Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Количественный оптическая микроскопия: Измерение Cellular биофизических Особенности с использованием стандартного оптического микроскопа

Published: April 7, 2014 doi: 10.3791/50988
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 2Department of Dermatology, Oregon Health & Science University, School of Medicine, 3Department of Cell & Developmental Biology, Division of Hematology & Medical Oncology, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, School of Medicine

Abstract

Мы описали использование стандартного оптического микроскопа для выполнения количественных измерений массы, объема и плотности на клеточных образцах путем сочетания светлого поля и дифференциальной интерференционной контрастной образов. Два основных подхода представлены: noninterferometric количественный фазовая микроскопия (NIQPM), для выполнения измерений общей массы клеток и внутриклеточной распределения плотности и преобразование Гильберта дифференциальное вмешательство контрастной микроскопии (HTDIC), чтобы определить объем. NIQPM основана на упрощенной модели распространения волн, называется параксиальном приближении, с тремя основных предположений: низкий числовая апертура (NA) освещения, слабым рассеянием и слабого поглощения света на образце. К счастью, неокрашенные сотовые образцы удовлетворяют эти предположения и низкой освещенности Н.А. легко достигается на коммерческих микроскопов. HTDIC используется для получения информации от объемной через фокус DIC изображений под высоким NA ILLUMINусловия Ation. Высокое освещение NA обеспечивает улучшенную секционирования образца вдоль оптической оси. Преобразование Гильберта обработку изображения DIC стеки значительно повышает алгоритмы обнаружения края для локализации образца границ в трех измерениях, разделяя серые значения интенсивности образца от тех фона. Основными преимуществами NIQPM и HTDIC лежал в своей технологической доступности, используя "вне-полке" микроскопы. Есть два основных ограничения этих методов: медленный Z-Stack время сбора на коммерческих областей в настоящее время отменяет расследование явлений быстрее, чем 1 кадра / мин, а во-вторых, дифракционные эффекты ограничивают полезность NIQPM и HTDIC к объектам от 0,2 до 10 (NIQPM) и 20 (HTDIC) мкм в диаметре, соответственно. Таким образом, образцы и связанный с ним время динамика интереса должны соответствовать определенный размер и временные ограничения для того, чтобы использование этих методов. Возбуждающе, наиболее фиксированной CELLULAг образцы легко исследованы с помощью этих методов.

Introduction

Использование оптической микроскопии является в настоящее время повсеместно в расследовании клеточных организмов. В связи с их низкой эндогенных поглощения и слабые рассеяния свойств более видимой оптического спектра, клетки не сильно влияют на амплитуду оптических волн, проходящих их и таким образом появляются полупрозрачные, когда изображается со стандартными микроскопов светлое поле. Сотовые образцы, тем не менее, замедлить оптических волн, распространяющихся через них таким образом, чтобы линейно связано с количеством местного плотности массы в конкретной области пространства, через которые свет путешествует. Использование этой гетерогенной временным лагом или "фазы" профиль оптических волн, прошедших через микроскопические образцов был впервые описан в 1935 году Фриц Цернике 1 и экспериментально реализован Zernikein 1942 2. Зернике была присуждена Нобелевская премия в 1953 за это достижение. Zeiss коммерческую этот механизм в 1945 году 3. В 1955 году Смит и Nomarskя бы представить свои первоначальные работы по применению 4 и теории 5 дифференциальной интерференционной отличие (ДВС-синдром) микроскопии, модальности, которая использует пространственный градиент фазы в качестве механизма контрастности. DIC был коммерческому Zeiss в 1965in тесном сотрудничестве с Nomarski 6. В 1981 году две лаборатории продемонстрировали первый записанный живой клетке DIC изображения с включением видеокамер в оптике поезде от ДВС микроскопом 7, 8. Родился Эпоха изображений живых клеток.

