Abstract
Wir beschreiben die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und Differentialinterferenzkontrastbildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. NIQPM auf einem vereinfachten Modell der Wellenausbreitung auf der Basis, der sogenannten paraxialen Näherung mit drei zugrunde liegenden Annahmen: niedriger numerischer Apertur (NA) Beleuchtung, Schwach Streuung, und schwache Lichtabsorption durch die Probe. Glücklicherweise ungefärbten zellulären Proben erfüllen diese Annahmen und niedrigen NA Beleuchtung ist leicht zu kommerziellen Mikroskopen erreicht. HTDIC wird verwendet, um Informationen von Volumendurch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Aufhellung erhaltenation Bedingungen. Hohe NA Beleuchtung ermöglicht verbesserte Schneide der Probe entlang der optischen Achse. Hilbert-Transformationsverarbeitung auf der DIC Bildstapeln stark erhöht Kantenerkennungsalgorithmen für die Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Erreichbarkeit mit "off-the-shelf"-Mikroskope. Es gibt zwei grundlegende Einschränkungen dieser Methoden: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf gewerbliche Bereiche hebt derzeit die Untersuchung von Phänomenen schneller als 1 Bild / Minute, und zweitens, Beugungseffekte beschränken den Nutzen der NIQPM und HTDIC, um Objekte von 0,2 bis zu 10 (NIQPM) und 20 (HTDIC) um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden zu ermöglichen. Aufregend, die meisten Fest cellular Proben leicht mit diesen Methoden untersucht.
Introduction
Die Verwendung optischer Mikroskopie ist nun überall in der Untersuchung von zellulären Organismen. Aufgrund ihrer geringen endogenen Absorption und schwache Streueigenschaften über den sichtbaren Lichtspektrum, ich Zellen nicht stark auf die Amplitude der Lichtwellen durchqueren sie und erscheinen halbtransparent, wenn sie mit Standard-Hellfeld-Mikroskop abgebildet. Zellproben haben jedoch verlangsamen optischen Wellen, die sich durch sie in einer Weise, die linear zur Höhe der lokalen Massendichte in einem bestimmten Raumbereich, durch den das Licht in Beziehung steht. Die Nutzung dieser heterogenen Zeitverzögerung oder "Phase"-Profil von optischen Wellen durch mikroskopische Präparate übertragen wurde erstmals 1935 von Frits Zernike 1 beschrieben und experimentell durch Zernikein 1942 2 realisiert. Zernike den Nobelpreis im Jahr 1953 für diese Leistung ausgezeichnet. Zeiss kommerzialisiert dieses Instrument im Jahr 1945 3. Im Jahr 1955, Smith und Nomarskich würde ihre ersten Arbeiten über die Verwendung 4 und 5 von Theorie Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie, eine Modalität, die die räumliche Gradienten von Phase als Kontrastmechanismus verwendet zu präsentieren. DIC wurde von Zeiss in 1965in enger Zusammenarbeit mit Nomarski 6 kommerzialisiert. Im Jahr 1981 zeigten zwei Labors die erste aufgezeichnete Live-Cell-DIC Bilder mit dem Einbau von Videokameras in die Optik Zug der DIC-Mikroskop 7, 8. Die Ära der Live Cell Imaging war geboren.
Seit dieser Zeit hat sich die Ausführung der beiden Phasenkontrast und DIC auf kommerziellen Mikroskope weitgehend unverändert geblieben. Diese Methoden werden hauptsächlich von Biologen genutzt werden, um Bilder von Zellen für qualitative Zwecke zu produzieren: Überwachung der Morphologie, Tracking subzellulärer Strukturen, und Untersuchungen von Membrandynamik 9. Diese Techniken sind in ihrer qualitativen "off-the-shelf"-Konfiguration und Phase DIC lassen sich beliebige Funktionen der Intensität der Lichtquelle, die Beleuchtungsoptik Einstellungen und CCD-Kamera Verstärkung, Gamma-und Belichtungseinstellungen.
