Expressão, isolamento e purificação do solúveis e insolúveis biotinilados Proteínas de Tecido Nervoso Regeneração

Summary

Desenvolvimento de proteínas de fusão biotinylatable tem muitas aplicações potenciais em diversas áreas de pesquisa. Engenharia de proteínas recombinantes é um procedimento para a frente que é eficaz em termos de custos, rendimentos elevados de proteínas personalizados.

Abstract

Engenharia de proteínas recombinantes utilizou Escherichia coli (E. coli) para sistemas de expressão de quase quatro décadas, e hoje E. coli é ainda o organismo hospedeiro mais utilizado. A flexibilidade do sistema permite a adição de porções tais como uma etiqueta de biotina (para interacção com estreptavidina) e proteínas funcionais maiores, como a proteína fluorescente verde ou proteína vermelho cereja. Além disso, a integração de aminoácidos não naturais como quelantes de iões de metais, grupos funcionais reactivos, exclusivamente sondas espectroscópicas, e as moléculas que conferem modificações pós-traducionais permitiu uma melhor manipulação de propriedades de proteína e funcionalidades. Como resultado desta técnica cria proteínas de fusão personalizáveis ​​que oferecem utilidade significativa para vários campos de pesquisa. Mais especificamente, a sequência da proteína biotinylatable foi incorporado em muitas proteínas alvo, devido à interacção de alta afinidade entre biotina com a avidina e estreptavidina. Esta adição tem ajudado no aumento da detecção e purificação de proteínas marcadas, bem como abrindo o caminho para aplicações secundárias, tais como separação de células. Assim, as moléculas marcadas com biotina mostram uma influência crescente e generalizada nos campos Bioindustrial e biomédicas. Para efeitos de nossa pesquisa, temos projetado proteínas de fusão biotinilado recombinantes contendo fator de crescimento do nervo (NGF) e semaphorin3A (SEMA3A) regiões funcionais. Nós temos descrito anteriormente como estas proteínas de fusão biotinilado, juntamente com outras sequências de proteínas activas, pode ser preso a biomateriais para a engenharia de tecidos e efeitos regenerativos. Este protocolo descreve os conceitos básicos de proteínas biotinylatable engenharia na escala miligrama, utilizando um vetor lac induzível T7 e E. hospedeiros de expressão de E. coli, a partir da transformação de aumento de escala e purificação.

Introduction

Proteínas de cobrir uma vasta gama de biomoléculas que são responsáveis ​​por muitas funções biológicas, levando à formação de tecido adequado e organização. Estas moléculas de milhares de iniciar as vias de sinalização que controlam a regulação positiva e / ou sub-regulação de genes e outras proteínas, mantendo o equilíbrio dentro do corpo humano. O rompimento de uma única proteína afeta toda esta teia de sinais, que podem levar ao aparecimento de distúrbios ou doenças devastadoras. Engenharia proteínas individuais no laboratório oferece uma solução para combater estes efeitos adversos e oferece uma alternativa aos medicamentos de pequenas moléculas. Em 1977, um gene que codifica a sequência de aminoácidos de somatostatina 14 foi um dos primeiros polipeptídeos engenharia criadas utilizando E. coli ^1. Logo depois, em 1979, a insulina foi clonado no plasmídeo pBR322, transformada, expressa, purificada e ^2. Desde então, as proteínas recombinantes têm expandido sua influência em vários campos da research como biomateriais, a entrega da droga, engenharia de tecidos, biofármacos, agricultura, enzimas industriais, biocombustíveis, etc (para revisões ver referências ^3-8). Isto é principalmente devido à versatilidade que a técnica oferece através da adição de porções de aplicação de produtos químicos específicos ou sequências de proteínas para fins incluindo, mas não limitado a, a identificação das proteínas alvo, de estabilização e de purificação.