С этого времени, выполнение как фазового контраста и ДИК на коммерческих микроскопов во многом была неизменной. Эти методы в основном используются биологами для получения изображений клеток для качественных целей: мониторинг морфологии, отслеживания субклеточных структур и исследований динамики мембранных 9. Эти методы являются качественными в их "не совсем готовом виде" конфигурации, как по фазе и DIC изображения произвольные функции интенсивности источника света, настройки оптика освещение, и усиления ПЗС-камера, гамма, и настройки экспозиции.

Небольшой легион физиков и оптических инженеров стремится делать коммерческие диагностические методы количественной. Среди первых попыток были два письма природе в 1952 и 1953 годах, в которых врач, а ныне биофизик Роберт Барьер продемонстрировали использование фазовой микроскопии для определения клеточного сухой массы клеток путем оценки фазовых сдвигов через эти типы клеток с использованием коммерчески доступного фазовом микроскопе 10, 11. Поле разработала множество методов более последующие годы на основе вокруг трех основных этикеток без контрастных механизмов: фазовая микроскопия 10,11, ДВС микроскопии 12-17, и яркий полевых 18-22 определить оптическую путь длины, фазу массы плотность, показатель преломления, и клеточная объем.

В пунктеllel, большая коллекция пользовательских оптических приборов были разработаны с 1950 года, и сделали далеко идущие оптических измерений, начиная от применения в рост паразита 23, к документированию клеточный цикл 24 к исследованию мембранных динамику эритроцитов 25. В частности, за последние десять лет не видел богатство без наклеек количественного микроскопии в виде дифракционной фазовой микроскопии 26 томографического фазовой микроскопии 27, цифровой голографической микроскопии 28, фазовый чувствительной оптической когерентной микроскопии 29, пространственной интерференции света микроскопии 30 Гильберта фазовая микроскопия 31, и количественный фазовая микроскопия 32. Несмотря на их коллективных успехов, эти инструменты не были распространены в большей области биологических исследователей благодаря, в основном, для их комплексного приборов и вычислительных требований.

Здесь мы гописывать круг использование стандартного оптического микроскопа для выполнения количественных измерений массы, объема и плотности на клеточных образцах путем сочетания светлого поля и ДИК образов. Два основных подхода представлены: noninterferometric количественный фазовая микроскопия (NIQPM), для выполнения измерений общей массы клеток и внутриклеточной распределения плотности и преобразование Гильберта дифференциальное вмешательство контрастной микроскопии (HTDIC), чтобы определить, громкость. Основными преимуществами NIQPM и HTDIC лежал в своей технологической доступности. Условия формирования изображения, необходимые для их успешного выполнения находятся в пределах объема нормальной эксплуатации большинстве коммерчески доступных микроскопов. Кроме того, алгоритмы постобработки стабильны, быстрый и надежный - будучи реализованы в MATLAB, используя быстрое преобразование Фурье алгоритмы (БПФ), основанные когда это возможно.

NIQPM это метод для восстановления фазы и аксиально интегрированный массовую плотность челlular образцы из образов ярко поля. Суммирование этой оси интегральной плотности массы по площади образца дает общее массовое содержание сухого образца. Протокол NIQPM основана на экспериментальных основах, заложенных Paganin и Nugent 18, 19, - в котором было показано, что фаза профиль клетки могли быть восстановлены с помощью фокусировки светлом поле изображений образца - и теоретические работы Frank , Altmeyer и Вернике 20 - на решении параксиальных волновые модели в эффективной БПФ на основе образом. Соединение по фазе на сухую плотности массы основан на работе Барьер 10, 11 и 33 Попеску.

Объемный информация может быть получена из через фокус DIC изображений в условиях высокой освещенности НС, которые позволяют оптического секционирования образца вдоль оптической оси. Преобразование Гильберта обработку изображения стеков ОПК значительно повышаеталгоритмы обнаружения края для локализации образца границ в трех измерениях путем отделения серые значения интенсивности образца от тех фона. Эта работа происходит с Arinson др. 34. Хотя мы ввели как Фурье методы фильтрации для повышения контрастности и Собел основе метод обнаружения края для автоматизированного объемного анализа образца. Мы также подтвердили HTDIC ранее на полистирольных сфер размером от дифракционного предела до 20 мкм в диаметре 36.