Eine kleine Legion von Physikern und Ingenieuren optischen hat sich bemüht, zu kommerziellen bildgebenden Verfahren quantitativ. Zu den ersten Bemühungen waren zwei Briefe an die Natur in 1952 und 1953, in denen der Arzt-turned-Biophysiker Robert Barer demonstriert die Verwendung von Phasenmikroskopie, um Zelltrockenmasse von Zellen durch Schätzung Phasenverschiebungen durch diesen Zelltypen mit einem handelsüblichen Phasen Mikroskop bestimmen 10, 11. Phasenmikroskopie 10,11, DIC-Mikroskopie 12-17, 18-22 und Hellfeld auf optische Weglänge, Phase, Masse zu bestimmen: Das Feld hat eine Vielzahl von Techniken in den folgenden Jahren auf Basis drei Grundmarkierungsfreie Kontrastmechanismen entwickelt Dichte, Brechungsindex, und Zellvolumen.
In Abs.llel, eine große Sammlung von kundenspezifischen optischen Instrumenten wurden auch seit den 1950er Jahren entwickelt worden und haben weitreichende optische Messungen im Bereich von Anwendungen in der Parasitenwachstum 23, zu dokumentieren, die den Zellzyklus 24 bis sucht Membrandynamik der roten Blutzellen 25. Insbesondere hat die vergangenen zehn Jahren eine Fülle von kennzeichnungsfreien quantitativen Mikroskopie in Form von Beugungsphasenmikroskopie 26, 27 tomographischen Phasenmikroskopie, digitale holographische Mikroskopie 28, phasensensitive optische Kohärenzmikroskopie 29, räumliche Lichtinterferenzmikroskopie 30. Hilbert gesehen Phasenmikroskopie 31 und quantitative Phasenmikroskopie 32. Trotz ihrer gemeinsamen Erfolge, haben diese Instrumente nicht zu den größeren Bereich der biologischen Forscher durch, meist, um ihre komplexen Mess-und Rechenanforderungen verbreitet.
Hier beschreiben wir dEscribe die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und DIC Bildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Zugänglichkeit. Die für die erfolgreiche Ausführung erforderlich Abbildungsbedingungen sind im Rahmen des normalen Betriebs der meisten kommerziell erhältlichen Mikroskope. Darüber hinaus sind die Post-Processing-Algorithmen stabil, schnell und robust - worden in MATLAB mit Hilfe von schnellen Fourier-Transformation (FFT) basierte Algorithmen, wann immer möglich umgesetzt.
NIQPM ist eine Methode zur Phasen-und den axial integriert Massendichte cel rekonstruierenzellulären Proben von Hellfeld-Bilder. Summation dieser axial integrierten Massendichte über die Fläche der Probe gibt die Gesamttrockenmassegehalt der Probe. , In dem sie gezeigt werden, dass die Phasenprofil einer Zelle konnte von durch-Fokus-Hellfeldbildern der Probe rekonstruiert werden - - Die NIQPM Protokoll basiert auf den experimentellen Grundlagen von Paganin und Nugent 18, 19 aufgestellt hat und die theoretische Arbeit von Frank , Altmeyer und Wernicke 20 - auf die Lösung der paraxialen Wellen Modelle in einer effizienten FFT-basierte Weise. Die Verbindung der Phase auf die Trockenmasse Dichte beruht auf der Arbeit von Barer 10, 11 und 33 Popescu basiert.
Volumen Informationen können durch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Beleuchtungsbedingungen, die optische Schnitte der Probe entlang der optischen Achse zu ermöglichen, erhalten werden. Hilbert-Transformation Verarbeitung der DIC-Bildstapeln stark erhöhtRanderfassungsalgorithmen zur Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Diese Arbeit stammt mit Arinson et al. 34. obwohl wir beide Fourier-Filter-Methoden eingeführt, um den Kontrast und einen Sobel-Kantenerkennung basierend Verfahren zur automatischen Volumen Analyse der Probe zu verbessern. Wir haben auch bestätigt HTDIC vorher für Polystyrolkugeln in der Größe von der Beugungsgrenze von bis zu 20 um Durchmesser 36.
Während sowohl NIQPM und HTDIC technologisch erreichbar aufgrund ihrer Entwicklung zu kommerziellen Mikroskope sind die Verfahren im wesentlichen durch die Hardware-Konfiguration der Mikroskope selbst begrenzt. Die primären Grenzen dieser Techniken sind zweifach: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf kommerziellen Bereiche, die durch Übersetzung der gesamten Probenbühne im Gegensatz zu nur die ObjektivlinseBegrenzt gegenwärtig die Untersuchung von Phänomenen schneller als etwa 1 Bild / min und zweitens Beugungseffekte begrenzen die Nützlichkeit NIQPM und HTDIC auf Objekte in der Größe von 0,2 bis 10 und 20 um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden auf typische "off-the-shelf" Instrumente zu ermöglichen. Spannend, die meisten festen zellulären Proben leicht mit diesen Methoden untersucht.