Através da tecnologia de DNA recombinante, as proteínas recombinantes podem ser expressas em uma variedade de sistemas de hospedeiros eucariotas e procariotas, incluindo mamíferos, plantas, insectos, leveduras, fungos e bactérias. Cada host oferece diferentes vantagens e, normalmente, o melhor sistema é determinado com base na função da proteína, rendimento, estabilidade, custo total, e escalabilidade. Células de bactérias, muitas vezes não têm os mecanismos de modificação pós-traducionais que os anfitriões fornecem eucarióticas (ou seja, glicosilação, dissulfeto de transição, e tc.) ^5. Como resultado, os sistemas de mamífero e de insecto geralmente resultam em melhor compatibilidade e de expressão de proteínas eucarióticas, no entanto estes hospedeiros são geralmente mais caros e ⁹ demorado. Portanto, E. coli é o hospedeiro preferido para o nosso sistema de expressão, porque as células se expandem rapidamente em condições de crescimento de baixo custo e os mecanismos de expressão genética são bem compreendidos ^5,9. Além disso, este sistema é de fácil aumento de escala para fins de produção e resulta em proteínas funcionais, apesar da ausência de modificações pós-translacionais ^10. A E. coli K12 tensão é escolhida neste protocolo para a clonagem, porque esta estirpe oferece excelentes rendimentos plasmídeos baseados em alta eficiência de transformação. Além disso, uma E. coli estirpe BL21 utilizado para a expressão porque esta estirpe hospedeira contem o gene da RNA polimerase de T7, que proporciona a expressão da proteína e da estabilidade controlada ^11.

tenda "> Após a seleção anfitriã, mais cuidado deve ser tomado na escolha do vetor de expressão ideal para facilitar selecionados e controlados expressão da proteína. Sintetizando proteínas recombinantes começa com uma sequência de DNA alvo que é clonado sob a direção de transcrição bacteriófago T7 e sinais de tradução e expressão é induzida em células hospedeiras contendo cópias cromossómicas do gene da T7 ARN polimerase ^12. Estes vectores, derivados de pBR322 plasmídeo vector (para uma revisão ver referência ^13), é rigorosamente controlada pelo promotor T7 inicialmente desenvolvido por Studier e colegas ¹⁴ e fornecer adicional controlo por meio da inclusão do operador lac e o repressor lac (LAC1) ^15,16. Para a engenharia de proteína recombinante, este sistema de expressão oferece a possibilidade de adaptar a uma sequência específica de aminoácidos de uma proteína desejada através da inserção de sequências de DNA alvo diferentes ou para criar proteínas de fusão composta de domínio combinados de proteínas individuais. Além disso, algumas séries de vetores incluem modificações tag peptídeo a ser colocados no N ou C terminal. Para os nossos propósitos de desenho, uma histidina (His) tag foi adicionado à sequência de ADN alvo para a purificação e uma sequência de 15 aminoácidos biotinylatable foi incluído para biotinilação ^17,18. Neste protocolo de um plasmídeo contendo um gene de resistência à ampicilina, foi escolhido para realizar os nossos sequências de proteínas de fusão biotinylatable. A expressão é controlada por este vector, através do promotor lac de T7 e é facilmente induzida com isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG).

Expressões de ensaio (culturas em pequena escala) são usados ​​para determinar a presença e a solubilidade da proteína alvo, que pode ser expresso numa forma solúvel ou insolúvel para formular os procedimentos de purificação. Uma proteína solúvel expressa dentro da célula bacteriana será submetido a dobragem espontânea para manter a sua estrutura nativa ^19. Tipicamente, o nativoestrutura é termodinamicamente favorável. Em muitos casos, a actividade metabólica do hospedeiro não é favorável para a proteína alvo, colocando pressão no sistema que leva à produção de proteína insolúvel e a formação de corpos de inclusão na forma de agregados de proteínas insolúveis. Assim, a proteína alvo desnatura, tornando-os biologicamente inactivos, geralmente ^20. Ambas as expressões de ensaio são incrementados, e os procedimentos de isolamento é determinada pela solubilidade da proteína alvo. Um adicional de renaturação ou redobramento etapa é necessária para as proteínas insolúveis. As proteínas recombinantes resultantes podem ser ainda purificado usando cromatografia de exclusão de tamanho.