Хотя оба NIQPM и HTDIC технологически доступной благодаря их развития на коммерческих микроскопов, эти методы принципиально ограничена аппаратной конфигурации самих микроскопов. Основные ограничения этих методов в два раза: медленно Z-Stack время сбора на коммерческих областей, в связи с переводом всей стадии образца, в отличие от всего объектива, В настоящее время ограничивает расследование явлений быстрее, чем примерно 1 кадр / мин, а во-вторых, дифракционные эффекты ограничивают полезность NIQPM и HTDIC к объектам площадью от 0,2 до 10 и 20 мкм в диаметре, соответственно. Таким образом, образец и связанные с временной динамики интерес должен соответствовать определенный размер и временные ограничения для того, чтобы использование этих методов на типичных «вне-полке" инструментов. Возбуждающе, большинство фиксированных сотовые образцы легко исследованы с помощью этих методов.

Обзор NIQPM и HTDIC протоколов приведены на рисунке 1. На рисунке 2 мы проиллюстрируем оптимальное и неоптимальный расфокусированной изображений под высоким и низким условиях NA освещения как для светлого поля и ДИК образов. 3 и 4 демонстрируют зависимость параметра алгоритма NIQPM подсветка удачные и неудачные реализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Микроскоп Характеристики

Для проведения томографии в правильном моды микроскоп должен иметь следующие технические характеристики:

  1. Обладают как дифференциальный интерференционный контраст (DIC) и светлого (BF) контрастности.
  2. Есть компьютерным управлением движением ось г.
  3. Уже регулируемый упор диафрагмы варьировать конденсатор объектива числовую апертуру. Отверстие с градуированной правило или электронного считывания требуется знать значение числовой апертуры. Числовая апертура должна быть в пределах от 0,1 для NIQPM до 0,9 (или выше) для HTDIC.
  4. Микроскоп должен иметь узкую цвета полоса фильтра, которые будут использоваться для работы с изображениями яркого поля. Этот фильтр необходим, чтобы исправить преломляющую приращение, длин волн зависит от фактуры, используемый для преобразования фазы в плотности массы для NIQP.

2. Дифференциальный интерференционного контраста (DIC) Приобретение Z-Stack

  1. Откройте ПРОГРАММУ Slidebookй создать новый слайд для коллекции изображений.
  2. Затем откройте окно фокус. Под фильтром, установленным разделе выберите DIC. На закладке Область действия в разделе Конденсатор, отрегулировать ползунок диафрагмы к дальней правой позиции (открыть всю дорогу). Это обеспечивает высокую числовой апертуры освещения и повышает оптическую секционирования образца.
  3. Сосредоточьтесь на образце с помощью цели DIC. Отрегулируйте интенсивность галогенные лампы, пока образец не хорошо просматривается. Для обеспечения камера не может быть насыщенной, выберите вкладку Камера в окне Фокус и убедитесь, что гистограмма интенсивностей пикселей в пределах динамического диапазона камеры.
  4. Откройте окно Image Capture. В разделе Тип Сбора, проверьте 3D окно. В 3D разделе Capture, выбора диапазона вокруг центра и вернуться к текущему местоположению
  5. В набор фильтров части окна Захват изображений, установите флажок DIC и указать время экспозиции. В разделе Информация об изображении на, назвать образ (не обязательно) и выберите Пуск, чтобы начать изображений.

