Summary
Vi presenterar ett urval test för att avslöja påverkan av luktämnen på Drosophila beteende med hjälp av en Y-labyrint-analysen.
Abstract
Detektion av signaler från omgivningen är viktigt för djur för att säkerställa deras överlevnad. För detta syfte använder de miljö ledtrådar såsom syn, mechanoreception, hörsel, och chemoperception genom smak, genom direktkontakt eller via lukt, som utgör svaret på en flyktig molekyl som verkar på längre räckvidd. Flyktiga kemiska molekyler är mycket viktiga signaler för de flesta djur att upptäcka fara, en källa till mat, eller för att kommunicera mellan individer. Drosophila melanogaster är en av de vanligaste biologiska modeller för forskare att utforska den cellulära och molekylära grunden för luktsystemet. För att lyfta fram lukt förmågor i denna lilla insekt, beskriver vi en modifierad val protokoll baserat på Y-labyrinttest klassiskt används med möss. Data som erhållits med Y-labyrinter ger värdefull information för att bättre förstå hur djur hantera sin ständigt föränderlig miljö. Vi presenterar ett steg-för-steg-protokoll för att studerapåverkan av luktämnen på fluga undersökande svar med hjälp av denna Y-labyrint-analysen.
Introduction
Chemoreception genom smak eller luktsinne är en viktig sensorisk modalitet för djurens överlevnad. Det ger viktiga ledtrådar som behövs för att upptäcka en fara eller livsmedel källor, samt för sociala interaktioner. Det hjälper också djur för att hitta en sexpartner nödvändig för deras reproduktion. För mer än 20 år, intensiv forskning, bland annat Nobelpriset vinnande verk av Richard Axel och Linda Buck 2004 "för deras upptäckter av luktreceptorer och organisation av luktsinnet", har genomfört för att avslöja de molekylära och cellrelaterade grunderna för olfaction 1,2.
En av favorit djurmodeller för forskare att dissekera lukt uppfattning är D. melanogaster. Denna insekt delar en liknande cell-och molekylär lukt-kodning strategi med däggdjur. Det vetenskapliga samfundet använder olika beteende paradigm för att studera rollen av luktämnen i denna fruktflugan. Dessa tester omfattar multimodala analyser såsom courtship tester där olika sensoriska modaliteter, däribland lukt, är viktiga för att framkalla manlig uppvaktning 3. Andra analyser har också utvecklats för att tackla rollen av odörer mer specifikt; dessa inkluderar T-labyrinter, Y-labyrinter, trap-analyser, fyra fält arenor och vindtunnlar 4,5,6,7,8.
I den här artikeln presenterar vi en enkel modifierad Y-maze-analysen, som ger robusta lukt svar med hjälp av D. melanogaster. Vår set-up använder slut tips i strid med en tidigare beskriven metod 9. Således har vår Y-labyrint två fördelar. Först, undviker det någon avkastning i systemet när flugan har gjort sitt val. För det andra begränsar det utbyte av luktämnen inom alla områden i Y-labyrinten. Denna sista fördel är viktig eftersom Drosophila är mycket känsliga för luftströmmen, som ofta används för att undvika lukt mättnad. För att justera den experimentella uppställningen med ett luftflöde skulle vara tids-och kostnadskrävande. Därför representerar vårt Y-maze-analysen en eftiv och snabbt sätt att testa lukt prestanda Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Innan du börjar
- Använd en isogenized referens lager bärande stabila och robusta beteendemässiga fenotyper. Det finns ingen generell regel för att välja detta lager, eftersom alla potentiella kontroller kan bära heterogena bakgrunds alleler.
- Använd denna styrstam för att återkorsnings varannan lager som behövs för senare steg. Denna återkorsning steg är normalt representerat av minst fem på varandra följande korsningar av en enda oskuld kvinna (för att möjliggöra eventuell överkorsning mellan homologa kromosomer) till 2-3 isogena referens män 5. Detta steg är viktigt för att homogenisera den genetiska bakgrunden mellan de olika flyga bestånden.
- Behåll Drosophila aktier på en vanlig majsmjöl (9%), jäst (10%), och agar medium (1,5%) kompletterad med antibiotika (0,4% metyl-para-hydroxy-bensoat) i en ljus / mörker-cykel 12-tim vid 25 ° C.
- Uppnå chemosensory experiment i ett temperaturreglerat rum (25 ° C) under långt rött ljus(För att eliminera bidraget av visuella referenser, och att fokusera på chemosensory signaler). Regelbundet förnya luften i rummet för att ventilera området mellan varje försök.
2. Olfactory svar med hjälp av en Y-labyrint-analys
- Svälta flugor för 16 till 18 h vid 25 ° C i glasrör innehållande våt pappershandduk före testning.
- Gå med i en Y-form-kontakt till två glasflaskor och en mindre plastflaska (lastning flaska). Använd 1 ml pipettspetsar som passerar genom skumproppar för att länka kontakten till de tre flaskorna, och för att få ett tätt tillsluten Y-labyrint. Skär de smala ändarna av två pipettspetsar (~ 2 mm diameter, för att undvika varje retur av flugan när det har gjort sitt beslut) för att bilda två "fälla" vialer, och en stor ände av en pipettspets för att bilda "loading" röret (Figur 1A).
- Precis innan du ansluter den "fälla" flaskor (Figur 1B), placera en ~ 6 mm diameter filterpapper ivarje flaska. Tillsätt 40 ul av luktämnen lösning på ett filterpapper och 40 | il av den motsvarande lösningsmedel på andra filterpapper.
