obalans av provet (1.597) och monteringsmedia (1,4). (DF) visar samma bildtyper för en SW620 cell, dock utan brytnings index felpassningskorrektion på grund av den svaga index kontrasten av provet. Ingen tröskel har utförts på dessa bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I allmänhet är NIQPM en diffraktionsbegränsad teknik kontrollerats den optiska väg-längden varierar från 0,25 till 44,7. Validering utfördes på n = 1,596 sfärer polystyren varierar i diameter från 0,11 till 9,8 | im suspenderades i Fluoromount G (data ej visade). Celler har optisk väg-längder som sträcker sig från nästan 0-7.
Vid mätning av fördelningen av ett exemplar täthet man kan finna att den pseudo DIC bilden ser bra ut medan tätheten kartan besitter oönskade bakgrunds bidrag. Detta är på grund av brus i det ljusa fältet bildspråk av provet som används som insignal till den NIQPM algoritm. Två möjliga modifieringar av NIQPM metod kan användas för att eliminera de oönskade bakgrunds bidrag: för det första kan man använda längre exponeringstider för att förbättra signal-till-brus i det ljusa fältet imagery. Detta är särskilt viktigt när avbildning optiskt tunna prover. Alternativt kan en minska det axiella avståndet av z-stack acquisitjon 0,1-0,05 um och genomsnittliga 2-3 plan tillsammans innan inmatning av dem i NIQPM algoritmen.
HTDIC baserade volymbestämning har validerats på sfärer polystyren varierar i diameter från 1 till 20 nm och har kors validerats med konfokal fluorescensmikroskopi 35. Tekniken överskattar den mängd objekt under diffraktionsgränsen av systemet på grund av diffraktionseffekter förknippade med punktspridningsfunktionen för optiken.
Felsökning av HTDIC volymbestämn kanske behövs för små eller tunna prover. Den främsta källan till felet kommer från bildsegmentering med hjälp av den inbyggda MATLAB Sobel-baserade kantdetektering används för att bestämma gränserna för cellen i tvärsnittsbilder. Värdet på "tröskeln" i avsnitt 4 i det HTDIC programmet är avgörande att få den bästa segmentering. Resultaten tenderar att variera på ett icke linjärt sätt - med små förändringar i "tröskel" drastically ändra inneslutna området till följd av kantdetektering. Det nuvarande programmet ger användaren med alternativ för att utföra bildsegmentering från antingen DIC z-stack, den HTDIC z-stack, eller F-HTDIC z-stack.
DIC ensam är ofta bättre för stora prover medan HTDIC och F-HTDIC arbete för mindre prover (<5 | im i diameter).
En mask kan förbättra förmågan hos den metod för att segmentera bilden. Sektion 2 ger användaren möjlighet att bestämma en mask för att tillämpas på bilden kuben. Vi rekommenderar användning av en rektangulär mask som trunkerar den horisontella (x-grad) av kuben och samtidigt bevara den vertikala (y-utsträckning) av kuben.
Sammanfattningsvis NIQPM och HTDIC är tekniskt tillgängliga kvantitativa avbildningsmetoder som kan utföras på standard "off-the-shelf" optiska mikroskop, till skillnad från de flesta befintliga metoder. Centralt för dessa tekniker är genom-fokus bildspråk av provet under caopriate avbildningsförhållanden: låg NA belysning för NIQPM och hög NA-belysning för HTDIC. De metoder som presenteras här kan generaliseras för användning på andra än de som visats här system. De primära kriterier som krävs för dessa förfaranden är ett mikroskop för vilken användaren har kontroll över z-rörelse av stadium och möjligheten att få bilder som fokalpositionen för objektivlinsen varieras. Metoderna som presenteras är lämplig för avbildning av fixerade celler eller långsamt rörliga biologiska prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska intressen i arbetet presenteras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (U54CA143906 till KGP, OJTM och R01HL101972 till OJTM) och en Oregon Medical Research Foundation Early Clinical Investigator Award (KGP). OJTM är en American Heart Association Etablerad Utredare (13EIA12630000). Vi tackar Dr Eric Anderson i Knight Cancer Institute för att förbereda cellprover som används i detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
References
- Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
- Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
- Blow, N.
- Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
- Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
- Lang, W.
- Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
- Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
- Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
- Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
- Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S,
- Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
- Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
- Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
- Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
- Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
- Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
- Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A.
- Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
- Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
- Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
- Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
- Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
- Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
- Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
- Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
- Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S.
- Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
- Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
- Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G.
- Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
- Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
- Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
- Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
- Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).