3. Яркий поле (BF) Приобретение Z-Stack

  1. После того, как микроскоп закончил сбор DIC Z-Stack образца, откройте окно фокус и выберите Открыть под фильтр Set разделе. Отрегулируйте ползунок диафрагмы к самой дальней левой позиции (закрыт весь путь), чтобы обеспечить низкое освещение NA.
  2. Измените микроскопа фильтр светло-путь на зеленый. Отрегулируйте интенсивность галогенные лампы, пока образец не видна. Убедитесь, что нет насыщение камере, выбрав
  3. Откройте окно Image Capture. Будут показаны настройки 3D Capture от приобретения Z-Stack DIC.
  4. В набор фильтров части окна записи образа проверить поле Открыть и укажите время экспозиции. В разделе Информация об изображении на, назвать образ (не обязательно) и выберите Пуск, чтобы начать Z-Stack получения изображений.

4. Экспорт Z-Stack Images

  1. Откройте захват Z-стека. Измените вид на 100%. Отрегулируйте гистограмму значений пикселей, которые будут отображаться в диапазоне от 0 и максимальное значение пикселя камеры (4095 для 12 битных камеры, 65535 для 16 бит.).
  2. Выберите Вид> Экспорт> TIFF Series. Это будет экспортировать Z-Stack в виде серии изображений TIFF(По одному для каждого Z плоскости). Сохраните серию TIFF в отдельной папке с именем, который имеет знак подчеркивания в конце (то есть "ДИК Стек 1_"). Повторите это с каждым Z-Stack DIC или BF.

5. Объем Измерения

  1. Откройте программу HTDIC MATLAB под названием "JoVE_HTDIC_v1.m".
  2. В соответствии со статьей 0 из HTDIC программы, обновления переменной каталогов зависимостей. Скопируйте и вставьте каталог, содержащий hilbert_transform_dic.m и sobel_edge_detect.m файлы из проводника (PC) в между одинарные кавычки следующий "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 программы JoVE_HTDIC_v1.m.
  3. В разделе 1, обновить "images_directory". Опять же, скопируйте и вставьте каталог, содержащий через фокусе фотографий в. Виде TIF в между одинарные кавычки. Работать только РАЗДЕЛ 1 РАЗ.
  4. Выравнивание и вращение изображений для преобразования Гильберта Запустить раздел 2 кода. Появится диалоговое окно с названием «Определение HTDIC Параметры". Пять NumbeRS требуется от пользователя: в фокальной плоскости число, где изображение ДВС образца находится в фокусе, боковая разрешение (мкм / пиксель в изображении), осевое разрешение (это 0,1 для получения изображения в 0,1 мкм осевых ступеней), угол поворота изображения ДВС необходимо для выполнения преобразования Гильберта, типичные значения 45 и -135. Наконец, попадаем в область размером ставки, этот параметр определяет длину стороны ящика, который будет впоследствии появляются - типичное значение 400. Нажмите Ok.
  5. Изображение фокальной плоскости DIC указанного координационного числа плоскости появится с синей коробке. Установите флажок над ней и интересов, например, клетки. Коробка не должна быть квадратной. После того, как коробка была размещен над желаемой области, дважды щелкните внутри коробки.
  6. Другой показатель теперь появится: эта цифра содержит обрезанную и повернутый имиджа региона интереса выбранной на предыдущем шаге. Контрастность изображения должна быть такой,что темные черты появляются слева в то время как яркие черты появится справа. Перетащите синий ящик над интересующей области, изменить при необходимости.
  7. Раздел 3 генерирует маску для куба Z-Stack. Есть два вида масок в наличии: прямоугольная маска, чтобы создать прямоугольник вокруг ячейки и инструмент для свободного рисования наметить ячейку интереса вручную.
  8. Для создания прямоугольной маски, раскомментируйте строку 167 и комментарий линию 170 (комментировать линию путем размещения "%" в начале этой линии). Выполнить раздел 3 программы. Нажмите на изображении и перетащите мышь, чтобы начать определение прямоугольную маску. Дважды щелкните на поле, чтобы принять его.
  9. Чтобы создать рисованную маску, комментарий линию 167 и раскомментируйте строку 170 и выполнить Раздел 3. Нажмите и привлечь нужную маску с помощью мыши. Дважды щелкните на маску, чтобы принять его.
  10. Запустите Раздел 4to построить Гильберта превращается DIC стека изображений и соответствующий DIC изображения стопку интересующей области.Маска построены в разделе 3 будет применяться к преобразования Гильберта DIC стек и регулярное DIC стек, когда "maskON" устанавливается в 1 в строке 179. Установка "maskON" 0 построят стеки без нанесения маски.
  11. Запустите раздел 5 оптимизировать сегментацию изображения креста XZ секционных изображений интересующей области. Рисунок 500, создаваемых программой, отображающий три различных типа контраста. Успех алгоритма, чтобы найти границы ячейки зависит от комбинации маски, используемой и значение "порога" на линии 229 программы. Начните со значением 0,5. Регулировка величины порога и повторно этот раздел программы, пока надлежащее структурирование не будет достигнуто в одном из столбцов.
  12. Если структурирование был лучшим в колонке 1, используйте раздел 6 для определения объема помощи DIC изображения сегментацию. Если в колонке 2 дал оптимальные результаты, запустить раздел 7, чтобы определить объем клеток от Гильберта-трансформированной DIC образов. Если в колонке 3 гавэ оптимальные результаты, запустить раздел 8, чтобы определить объем помощи Фурье-фильтрованную Гильберта-преобразованный DIC образы.
  13. Измеренный объем образца, сообщается в кубической мкм (Флорида) представлена ​​в названии рисунке 600, 700, или 800, полученного в рамках программы в зависимости от которого выбирается измерение объема.