- Presentera tio 4-9 dagar gamla flugor till "loading" flaskan. Använd inte CO 2 anestesi under denna överföring, eftersom den har en stark inverkan på beteende 10. Hellre använda kort kylning på is. Korrekt hantering av sövda flugor är viktigt att begränsa belastningen på de ämnen så mycket som möjligt.
- Utföra en serie av Y-labyrinttest vid 25 ° C under långt rött ljus (med användning av LED-lampor för att begränsa eventuell värmekällan) för att undvika visuella stimuli så mycket som möjligt. Var noga med att alternera riktlinjerna i Y-labyrinter (luktämnen som innehåller rör till vänster eller till höger, och laddningsröret i fronten eller i ryggen, Figur 1C).
- Tillåt flera timmar för flugorna att komma in i fällan flaskan med luktämnen eller lösningsmedel. Räkna flugor efter 24 timmar för att öka participatipå upp till mer än 80% och ge maximal luktindexvärde (Simonnet, personlig kommunikation).
- Beräkna den resulte olfaktoriska index med hjälp av följande formel: (antal i lukt röret - antal i lösningsmedlet rör) / totalt antal lastade flugor.
- Tvätta Y-labyrint uppställning som följer: blöt nedmonteras installation i RBS 35 MD natten. Skölj med kranvatten. Skölj slutligen med avjoniserat vatten och låt torka.
3. Statistisk analys av data
- Utför en t-test, en envägs ANOVA eller en tvåvägs ANOVA beroende på data och variabler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1D visar två representativa svar med hjälp av denna Y-labyrint-analysen. Canton-S-hanar undvika starkt 10% ättiksyra utspädd i destillerat vatten, medan de inte väsentligt undvika 10% fenylättiksyra. Dessa analyser är baserade på 10 hanar per replikat placeras tillsammans i lastningsflaskor. Detta protokoll kan ibland leda till stora standardfel av medelvärdet. Vid behov är det möjligt att minska denna nackdel genom att använda 20 män per replikat istället för bara 10. Matematiskt valet av en individ har en lägre vikt på indexvärdet för ett större urval.
Figur 1. Man lukt respons bedömas med en Y-labyrint set-up. A) Split-enhet. B) Monteradenhet. C) Set-up i skick i långt rött ljus. D) Kvantifiering av manliga luktsvar mot ättiksyra (AA) eller fenylättiksyra (PAA) både utspädd i destillerat vatten (10% v / v) (N = 11, vilket motsvarar totalt 110 flugor). Statistisk analys utfördes med användning av ett t-test jämför uppgifterna till 0. 0 betyder ingen preferens. Ett negativt värde indikerar en motvilja mot luktämnen, och ett positivt värde en attraktion. ****: P <0,0001; ns:. icke-signifikant (p = 0,1680) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår Y-maze-protokollet är baserat på ett tidigare beskrivet protokoll 9. Men vi införa två stora skillnader. Först använder vi smala pipettspetsar för att hindra flugorna från att återvända när de bestämmer sig för att komma in i flaskan med lösningsmedel eller lösningsmedlet plus luktämnen. Dessa smala spetsar är också användbara för att begränsa odorant diffusion i Y-labyrinten. För det andra använder vi en mindre belastning flaska för att tvinga flugorna att komma in i Y-labyrinten. Det är viktigt att ha en stor andel dessa flugor (80% till 100% efter 24 h; Simonnet, personlig kommunikation).
Denna Y-maze-analysen är ett effektivt test för att utvärdera chemosensory responser i Drosophila. I samband med testet, inklusive stress på flugorna (från luftflödet, manipulation av flugorna under lastningssteget, etc.) är potentiellt påverka deras lukt svar. Dessa miljöfrågorna är viktiga och kan förklara, åtminstone delvis, varför olikastudier kan ha olika beteende-resultat. Till exempel ättiksyra visas vara frånstötande i vissa förhållanden 4,11, under det att det är attraktivt i andra 12. Därför är det viktigt att kontrollera alla dessa parametrar så mycket som möjligt.
En möjlig begränsning av denna Y-labyrint-analysen är dess artificiella sammanhang för flugor, eftersom de hålls i ett låst konstruktion. Dessutom, flugor måste ange i trånga passager, vilket kan vara stressande för dem. Försöksledaren måste komma ihåg detta när man tolkar data.
För att kringgå dessa möjliga begränsningar, kan andra kompletterande lukt undersökningar utförs för att bekräfta effekten av luktämnen på beteendet. Dessa tester inkluderar T-labyrinter 4, 4 fält-arena analyser 7, eller vindtunnlar 8. Men dessa tester utnyttjar även artificiella miljöer av flugor, som kan vara mer eller mindre stressande. Till exempel, under T-maze test flugor är highly strykas eftersom de skakas under lastningssteget 4. Emellertid är en fördel med en T-labyrinten jämfört med denna Y-labyrint assay som flugor har att välja inom minuter var (till luktämnen eller lösningsmedlet). Därför Y-labyrint svar representerar en "reflektiv" val, medan resultat som erhållits med en T-labyrint representera en reflex val i en mycket stressande tillstånd.
Äntligen en eventuell förbättring av denna Y-labyrint-analysen skulle vara att använda glasrör längs ställa upp i stället för plast för vissa komponenter (lastning rör, kontakt, pipettspetsar). Dessa plastdelar kan, i teorin, har en lukt, eftersom de är gjorda av bensin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar 4 anonyma granskare för deras arbete för att förbättra manuskriptet. Vi tackar Centre National de la Recherche Scientifique för sitt ekonomiska stöd till MBG och YG, och Université de Bourgogne och det franska forskningsministeriet till MMS. Forskning i YG laboratorium finansieras av Europeiska forskningsrådet (ERC Starting Grant, GliSFCo-311.403), Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), Conseil Regional de Bourgogne (Faber), och CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