Eine Übersicht über den NIQPM und HTDIC Protokolle sind in Fig. 1 angegeben. In Abbildung 2 veranschaulichen wir optimale und suboptimale Durch Schwerpunkt Bildgebung unter niedrigen und hohen NA Beleuchtungsbedingungen sowohl für Hellfeld-und DIC-Bilder. Abbildungen 3 und 4 zeigen die Abhängigkeit der Parameter NIQPM Algorithmus auf der erfolgreiche und nicht erfolgreiche Implementierungen.
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Protocol
1. Mikroskop Technische Daten
Zur Durchführung Bildgebung in der richtigen Art und Weise das Mikroskop sollte den folgenden Spezifikationen:
- Besitzen beide Differentialinterferenzkontrast (DIC) und Hellfeld (BF) Kontrast.
- Haben Computer-gesteuerten z-Achsen-Bewegung.
- Haben Sie eine verstellbare Blende, um die Sammellinse numerische Apertur variieren. Eine Öffnung mit einer abgestuften Regel oder elektronische Auslesung erforderlich ist, um den Wert der numerischen Apertur zu kennen. Die numerische Apertur von 0,1 sollte für NIQPM bis 0.9 (oder höher) für HTDIC reichen.
- Das Mikroskop sollte eine Schmalband-Farbfilter müssen für Hellfeld-Bildgebung genutzt werden. Dieser Filter ist erforderlich, um den Brechungsschritt, eine wellenlängenabhängige lung zur Phase der Massendichte für NIQP konvertieren zu beheben.
2. Differentialinterferenzkontrast (DIC) Z-Stapel-Erfassung
- Öffnen Sie die Slidebook Software einnd erstellen Sie eine neue Folie für die Bildsammlung.
- Dann öffnen Sie den Fokus-Fenster. Unter dem Filter-Set Wählen Sie im Abschnitt DIC. Auf der Registerkarte Bereich unter der Kondensator Abschnitt, stellen Sie die Blende Schieberegler, um die am weitesten rechten Position (in alle Richtungen öffnen). Dies sorgt für hohe numerische Apertur Beleuchtung und verbessert optische Schnitte der Probe.
- Konzentrieren Sie sich auf die Probe mit Hilfe eines DIC Ziel. Einstellen der Halogenlampenintensität, bis die Probe leicht sichtbar ist. Um sicherzustellen, dass die Kamera nicht gesättigt ist, wählen Sie die Registerkarte Kamera in der Focus-Fenster und überprüfen Sie, dass das Histogramm der Pixelintensitäten innerhalb der Dynamikbereich der Kamera.
- Öffnen Sie die Bildaufnahme-Fenster. In dem Abschnitt Aufnahmetyp, überprüfen Sie die 3D-Box. In der 3D-Capture-Abschnitt, wählen Sie den Bereich um das Zentrum und zurück zu aktuellen Standort
- In der Filter-Set Abschnitt der Bild-Capture Fenster die DIC Kästchen und geben Belichtungszeit. In der Bildinformationen Abschnitt, nennen Sie das Bild (optional), und wählen Sie Start, um die Abbildung zu initiieren.
3. Hellfeld (BF) Z-Stapel-Erfassung
- Sobald das Mikroskop Sammeln der DIC Z-Stapel von der Probe beendet ist, öffnen Sie den Fokus-Fenster und wählen Sie unter dem Filter-Set Abschnitt Öffnen. Stellen Sie die Blende Schieberegler, um die am weitesten links (geschlossen den ganzen Weg) zum niedrigen NA Beleuchtung zu bieten.
- Ändern Sie den Mikroskoplicht-Pfad-Filter auf grün. Stellen Sie die Halogenlampe Intensität, bis die Probe sichtbar ist. Sicherzustellen, dass keine Sättigung der Kamera durch Auswahl der
- Öffnen Sie die Bildaufnahme-Fenster. Die 3D-Capture-Einstellungen aus der Z-Stapel Erwerb DIC wird angezeigt.
- In der Filter-Set Abschnitt der Bildaufnahme-Fenster, überprüfen Sie die OPEN-Box und geben Belichtungszeit. In der Bildinformationen Abschnitt, nennen Sie das Bild (optional), und wählen Sie Start, um den Z-Stapel-Bildakquisition zu initiieren.