6. Массовые Измерения

  1. Откройте программу NIQPM MATLAB под названием "JoVE_NIQPM_v1.m".
  2. В соответствии со статьей 0 программы NIQPM, установить на трех каталогов, необходимых для запуска программы. Это «dependencies_directory," "brightfield_directory," и "dic_directory."
  3. Затем запустите Раздел 1. Эта часть кода создает светлое поле изображения куб полной области всего набора изображений. Работать только РАЗДЕЛ 1 РАЗ.
  4. Затем запустите Раздел 2. Появится диалоговое окно с названием «Определение NIQPM Параметры". Четыре номера требуется от пользователя: число фокальной плоскости, где светлое поле образОбразец находится в фокусе, боковая разрешение (мкм / пиксель в изображении), осевое разрешение (это 0,1 для получения изображения в 0,1 мкм осевых шагов), и область от размера ставки, этот параметр определяет длину стороны окно, в котором будут появляться - типичное значение составляет 200. Нажмите Ok.
  5. Образ яркий поля фокальной плоскости, заданной фокальной плоскости числа появится с синей коробке.
    1. Если изображение не в фокусе, дважды щелкните в синей коробке и запускать разделе 2, не забудьте настроить фокусное количество самолет в диалоговом окне.
    2. Если изображение находится в фокусе, перетащите синий прямоугольник вокруг изображения и изменить его размер, выбрав узлы коробки и перетаскивая их по мере необходимости. Расположите рамку вокруг особенностью интересов: например, клетки. Коробка не должна быть квадратной. Дважды щелкните внутри коробки, чтобы принять его.
  6. Затем запустите Раздел 3 построить стек изображений в светлом поле обрезается до области втерес.
  7. Для создания фазового карту, псевдо DIC изображение и сравнения с яркой образности поля и истинной DIC изображения, запускать раздел 4.
  8. С псевдо DIC и DIC истинные изображения как можно более близкими плотность массы карты, общей массой и гистограммы плотности клеток может быть определена путем запуска участок 5a или 5b. Раздел 5a осуществляет автоматизированное обнаружение любителям сноуборда полевого - Оптимизация «порога» в строке 300 - типичные значения от 0,1-1. Запустить повторно раздел мере необходимости, чтобы оптимизировать величину порога. Раздел 5б осуществляет определение массы и т.д. после того как пользователь описывает ячейку интересов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Правильное освещение образца во время через фокусе получения изображений имеет решающее значение для успешной реализации NIQPM а й HTDIC алгоритмов. На рисунке 2 мы проиллюстрируем низкой и высокой освещенности NA рамках как DIC и яркой поля отличие для сферы полистирола и человеческого колоректального линии клеток аденокарциномы SW620. 2А, 2С, 2I и 2К продемонстрировать оптимальную визуализацию для NIQPM. Цифры 2F, 2H, 2N, и 2P продемонстрировать оптимальную визуализацию для HTDIC.