No casa de produção de proteína recombinante oferece vantagens de custo sobre os produtos comerciais desde miligramas de proteína alvo pode ser isolado por litro de cultura principal. A maior parte do equipamento necessário está disponível num laboratório biológico ou químico típico. Engenharia de proteínas permite a criaçãode proteínas de fusão de costume com funcionalidades adicionais que nem sempre estão disponíveis comercialmente. Figura 1 mostra os principais procedimentos envolvidos na engenharia de proteínas recombinantes. Com este sistema de expressão que criamos muitas proteínas biotinylatable, como o interferon-gama, fator de crescimento derivado das plaquetas e proteína morfogenética ^{óssea-21-23,} mas vamos nos concentrar em duas proteínas que nós projetamos para orientação do axônio, NGF (29 kDa ) e SEMA3A (91 kDa) ¹⁰ (para revisão ver referência ^24). A biotinilação é uma técnica comum para a identificação, a imobilização e isolamento de proteínas marcadas utilizando a interacção biotina-estreptavidina bem conhecido ^25-27. Sondas biofísicas ^28,29, biossensores ^30, e quantum dots ³¹ são alguns exemplos de sistemas que utilizam a alta afinidade de conjugação biotina-estreptavidina com um K _d da ordem de 10 ^-15 M ^27. A E. coli bioligase de estanho, BirA, auxilia na ligação covalente de biotina para a cadeia lateral de lisina encontrada no interior da sequência de biotina marcado ^18,32. Tethering biotina aos materiais e biomoléculas produziu entrega sustentada de fatores de crescimento para a célula para múltiplas aplicações em engenharia de tecidos ^21,33-35. Portanto, engenharia estas proteínas biotinylatable design personalizado é uma ferramenta poderosa que pode transcender a múltiplos interesses de pesquisa.

Protocol

1. Projecção da proteína alvo Usando o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obter uma sequência de aminoácidos para a proteína alvo tendo em conta as espécies de interesse e as variantes de emenda. Seleccionar a sequência de aminoácidos que corresponde à região activa de interesse da proteína. Nota: Para SEMA3A, aminoácidos 21-747 foram escolhidos. A proteína de fusão foi concebido com NGF, onde a sequência de barstar, amino…

Representative Results

Clonagem e Expressão de teste Quando chapeamento é realizado corretamente, único colônias isoladas devem formar a aumentar as chances de arrancar bactérias clonal transformaram células (Figura 2A). No entanto, se demasiadas células são plaqueadas, as placas são incubadas por muito tempo, a 37 ° C ou a transformação é questionável, as colónias podem cobrir a placa de ágar ou de formar agregados maiores de células (Figuras 2B</st…

Discussion

Engenharia de proteínas recombinantes é uma técnica muito poderosa que se estende por muitas disciplinas. É rentável, sintonizável e um procedimento relativamente simples, permitindo a produção de altos rendimentos de proteínas personalizados. É importante notar que a concepção e expressão de proteínas-alvo nem sempre é directa. Expressão basal e estabilidade da proteína recombinante depender de escolhas específicas de vetoriais, E. estirpes de E. coli, células de adições marca pep…

Materials

1,4-dithio–DL-threitol, DTT, 99.5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol	Chem-Impex International	642	250 ml
Acetic acid, glacial	EMD	AX0073-9	2.5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 g
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Antifoam 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	1 ml; Expression Host
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Gel filtration standard	Bio-Rad	151-1901	6 vials
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride	Chem-Impex International	152	1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88222	100 ml
Hydrochloric acid	EMD	HX0603-3	2.5 L
Imidazole	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli sample buffer	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface	Chem-Impex International	270	500 g
LB Broth	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Competent Cells	Novagen	69825	1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 pack
Potassium Chloride	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	500 g
Sodium phosphate diabasic	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Broth	Bioshop	TER409.5	5 kg
Tetracycline hydrochloride	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10X	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Tryptone, pancreatic	EMD	1.07213.1000	1 kg
Yeast extract, granulated	EMD	1.03753.0500	500 g
Name of Kits/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
ÄKTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Fraction Collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator	VWR	13271-102	Model 1156D
Heating Oven FD Series	Binder		Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Discontinued–Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 Rotor	Beckman Coulter	363055
JLA 8.1 Rotor	Beckman Coulter	969329	Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor	Beckman Coulter	368690
Laminar Flow Hood	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels	Bio-Rad	456-9036	Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column	Bio-Rad	737-2512	49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit	OMEGA bio-tek	D6943-01
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes	VWR	3119-0050	50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators	Corning	431488, 431483	20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service	GenScript USA Inc.		Protein Services
Ultrasonic Processor	Cole-Parmer	18910445A	Model CV18
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560