4. Exportieren Z-Stapel-Bilder
- Öffnen Sie ein Z-Stapel-Aufnahme. Ändern Sie die Ansicht auf 100%. Einstellen des Histogramms der Pixelwerte zwischen 0 angezeigt, und der maximale Pixelwert der Kamera (4.095 für 12-Bit-Kameras, 65.535 für 16 Bit.).
- Wählen Sie Ansicht> Exportieren> TIFF-Serie. Dadurch wird die Z-Stapel als eine Reihe von TIFF exportieren(Eine für jede Z-Ebene). Speichern Sie die TIFF-Serie in einem separaten Ordner mit einem Namen, der einen Unterstrich am Ende (dh "DIC Stapel 1_") hat. Wiederholen Sie dies mit jedem DIC oder BF Z-Stapel.
5. Volumenmessungen
- Öffnen Sie die HTDIC MATLAB-Programm mit dem Titel "JoVE_HTDIC_v1.m".
- Nach § 0 des HTDIC Programm, aktualisieren Sie die Abhängigkeiten Verzeichnis variabel. Kopieren Sie das Verzeichnis mit der hilbert_transform_dic.m und sobel_edge_detect.m Dateien aus dem Explorer (PC) in zwischen den einfachen Anführungszeichen folgenden "dependencies_directory =". ExecuteSection 0 des JoVE_HTDIC_v1.m Programm.
- In Abschnitt 1, aktualisieren Sie die "images_directory". Auch Kopieren Sie das Verzeichnis mit den durch-Fokus-Bilder in. Tif Form zwischen den einfachen Anführungszeichen. NUR EINMAL ein Laufabschnitt.
- Ausrichtung und Drehung der Bilder für Hilbert-Transformation Run Abschnitt 2 des Codes. Ein Dialogfeld mit dem Titel "Define HTDIC Parameter" wird angezeigt. Fünf numbeRS sind für den Benutzer erforderlich, die Brennebene Nummer, die DIC-Bild der Probe fokussiert ist, laterale Auflösung (&mgr; m / Pixel im Bild), die axiale Auflösung (das ist 0,1 für die Bildaufnahme in 0,1 um axiale Stufen), der Drehwinkel der DIC-Bild benötigt, um die Hilbert-Transformation durchzuführen, sind 45 und -135 typische Werte. Schließlich geben Sie die Region von Interesse Größe, definiert dieser Parameter die Länge einer Seite der Box, die später erscheinen werden - typischer Wert ist 400. Klicken Sie auf OK.
- Ein Bild von dem von der Brennebene Nummer angegeben DIC Brennebene wird mit einem blauen Feld angezeigt. Positionieren Sie die Box auf das Merkmal von Interesse, z. B. einer Zelle. Die Box muss nicht quadratisch sein. Sobald die Box über den gewünschten Bereich, doppelklicken Sie in der Box positioniert.
- Eine weitere Zahl wird nun angezeigt: Diese Zahl enthält eine beschnittene und gedrehte Bild der Region von Interesse in der vorherigen Schritt ausgewählt. Der Kontrast des Bildes sollte so sein,dass dunkle Funktionen erscheinen auf der linken Seite, während helle Funktionen erscheinen auf der rechten Seite. Ziehen Sie die blaue Box auf dem Gebiet von Interesse, neu zu gestalten wie nötig.
- Abschnitt 3 erzeugt eine Maske für die z-Stapel Würfel. Es gibt zwei Arten von Masken zur Verfügung: eine rechteckige Maske, um ein Rechteck um die Zelle und ein Freihandwerkzeug, um die Zelle von Interesse von Hand skizzieren erstellen.
- Um eine rechteckige Maske, entfernen Linie 167 und Linie 170 Kommentar (Kommentar einer Linie durchgeführt, indem ein "%" am Anfang der Zeile) zu erzeugen. Führen Abschnitt 3 des Programms. Klicken Sie in das Bild und ziehen Sie die Maus, die rechteckige Maske definieren, um zu beginnen. Doppelklicken Sie auf das Feld, um es zu akzeptieren.
- Um eine von Hand gezeichnete Maske Kommentarzeile 167 und Kommentar-Linie 170 zu generieren und auszuführen Abschnitt 3. Klicken Sie auf und ziehen Sie die gewünschte Maske mit der Maus. Doppelklicken Sie auf die Maske, es zu akzeptieren.