На рисунках 3 и 4 демонстрируют зависимость параметра алгоритма NIQPM подчеркнув успешные и неуспешные реализации. На рисунке 3 мы исследуем фазовую профиля диаметром 4,8 мкм полистирола сфере - ожидаемый профиль известен теоретически и может, таким образом, по сравнению непосредственно к реконструкции NIQPM. рис 2L.

Сотовые образцы, чьи фаза свойства не известны априори, может быть восстановлена ​​с помощью NIQPM в сочетании с процедурой, чтобы сравнить "псевдо DIC" изображение - вычисленное по восстановленному фазе - к фактической DIC изображение, определяемого путем прямого оптического измерения, клетки. NIQPM имеет один свободный параметр - самолет в стеке светлопольной изображения, при котором расчет с центром. Этот центральный фокальной плоскости должна быть скорректирована до псевдо ДВС и истинные изображения DIC не смотреть как можно более близкими. Цифры 4E-G продемонстрировать вне фокуса псевдо ДВС изображения, оптимальное псевдо ДВС изображения и соответствг ДВС образ ячейки, взятой с подсветкой НС 0,9. Интересно, что лучшая фаза карта и соответствующий псевдо DIC изображение не обязательно должна соответствовать в фокус яркий изображение поля, а именно. Фиг.1А и 1В.

Наконец, на рисунке 5 показаны шаги в HTDIC алгоритма обработки изображений. С ДВС через фокусе снимкам в рамках NA = 0,9 освещения, рис 5а и 5d, преобразование Гильберта является предварительно удалить Барельеф изображений ОПК, рис 5B и 5E. Это приходит с некоторой размытостью вдоль оптической оси, которые могут быть удалены от фильтрации Фурье верхних частот, рис 5C и 5F. Эти окончательные изображения легко сегментирован для определения площади в каждой плоскости поперечного сечения образца, чтобы вывести общее сотовой громкости.

her.within страницах = "всегда"> Рисунок 1
Рисунок 1. NIQPM и HTDIC Workflow. (1.) Микроскопические образцы, такие как клетки должен быть установлен на предметные стекла микроскопа с защитным стеклом, прикрепленной по образцу с помощью Fluoromount G. (2). Через фокусе изображения, полученные в рамках как DIC и яркой поля отличие от стандарта "прет-а-шельф" микроскопом образуют вклад в алгоритмах обработки изображений. (3.) Пост-обработка изображений в среде MATLAB для определения объема клеток от ДВС и клеточную распределение масс от образности ярко поля. (4.) Количественные показатели конечных точек:. Тепловые карты и гистограммы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

На рис 2 "FO: содержание-шир =" 5 дюймов "Первоначально" / files/ftp_upload/50988/50988fig2highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 2. Через фокусе ДВС и яркий образность поле полистирола сферах и клеточных линий SW620. Оптимальные условия формирования изображений для NIQPM светлые поле контраст с 0,1 освещения НС. Для HTDIC ДВС, 0,9 Н.А. освещение является оптимальным. (А, В) в фас яркой образностью поля 4,8 диаметра мкм полистирола сферы субъекта до 0,1 NA и 0,9 Н.А. освещения, соответственно. (C, D) в поперечном сечении изображение светлое поле 4,8 мкм диаметром сферы полистирол, подлежащего 0,1 NA NA и 0,9 подсветки, соответственно. (E, F) Собственная лицо ДВС образность 4,8 диаметра мкм полистирола сферы субъекта до 0,1 NA и 0,9 Н.А. освещения, соответственно. (G, H) в поперечном сечении ДВС образность 4.8 Диаметр мкм полистирола сфера сubject до 0,1 NA и 0,9 Н.А. освещения, соответственно. (I, J) в фас яркой образностью полевую SW620 колоректального теме рак линии до 0,1 и 0,9 Н.А. освещения, соответственно. (K, L) поперечного сечения образы яркое поле SW620 тему клеток до 0,1 и 0,9 Н.А. освещение, соответственно. (M, N) Собственная лицо ДВС образность SW620 клеток при условии 0,1 NA и 0,9 Н.А. освещения, соответственно. (O, P) в поперечном сечении ДВС образность SW620 клеток при условии 0,1 NA и 0,9 Н.А. освещения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Оптимальные и субоптимальные фазовые реконструкции:. 4.8 Диаметр мкм полистирола сфера Каждая строка расследует фокальной плоскости зависимость анфас интенсивность светлое поле (первая колонка) и профиль восстановленный фазовый как в фокальной плоскости начинается в середине через сферу, г = 0 , и проходит мимо этой плоскости в 1 мкм шагов. (А, Е, I, M) E н сталкиваются интенсивность светлое поле, (B, F, J, N), соответствующий реконструкции фаза, (C, G, K, O) сравнение реконструированный фазового профиля вдоль диагонали фазы карта, синие круги, теоретическая профиль фаза, в красном, и терпимость ошибки производителя, черные линии, и (D, H, L, P) процента (%) погрешность восстановленного рHase по отношению к теоретическим фазовым профилем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Оптимальные и субоптимальные фазовые реконструкции:. SW620 клеток Две колонки сравнить неоптимальных и оптимальных светлое поле изображения самолетов (A, B) из Z-Stack для центрирования расчет фаз. Соответствующие фазовые реконструкции (C, D) используются для создания псевдо DIC изображение (E, F). Они по сравнению с истинной DIC изображения, NA = 0,9 освещение, в (G). Псевдо DIC изображение лучше соответствуя изображение DIC определяет правильный вход изображения с яркой области ИМАGE стек для использования в восстановлении фазы. Наконец, фаза переходит в проектируемой массовой плотности (H, I). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Оптимальное ДВС повышение контрастности с помощью HTDIC: полистирольные сферы и SW620 клеток. Фильтруют (А) поперечного сечения DIC образы 4,8 полистирола сферы, (B), соответствующее HTDIC изображение, (C) HTDIC Фурье изображения. Осевой размер сферы изображений были расширены для учета преломления несовпадения образца (1,597) и монтажной сред (1.4). (DF) демонстрируют те же типы изображений для SW620 клетки, однако, без преломления INDEX несоответствие коррекции из-за слабой индекса отличие образца. Нет порога не была выполнена на этих изображениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В общем, NIQPM является методом дифракционной утверждена оптических путем длиной от 0.25-44.7. Проверка проводилась на п = 1,596 полистирольные сферы диаметром от 0.11-9.8 мкм, суспендированных в Fluoromount G (данные не показаны). Клетки обладают оптического пути длин, которые варьируются от почти 0-7.

При измерении распределения плотности образца можно найти, что псевдо DIC изображение выглядит хорошо в то время как плотность карту обладает нежелательные фоновые вклады. Это связано с шумом в светлом поле изображений образца, используемого в качестве входных данных для алгоритма NIQPM. Два возможных модификации метода NIQPM могут быть использованы для устранения нежелательных фоновых вклад: во-первых, можно использовать более длительное время экспозиции для повышения отношения сигнал-шум в образности ярко поля. Это особенно важно при визуализации оптически тонкие образцы. Альтернативно, можно уменьшить осевое расстояние от acquisit Z-Stackиона из 0,1-0,05 мкм и среднем 2-3 самолетов вместе до ввода их в алгоритм NIQPM.