- Führen Abschnitt 4to der Hilbert-Konstrukt transformiert DIC Bildstapel und die entsprechende DIC Bildstapel der Bereich von Interesse.Die in Abschnitt 3 aufgebaut Maske wird dem Hilbert-Transformation angewendet werden DIC-Stack und die regelmäßige DIC Stapel, wenn "Maskon" auf 1 in Zeile 179 festgelegt ist. Einstellung "Maskon" wird auf 0 Bildstapeln ohne Auftragen der Maske zu konstruieren.
- Laufabschnitt 5, um die Bildsegmentierung der xz-Querschnittsbilder von dem interessierenden Bereich zu optimieren. Figur 500, durch das Programm erzeugt wird, erscheint die Anzeige drei verschiedene Arten von Kontrast. Der Erfolg des Algorithmus, um die Grenzen der Zelle zu finden, ist abhängig von einer Kombination der Maske verwendet, und der Wert der "Schwellenwert" in Zeile 229 des Programms. Beginnen Sie mit einem Wert von 0,5. Stellen Sie den Wert der Schwelle, und wiederholen Sie diesen Abschnitt des Programms, bis die richtige Gliederung in eine der Spalten erreicht.
- Wenn die Gliederung besten in Spalte 1 war, verwenden Sie Abschnitt 6, um die Lautstärke zu bestimmen, unter Verwendung von DIC Bildsegmentierung. Wenn Spalte 2 gab optimale Ergebnisse laufen Abschnitt 7 zu Zellvolumen von Hilbert-transformierten DIC Bildern zu bestimmen. Wenn Spalte 3 GAVe die optimalen Ergebnisse, Abschnitt 8 laufen, um die Lautstärke zu bestimmen, mit Fourier-gefilterten Hilbert-transformierten DIC Bilder.
- Das gemessene Volumen der Probe in Kubik um (fl) gemeldet wird im Titel von Fig. 600, 700 oder 800 von dem Programm in Abhängigkeit von dem Volumenmessung gewählt hergestellt vorgestellt.
6. Massenmessungen
- Öffnen Sie die NIQPM MATLAB-Programm mit dem Titel "JoVE_NIQPM_v1.m".
- Nach § 0 des NIQPM Programm, aktualisieren Sie die Lage der drei Verzeichnisse benötigt, um das Programm auszuführen. Dies sind die "dependencies_directory", die "brightfield_directory" und die "dic_directory."
- Als nächstes führen Sie Abschnitt 1. Dieser Codeabschnitt erzeugt ein helles Feld Bild Würfel des vollen Feld der gesamte Satz von Bildern. NUR EINMAL ein Laufabschnitt.
- Als nächstes führen Sie Abschnitt 2. Ein Dialogfeld mit dem Titel "Define NIQPM Parameter" wird angezeigt. Vier Zahlen sind für den Benutzer erforderlich: Anzahl der Brennebene, wo das helle Feld Bild desProbe im Fokus, laterale Auflösung (um / Pixel im Bild), die axiale Auflösung (das ist für die Bildaufnahme 0,1 in 0,1 Schritten um axial) und die Region von Interesse Größe, definiert dieser Parameter die Länge einer Seite ein Box, die später erscheinen werden - ein typischer Wert ist 200. Klicken Sie auf OK.
- Ein Bild von dem von der Brennebene Nummer angegeben Hellfeld-Brennebene wird mit einem blauen Feld angezeigt.
- Wenn das Bild nicht fokussiert ist, doppelklicken Sie in der blauen Box und erneut Abschnitt 2, achten Sie darauf, um die Brennebene Nummer im Dialogfeld einstellen.
- Wenn das Bild scharf ist, ziehen Sie den blauen Kasten um das Bild und Größe ändern, indem Sie die Knoten der Box und ziehen Sie diese gegebenenfalls. Positionieren Sie den Rahmen um das Merkmal von Interesse, z. B. einer Zelle. Die Box muss nicht quadratisch sein. Doppelklicken Sie in der Box, es zu akzeptieren.
- Als nächstes führen Sie Abschnitt 3, einen Stapel von Hellfeld-Bilder zu konstruieren abgeschnitten, um in der RegionInteresse.
- Um die Phasenkarte, Pseudobild DIC, und Vergleiche mit Hellfeld-Bildern und dem wahren Bild DIC generieren, führen Sie Abschnitt 4.
- Mit der Pseudo DIC und wahre DIC Bilder so ähnlich wie möglich der Massendichte Karte, Gesamtmasse und Histogramm der Zelldichte kann durch Ausführen von § 5a oder 5b bestimmt werden. § 5a führt automatische Erkennung der Grenze des Feldes - optimieren "Schwelle" in Zeile 300 - typische Werte liegen zwischen 0,1-1. Führen Sie erneut diesen Abschnitt wie notwendig, um den Wert der Schwelle zu optimieren. 5b führt Massenbestimmung usw., nachdem der Benutzer den interessierenden Zelle skizziert.
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Representative Results
Korrekte Probenbeleuchtung während durch Fokus-Bildaufnahme ist entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung des NIQPM nd HTDIC Algorithmen. In Abbildung 2 veranschaulichen wir niedrigen und hohen NA Beleuchtung sowohl unter DIC und Hellfeld-Kontrast für eine Polystyrol-Kugel und der menschlichen kolorektalen Adenokarzinom-Zelllinie SW620. Fig. 2A, 2C, 2I, 2K und demonstrieren eine optimale Bildgebung für NIQPM. 2F, 2H, 2N und 2P demonstrieren optimale Bildgebung für HTDIC.
Abbildungen 3 und 4 zeigen die Abhängigkeit der Parameter NIQPM Algorithmus beleuchtet sowohl erfolgreiche und nicht erfolgreiche Implementierungen. Das erwartete Profil ist theoretisch bekannt und können somit direkt an die NIQPM Rekonstruktion verglichen werden - In Abbildung 3 haben wir die Phase-Profil aus einem Polystyrolkugel 4,8 um Durchmesser zu erkunden.
Zellproben, deren Phaseneigenschaften nicht von vornherein bekannt ist, kann unter Verwendung NIQPM rekonstruiert werden in Verbindung mit einem Verfahren, um eine "Pseudo DIC" Bild vergleichen - aus dem rekonstruierten Phasen berechnet - eine tatsächliche DIC Bild eine direkte optische Messung bestimmt wird, der Zelle. NIQPM hat einen freien Parameter - die Ebene, in der Hellfeld-Bildstapel an dem die Berechnung ist zentriert. Diese zentrale Brennebene sollten eingestellt, bis der Pseudo DIC und wahre DIC Bilder so ähnlich wie möglich. 4E-G zeigen eine out-of-focus Pseudo DIC Bild, eine optimale Pseudo DIC Bild aussehen werden, und die corresponding DIC Bild der Zelle mit einer Beleuchtungs NA von 0,9 genommen. Interessanterweise ist die beste Phase der Karte und der entsprechenden Pseudobild DIC nicht unbedingt zu einer Fokus-Bild in Hellfeld, nämlich. 1A und 1B entsprechen.
Schließlich zeigt Fig. 5 die Schritte im HTDIC Bildverarbeitungs-Algorithmus beteiligt. Von der durch die DIC-Fokus-Bilder unter NA = 0,9 Beleuchtung, 5A und 5D, die Hilbert-Transformation ist vorgeformt, um das Relief von der DIC-Bilder zu entfernen, 5B und 5E. Dies ist mit einigen Unschärfe entlang der optischen Achse, die von Hochpassfourierfilterung entfernt werden kann, Fig. 5C und 5F. Diese endgültigen Bilder leicht segmentiert, um den Bereich in jeder Querschnittsebene der Probe zu bestimmen, um die Gesamtzellvolumen abzuleiten.
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Fig. 1 ist. NIQPM und HTDIC-Workflow. (1.). Mikroskopische Proben wie Zellen sollten am Mikroskop angebracht werden Objektträger mit Deckglas über der Probe mit Fluoromount G. angebracht (2.). Sowohl unter DIC und Hellfeldkontrast mit einem Standard erworben Durch unscharfe Bilder "off-the-shelf"-Mikroskop bilden die Eingabe für die Bildverarbeitungsalgorithmen. (3.). Nachbearbeitung der Bilder in MATLAB zu Zellvolumen von DIC und Zellmassenverteilung von Hellfeld-Bildern zu bestimmen. (4). Quantitative Endpunkt Metriken:. Wärme Karten und Balkendiagramme Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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2. Durch Fokus DIC und Hellfeld-Bilder der Polystyrolkugeln und SW620-Zelllinien. Die optimale Abbildungsbedingungen für NIQPM sind Hellfeldkontrast mit 0,1 NA Beleuchtung. Für HTDIC DIC, 0,9 NA Beleuchtung optimal. (A, B) en face Hellfeldbildern von 4,8 Mikrometer Durchmesser Polystyrol Kugel unter 0,1 und 0,9 NA NA Beleuchtung auf. (C, D) Querschnittshellfeldbildern von 4,8 Mikrometer Durchmesser Polystyrol Kugel unter 0,1 und 0,9 NA NA Beleuchtung auf. (E, F) En face DIC Bildern von 4,8 Mikrometer Durchmesser Polystyrol Kugel unter 0,1 und 0,9 NA NA Beleuchtung auf. (G, H) Querschnitts DIC Bildern von 4,8 Mikrometer Durchmesser Polystyrol Kugel sorbehaltlich 0,1 und 0,9 NA NA Beleuchtung auf. (I, J) en face Hellfeld-Bilder der SW620 Darmkrebs-Zelllinie unter 0,1 und 0,9 NA-Beleuchtung auf. (K, L) Querschnittsbilder von Hellfeld-SW620 Zell unter 0,1 und 0,9 NA-Beleuchtung auf. (M, N) En face DIC Bilder von SW620 Zellen unter 0,1 und 0,9 NA NA Beleuchtung auf. (O, P) Querschnittsbilder von DIC SW620 Zell unter 0,1 und 0,9 NA NA Beleuchtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fig. 3. Optimale und suboptimale Phase Rekonstruktionen:. 4,8 um Durchmesser Polystyrolkugel Jede Reihe untersucht die Abhängigkeit der Brennebene der En Face hellen Feldstärke (erste Spalte) und der rekonstruierten Phasenprofil als die Brennebene beginnt in der Mitte durch die Kugel, z = 0 und bewegt sich an dieser Ebene in 1 um Schritte. (A, E, I, M) E n Gesicht hell Feldstärke (B, F, J, N) entsprechende Phasenrekonstruktion, (C, G, K, O) Vergleich der rekonstruierten Phasenprofil entlang der Diagonalen der Phase Karte, blaue Kreise, theoretische Phasenprofil, in rot, und Hersteller-Fehlertoleranz, schwarze Linien, und (D, H, L, P) Prozent (%) Fehler des rekonstruierten phase in Bezug auf die theoretische Phase Profil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Optimale und suboptimale Phase Rekonstruktionen:. SW620 Zell Die beiden Spalten vergleichen suboptimal und optimale Hellfeld-Bildebenen (A, B) von der z-Stack, um die Phasenberechnung zu zentrieren. Die entsprechenden Phasen Rekonstruktionen (C, D) verwendet, um einen Pseudobild DIC (E, F) zu erzeugen. Diese sind mit dem wahren Bild DIC verglichen, NA = 0,9 Beleuchtung in (G). Die Pseudo DIC Bild die DIC besten passenden Bild bestimmt die richtige Eingangs Bilder von Hellfeld image-Stack in Phase Wiederaufbau zu verwenden. Schließlich wird die Phase der projizierten Massendichte (H, I) abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
5. Optimale DIC Kontrastverstärkung mit HTDIC: Polystyrol-Kügelchen und SW620 Zelle. HTDIC Bild (A) Querschnitt DIC Bilder eines 4,8 Polystyrolkugel, (B) entsprechend HTDIC Bild, (C) Fourier-gefiltert. Die axiale Abmessung der Kugel Bilder skaliert worden, um Brechungsindex-Fehlanpassung der Probe (1,597) und dem Befestigungsmittel (1.4) entfallen. (DF) zeigen die gleichen Bildtypen für eine SW620-Zelle, jedoch ohne Brech index Mismatch-Korrektur aufgrund der schwachen Indexkontrast der Probe. Keine Schwellen hat sich auf diesen Bildern durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Im allgemeinen ist NIQPM ein beugungsbegrenzter Technik auf optische Weglängen zwischen 0,25-44,7 validiert. Validierung auf n = 1.596 durchgeführt Polystyrolkugeln im Durchmesserbereich von 0,11 bis 9,8 &mgr; m in Fluoromount G suspendiert (Daten nicht gezeigt). Zellen besitzen optischen Weglängen, die von fast 0-7 liegen.
Bei der Messung der Dichteverteilung einer Probe kann man feststellen, dass die Pseudo-Bild DIC sieht gut aus, während die Dichtekarte besitzt unerwünschte Hintergrundbeiträge. Dies ist aufgrund von Rauschen in der Hellfeldbilder der Probe als Eingang zum NIQPM Algorithmus verwendet. Zwei mögliche Änderungen an der NIQPM Methode kann verwendet werden, um die unerwünschte Hintergrundbeiträge zu beseitigen: Erstens kann eine längere Belichtungszeiten verwenden, um zu verbessern Signal-zu-Rauschen in der Hellfeld-Bilder. Dies ist besonders kritisch bei der Abbildung optisch dünnen Proben. Alternativ kann man den axialen Abstand von der z-Stapel acquisit reduzierenIonen 0,1-0,05 um und durchschnittlich 2-3 Ebenen zusammen, bevor sie in die Eingabe NIQPM-Algorithmus.
HTDIC basierte Volumenbestimmung wurde auf Polystyrol-Kugeln mit einem Durchmesser von 1-20 um validiert worden und wurde mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie 35 Quer validiert. Die Technik überschätzt das Volumen von Objekten unterhalb der Beugungsgrenze des Systems aufgrund von Beugungseffekten mit der Punktstreufunktion der Optik verbunden.
Fehlerbehebung für die Volumenbestimmung HTDIC vielleicht für kleine oder dünne Proben erforderlich. Die primäre Quelle der Fehler kommt aus Bildsegmentierung unter Verwendung des integrierten MATLAB Sobel-Kantenerkennung basiert verwendet, um die Grenzen der Zelle in den Querschnittsbildern zu bestimmen. Der Wert der "Schwelle" in Abschnitt 4 des HTDIC Programm ist entscheidend bei der Beschaffung der besten Segmentierung. Ergebnisse sind in der Regel nichtlinear variieren - mit kleinen Änderungen in der "Schwellenwert" drastically Änderung der geschlossenen Bereich von der Kantenerkennung ergeben. Das aktuelle Programm zeigt dem Benutzer Optionen zur Bildsegmentierung entweder von der DIC-Z-Stapel, der HTDIC Z-Stapel oder der F-HTDIC Z-Stapel durchzuführen.
Allein DIC ist oft besser für große Proben während HTDIC und F-HTDIC Arbeit für kleinere Proben (<5 &mgr; m im Durchmesser).
Eine Maske kann die Fähigkeit des Verfahrens zur Segmentierung des Bildes zu verbessern. Abschnitt 2 ermöglicht es dem Benutzer, eine Maske zu bestimmen, um die Fotowürfel an. Wir empfehlen die Verwendung eines rechteckigen Maske, die die horizontale (x-Maße) kürzt des Würfels unter Beibehaltung der vertikalen (y-Maß) des Würfels.
Zusammenfassend NIQPM und HTDIC sind technologisch zugänglich quantitativen bildgebenden Verfahren, die auf Standard "off-the-shelf" optischen Mikroskopen durchgeführt werden können, im Gegensatz zu den meisten bestehenden Methoden. Im Mittelpunkt dieser Verfahren ist durch die Fokusbildern der Probe unter ca.opriate Abbildungsbedingungen: geringe NA Beleuchtung für NIQPM und hohe NA-Beleuchtung für HTDIC. Die hier vorgestellten Methoden können für den Einsatz auf andere als die hier gezeigt Systeme verallgemeinert werden. Die für diese Verfahren erforderliche Primärkriterien ein Mikroskop für die der Benutzer die Kontrolle über die Z-Bewegung des Tisches und die Fähigkeit, Bilder zu erfassen, wie die Fokusposition der Objektivlinse verändert hat. Die aufgeführten Methoden sind geeignet zur Abbildung fixierten Zellen oder langsam biologischen Proben.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Interessen in der vorliegenden Arbeit.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (U54CA143906 zu KGP, OJTM und R01HL101972 zu OJTM) und einem Oregon Medical Research Foundation Frühe klinische Investigator Award (KGP) unterstützt. OJTM ist ein American Heart Association Gegründet Investigator (13EIA12630000). Wir danken Dr. Eric Anderson von dem Ritter Cancer Institute für die Herstellung von Zellproben in dieser Arbeit verwendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
References
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