Определение объема основе HTDIC была утверждена полистирола сферах диаметром от 1-20 мкм и был перекрестной проверке с конфокальной флуоресцентной микроскопии 35. Техника переоценивает объем объектов ниже дифракционного предела системы за счет дифракционных эффектов, связанных с аппаратной функцией оптики.

Поиск и устранение неисправностей HTDIC определение объема, может быть, необходимое для малых или тонких образцах. Основным источником ошибки происходит от сегментации изображений с использованием края обнаружения встроенный MATLAB Sobel основе, используемый для определения границы ячейки в поперечного сечения изображений. Значение «порога» в разделе 4 HTDIC программы имеет решающее значение в получении наилучшей сегментации. Результаты, как правило, различаются по нелинейным образом - с небольшими изменениями в "порогового" drasticallу меняя закрытую территорию в результате обнаружения края. Нынешняя программа предоставляет пользователю варианты для выполнения сегментации изображения либо из DIC Z-Stack, в HTDIC Z-Stack, или F-HTDIC Z-Stack.

Одна ДВС часто лучше для больших образцов в то время как HTDIC и F-HTDIC работа для небольших образцов (<5 мкм в диаметре).

Маска может повысить способность метода к сегменту изображения. Раздел 2 позволяет пользователю определить маску для применения к кубу изображения. Мы рекомендуем использовать прямоугольной маски, что обрезает по горизонтали (х-степень) куба, сохраняя вертикальное (у-степень) куба.

Таким образом, NIQPM и HTDIC технологически доступные количественные методы визуализации, которые могут быть выполнены на стандартных "вне-полке" оптических микроскопов, в отличие от большинства существующих методов. Центральное место в этих методов через фокус изображение образца под проверopriate условия визуализации: низкая освещенность Н.А. для NIQPM и высокая освещенность Н.А. для HTDIC. Методы, представленные здесь, могут быть обобщены для использования на других, чем те, продемонстрировали здесь систем. Первичные критерии, необходимые для этих процедур является микроскоп для которых пользователь имеет контроль над Z-движения этапе и возможность получать изображения как фокусное положение линзы объектива варьируется. Методы, представленные подходят для работы с изображениями фиксированные клетки или медленно движущихся биологических образцов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких финансовых интересов в работе, представленной.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами от Национальных Институтов Здоровья (U54CA143906 в KGP, OJTM и R01HL101972 к OJTM) и Фонда Орегон медицинских исследований ранних клинических Award следователь (KGP). OJTM является признанным следователь Американская Ассоциация Сердца (13EIA12630000). Мы благодарим доктора Эрик Андерсон из Института рака Knight для подготовки образцов клеток, используемые в этой работе.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zeiss Axio Imager 2 microscope Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany Axio Imager D2 Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm) Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont D540/25x Green filter
SlideBook 5.5 software Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado Image acquistion software
Polystyrene microspheres Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN PS06N Polystyrene spheres
Fluoromount-G SouthernBiotech, Birmingham, Alabama 0100-01 Mounting media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
  2. Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
  3. Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
  4. Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
  5. Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
  6. Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
  7. Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
  8. Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
  9. Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
  10. Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
  11. Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
  12. Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
  13. Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
  14. Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
  15. Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
  16. Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
  17. Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
  18. Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
  19. Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
  20. Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
  21. Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
  22. Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
  23. Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
  24. Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
  25. Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
  26. Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
  27. Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
  28. Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
  29. Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
  30. Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
  31. Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
  32. Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
  33. Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
  34. Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
  35. Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).

Tags

Биоинженерия выпуск 86 этикетки без оптики количественный микроскопия сотовые биофизика клеточная масса объем ячейки плотность клеток
Количественный оптическая микроскопия: Измерение Cellular биофизических Особенности с использованием стандартного оптического микроскопа
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S.… More

Phillips, K. G., Baker-Groberg, S. M., McCarty, O. J. T. Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope. J. Vis. Exp. (86), e50988, doi:10.3791/50988 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter