Introduction
Um dos desafios em curso em engenharia de tecido neural é a criação de um canal do nervo (NC) que imita a matriz extracelular, onde os nervos crescem naturalmente. A pesquisa mostrou que as células respondem a vários fatores em seu ambiente, incluindo mecânica, topográfica, adesivo e sinais químicos 1-3. Um dos principais desafios nesta área é determinar a combinação adequada de sinais e fabricação de um sistema que pode manter pistas por um longo período para apoiar o crescimento de células 4. Neurónios periféricos são conhecidos a preferir um substrato macio, ser dirigido por fibras alinhadas, e responder ao factor de crescimento do nervo (NGF) 5-7. CNs que pode fornecer pistas químicas durante semanas têm sido mostrados para proporcionar uma melhor recuperação funcional mais próximo ao de enxertos, o padrão ouro atual para o reparo do nervo 8,9.
Materiais e métodos de produção Vários pode ser usado para produzir mecânica e topográficoal deixas 10-13. Sinais mecânicos são inerentes ao material escolhido, fazendo com que a seleção do material apropriado para a aplicação crítica 1,13. Os métodos de produção para controlar sinais topográficos incluem a separação das fases, a auto-montagem e eletrofiação 1,13. Para aplicações em microescala, microfluídica, photopatterning, gravar, lixívias sal, ou espumas de gás também pode ser usado 14-17. Electrospinning surgiu como a forma mais popular para engenheiro substratos fibrosos para cultura de tecidos, devido à sua flexibilidade e facilidade de produção 13,18-23. Nanofibras electrospun são fabricados pela aplicação de uma alta tensão de uma solução de polímero fazendo-a afastar-se e estender-se através de um curto intervalo de descarga 24. Um andaime alinhado pode ser criado através da recolha das fibras num mandril rotativo ligado à terra e não alinhados andaimes são recolhidos numa placa fixa 25. Adesão de sinalização pode ser conseguida através do revestimento do engenho andaime fibrosoh fibronectina ou conjugação de um péptido de aderência, tal como RGD, para o HA antes electrospinning 26.
Sinais químicos, tais como fatores de crescimento, são as mais difíceis de manter por longos períodos, porque eles precisam de uma fonte de liberação controlada. Muitos sistemas foram tentou adicionar liberação controlada de redes fibrosas electrospun com níveis variados de sucesso. Estes métodos incluem electrospinning mistura, emulsão electrospinning, shell electrospinning núcleo e conjugação de proteínas 27. Além disso, electrospinning é tradicionalmente realizada num solvente volátil, o que pode afectar a viabilidade da proteína de 28, mantendo assim a bioactividade da proteína deve ser considerada.
Esta abordagem trata especificamente combinando, sinais químicos e adesivos mecânicos, topográficos para criar um andaime ajustável para o crescimento do nervo periférico. Mecânica de andaime é precisamente controlada pela sínteseÁcido Hialurônico metacrilado (HA). Os locais metacrila��o são usados para anexar fotos crosslinkers reativos. O material reticulado não é solúvel em água e é exclusivamente discriminado por enzimas 29. A quantidade de reticulação altera a taxa de degradação, mecânica e outras propriedades físicas do material. Usando HA com 30% metacrila��o, que tem um módulo de elasticidade de aproximadamente 500 Pa, cria um substrato macio que está perto das mecânica nativas de tecido neural e é tipicamente preferido pelos neurónios 26,29. Electrospinning sobre um mandril rotativo é usado para criar fibras alinhadas para um taco topográfico. Usando electrospinning juntamente com microesferas fornece sinais químicos no interior da armação ao longo de períodos prolongados. Para suportar o crescimento de neurites microesferas contendo NGF são utilizadas para criar o sinal químico. Ao contrário da maioria materiais electrospun HA é solúvel em água de modo que o NGF não encontrar solventes agressivos durante a produção. Para adicionar um sinal de adesivo, o scaffold é revestido com fibronectina. O sistema completo contém todos os quatro tipos de sinais acima descritos: fibras macias (mecânicos) alinhadas (topográficas) com NGF libertando microesferas (química) revestidos com fibronectina (adesivo). Produção e ensaio do presente sistema é descrito neste protocolo.
O processo começa com a produção de microesferas com um água-em-óleo-em-água de emulsão dupla. A emulsão é estabilizada com um agente tensioactivo, álcool polivinílico (PVA). A fase aquosa interna contém a proteína. Como é adicionada à fase de óleo, contendo o material de revestimento de PLGA dissolvido em diclorometano (DCM), o agente tensioactivo cria uma barreira entre as fases que protegem a proteína a partir de DCM. Esta emulsão é de outra fase dispersos em água contendo PVA para criar a superfície externa das microesferas. A emulsão estável é agitada para permitir que o DCM evapore. Depois de enxaguar e liofilização você é deixado com a microesferas cont secoaining a proteína.
Após as microesferas são concluídas eles estão prontos para ser electrospun em andaimes. Primeiro você preparar a solução electrospinning. A viscosidade da solução é crítico para a formação de fibras adequado. Soluções de puro HA não atender a esse requisito; PEO é adicionado como um polímero de suporte para permitir electrospinning. As microesferas são adicionadas à solução e electrospun resultando num andaime fibroso com microesferas distribuídas por toda parte.
Uma vez que a produção é completa, a proteína deve ser testada para verificar a sua viabilidade. Para fazer isso, uma célula primária que responde a NGF pode ser utilizada. Este protocolo utiliza Dorsal Root Ganglia (DRG) 8-10 dias de idade, os embriões de galinha. Os feixes de células são semeadas em scaffolds contendo microesferas cheias de NGF aqueles que estão vazios ou. Se o NGF é ainda viável você deve ver um maior crescimento neurite nas NGF contendo andaimes. Se o NGF não é mais viável que vainão promover neurites para ampliar e deverá ser semelhante ao controle.
O procedimento exacto aqui descrito é focada em suporte neural, no entanto, com modificações simples para o material, o método de electrospinning, e proteínas do sistema pode ser optimizado para vários tipos de células e tecidos.
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Protocol
1. água / óleo / água emulsão dupla Microsphere Produção
- Em primeiro lugar preparar a 2% e 0,5% w / v de solução de álcool polivinílico (PVA), em água desionizada. Mexa as soluções a 50 ° C até que claro, isso pode levar várias horas. Prepara-se uma solução de 2% v / v de álcool isopropílico em água desionizada.
- Prepara-se uma solução aquosa de proteína hidrófila desejado. A tabela abaixo fornece formulações de exemplo.
Tabela 1:. Exemplo soluções de proteína As seguintes soluções de proteína foram encapsulados com sucesso e electrospun usando esse protocolo. Outras soluções de proteína hidrófilas podem ser utilizados conforme necessário.
- Colocar 40 ml da solução de PVA a 0,5% para um tubo de centrífuga de 50 ml e de lado.
- Num tubo de centrífuga de 15 ml, dissolver 300 mg de 65:35poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), em 3 ml de diclorometano. Um misturador de vórtice pode ser usado para acelerar a dissolução de PLGA.
- Combinar 200 mL de solução de proteína e 4 ul de solução de PVA a 2%. Despejar a mistura de proteína na solução de PLGA (passo 1.4). As soluções irão permanecer na maior parte separada.
- Colocar o tubo em um copo de água com gelo. Usando um sonicador de varinha para ~ 10 Watts (RMS), agitar a solução durante alguns segundos (5-10) até uma emulsão branca cremosa uniforme é criado.
- Verta a emulsão para dentro do tubo de 50 ml contendo 0,5% de PVA (fase 1.3). Misture a solução a alta velocidade num misturador vortex durante ~ 20 seg. A solução vai desenvolver uma aparência turva.
- Transferir a emulsão para um copo de 200 ml e lugar numa placa de agitação a 350 rpm durante 2 min. Adicionar 50 ml de 2% de álcool isopropílico para o recipiente sobre a placa de agitação. Permitir que a mistura continue a agitar durante um período mínimo de 1 hora para permitir que o DCM evaporar-se e o PLGA a endurecer.
- Transferência de tele microesfera solução em tubos de centrifugação.
- Centrifugar a 425 xg por 3 min. As microesferas será coletado na parte inferior do tubo e aparecem em branco. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo, acima das microesferas, e armazenar em um frasco de 500 ml.
- Lavar as microesferas com água desionizada através do enchimento do tubo de três quartos cheio e agitando-a redistribuir as microesferas no líquido.
- Repita os passos de 1,10 e 1,11 de quatro vezes.
- Após a lavagem final, remover o sobrenadante e novamente lugar no frasco de 500 ml com as outras amostras. Congelar as microesferas recolhidas no tubo de centrífuga, em seguida, liofilizar durante pelo menos 24 horas.
- Visualize as microesferas sob um microscópio de luz ou com um microscópio eletrônico de varredura. Microesferas não maiores que 60 um são para electrospinning eficaz. Se microesferas são muito grandes, sonicando ou vórtex vezes maior pode ser necessária no passo 1.6 ou 1.7. <li> Guarde as microesferas secas em um freezer -20 ° C.
- Opcional: Usar um ensaio de proteína, as instruções do fabricante, para testar a quantidade de proteína na garrafa de 500 ml a partir do passo 30 de 1,10. Isto é usado para calcular a percentagem de proteína encapsulada em microesferas, subtraindo a quantidade de solução a partir do que foi usado no processo de produção.
Nota: Para visualizar a localização da proteína na microesfera adicionar Rodamina 2 ug / ml para a solução de PLGA 31 e encapsular uma proteína conjugada com FITC Figura 1 mostra um exemplo..
2. Eletrofiação com Microesferas
- Antes da preparação de solução de electrospinning, criar uma solução 0,5% w / v do foto-iniciador, em água deionizada por dissolução a 37 ° C. Este processo pode demorar várias horas.
- Criar um 2% w / v de metacrilado de ácido hialurónico (meha) (ver Burdick et al. De síntese), 29, 3%w / v de 900 kD de poli (óxido de etileno) (PEO) e 0,05% w / v solução de iniciador foto em água desionizada.
- Calcule a quantidade correta de MEHA e PEO para o volume desejado. Por exemplo, 10 ml de solução de electrospinning requer 200 mg de meha e 300 mg de PEO.
- Dissolve-se o PEO em água deionizada a 90% do volume final desejado (9 ml, para este exemplo). Isto pode levar várias horas, numa placa de agitação aquecida ou banho de água a 37 ° C pode ser usado para acelerar o processo.
- Em seguida adicione o meha e usar um misturador de vórtice de agitar a solução até estar límpida. Isso só vai levar alguns minutos.
- Finalmente adicionar a solução de iniciador foto 0,5% para preencher o volume restante 10% (1 ml para este exemplo).
- Adicionar microesferas na concentração desejada até 400 mg / ml. Misture a solução num misturador vortex até que as microesferas são distribuídas uniformemente na solução.
- Transferir a solução para uma seringa e anexar um de 6 polegadas de calibre 18 blagulha ponta UNT.
- Coloque a seringa em uma bomba de seringa e configurá-lo para dispensar a 1,2 ml / hr.
- Tape uma camada de folha de alumínio na placa de coleção ou mandril. Isso permite fácil limpeza e armazenamento do andaime acabado. Um mandril rotativo é usado para criar fibras alinhadas. Uma placa plana ou mandril estacionário irá resultar em fibras dispostas aleatoriamente.
- Conecte o fio terra a partir de uma fonte de alimentação de alta tensão para o aparelho de coleta. Ligue o fio positivo para a agulha.
- Ajustar a superfície da bomba de seringa e de recolha de modo que não é de 15 cm entre a ponta da agulha e a superfície de recolha.
- Iniciar o bombeamento de polímero, quando a solução é visível no final da seringa, ligar a fonte de tensão e ajuste a tensão de 24 kV. ATENÇÃO: Uma vez que a tensão é ligada não toque em qualquer parte metálica do sistema. Carga também podem saltar distâncias curtas a partir de partes eletrificadas para a pele.
- Execute a solução até despessura andaime esired é alcançado. Quando completa desligar fonte de tensão e bomba de seringa.
- Retire o papel alumínio com andaime anexado. Andaimes concluídas contendo proteína são armazenados num congelador de -20 ° C.
3. Protein Testing bioatividade
- Preparar meios de cultura de células. Adicionar 10% v / v de soro fetal bovino, 1% v / v de L-glutamina, e 1% v / v de Penicilina-Estreptomicina a meio de Eagle modificado por Dulbecco.
- Selecione lamelas de vidro que se encaixam completamente dentro de um poço da placa.
- Use 3 (Trimethoxysilyl) metacrilato de propilo para tratar as lamelas como descrito pelo fabricante. Metacrila��o aumenta a adesão ao cadafalso as lamelas.
- Anexar lamelas metacrilado para a área de cobrança da electrospinner com fita dupla face removível antes de eletrofiação. Girando sobre as lamelas facilita a manipulação e visualização.
- Electrospin a espessura desejada, tal como descrito acima.
- Aepois Eletrofiação remova cuidadosamente lamelas de mandril. Coloque o andaime lamínulas revestidas em uma câmara de nitrogênio claro e garantir que todo o oxigênio é removido.
- Coloque a câmara de andaime e a menos de 10 mW / cm 2 de 365 nm de luz durante 15 minutos. Após reticulação lugar em dimensão apropriada poços. Certifique-se de que o lado do andaime está voltado para cima.
- Coloque andaimes sob uma lâmpada germicida por 30 min para esterilizar. Se desejado fibronectina ou outra proteína é usado como um revestimento para melhorar a adesão das células. Siga as instruções do fabricante para andaimes casaco.
- Colheita gânglios da raiz dorsal (DRG), como descrito anteriormente por Hollenbeck 32. Uma DRG serão necessários para cada andaime coberto lamela testado.
- Coloque 100-200 mL de mídia em cada andaime na placa também. Com cuidado, coloque um em cada DRG andaime na gota de mídia. Para andaime de espessura podem ser necessários mais meios de comunicação; DRG precisam ser totalmente submersa e não Floating.
- Incubar o andaime e DRG, a 37 ° C durante 4 horas para permitir que a célula aderir ao andaime.
- Preencha os meios de comunicação para o nível apropriado para o bem e coloque de volta na incubadora. Continuar a incubação durante 4-6 dias.
- Após o período de incubação remova cuidadosamente os meios de comunicação de cada poço e lavar cuidadosamente uma vez com PBS. Fixar as células durante 30 minutos, utilizando 4% w / v de paraformaldeído.
- Células a mancha usando uma mancha de anticorpo para neurofilament. Isto irá permitir a visualização do crescimento de neurites para quantificação. DAPI também pode ser utilizado para visualizar os núcleos das células. Um exemplo de protocolo de coloração foi descrito por Sundararaghavan e colegas 14.
- Visualizar as células utilizando um microscópio de fluorescência.
- Coloque poços na fase do microscópio.
- Localize a massa celular usando as configurações de filtro e excitação para DAPI.
- Uma vez que a célula está a mudar de filtro FITC para visualizar as neurites prolongadas. Ucantar a função de ponto no microscópio coletar e combinar o número de imagens necessárias para ver toda a estrutura. Repita o procedimento para DAPI, FITC e campo claro.
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Representative Results
Microesferas de 50 ± 14 m de diâmetro com um encapsulamento de proteínas superior a 85% têm sido consistentemente produzidos e electrospun em andaimes. Tamanho foi determinada pela imagem amostras de microesferas de três lotes de produção separadas. As imagens capturadas onde num microscópio óptico e comprimentos de onde medida utilizando software de laboratório comercial. Figura 1 mostra um histograma da distribuição de tamanho. Taxa de encapsulação também foi testado a partir de três lotes de microesferas separadas, através da quantificação da proteína que escapem durante o processo de produção.
A Figura 2 mostra microesferas representativas com Rodamina (2 ug / ml) no -FITC PLGA albumina do soro de bovino e concha (BSA) encapsulado dentro. As imagens foram feitas usando um microscópio de fluorescência. A concha pode ser claramente visto (vermelho) com a proteína concentrada no interior (verde).
Para avaliar o encapsulamento, a microesferas foram cheios com BSA e testados quanto à libertação de proteínas com um ensaio de proteína de Bradford. PLGA quebra por hidrólise de ligações éster, criando espaços maiores para escapar proteína. As microesferas de libertação continua durante mais de 60 dias (Figura 3). O lançamento começa com uma explosão inicial, então, continua como microesferas quebrar.
Depois de electrospinning as microesferas pode ser visto ao longo da estrutura fibrosa 3D. Figura 4 mostra uma imagem SEM do andaime completo em que as esferas podem ser vistos em múltiplas camadas (indicado pelas setas). Distribuição das microesferas nos andaimes foi medido como sendo de 15,3 ± 3,6 mm / esferas 2. O andaime detém as microesferas no local impedindo a migração de distância do local de destino. Como as microesferas quebrar eles libertam o NGF no andaime para estimular o crescimento de neurites 33,34. Isto cria uma entrega contínua de proteína ao longo do andaime para suportar o crescimento de células e estimulam as células se infiltrarem no cadafalso.
Finalmente, gânglios da raiz dorsal (DRG), foram usadas para testar a viabilidade do NGF nas microesferas, no andaime. Figura 5 mostra um DRG semeadas num andaime contendo microesferas carregadas com NGF próxima para um contendo microesferas sem proteína em si. Existem extensões neurites mais longas que se estendem a partir da visíveis DRG no andaime NGF, indicando que o NGF permaneceram viáveis e é estimular o crescimento.
Figura 1 distribuição de tamanho Microsphere. Microesferas produzidas por este protocolo é de 50 ± 14 m de diâmetro. O gráfico mostra um histograma do diâmetro de microsferas em caixas de 5 um.
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Figura 2 Imagem Fluorescente de Microesferas. De 2 ug / ml de rodamina foi incluído na solução de PLGA para visualizar o escudo microesfera (vermelho) e BSA-FITC foi encapsulada para visualizar a proteína (verde). Proteína pode ser claramente visto dentro da esfera. Barra de escala = 20 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 Curva Proteína de lançamento. Libertação de BSA a partir de microsferas mais de 60 dias, foi medido utilizando um ensaio de proteína de Bradford. O assomo inicial é provavelmente devido a BSA que foi fixado à superfície exterior. À medida que a quebra de PLGA, a proteína é libertada ao longo do tempo.
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Figura 4. andaime contendo microesferas. Electrospinning O processo permite que as microesferas deve ser incorporado por toda a profundidade do andaime. (A) As setas indicam a localização das microesferas. Bar = 500 imagem m. (B) Ampliação alta escala de uma microesfera com as nanofibras de andaime acima dela. Barra de escala = 20 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. pilhas NGF Bioatividade de teste. Dorsal Root gânglios foram colhidas a partir de 8 dias de idade ovos de bico e semeadas em scaffolds com microesferas de NGF cheias (A) ou microesferas vazias (B). GDHforam coradas com um anticorpo de neurofilamento, anticorpo secundário FITC e DAPI para visualizar os núcleos das células. Imagens mostram um aumento no crescimento externo de neurite na presença de microesferas carregadas de NGF, tal como indicado por neurites coradas com FITC (verde). Isso mostra liberado NGF é viável e pode promover o crescimento. As imagens foram tiradas com um microscópio confocal. Scale bar = 200 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Muitos estudos têm mostrado que as células nervosas pode ser dirigido por sinais topográficos (alinhamento de fibra) e sinais químicos (fatores de crescimento) 1,2,10,11,35. Eletrofiação é um método fácil para criar fibras alinhadas. Factores de crescimento de estimular o crescimento do nervo, mas de modo a incluir os em condutas nervosas (NC), é necessário um método para libertação sustentada. Para criar um sistema mais robusto com as duas pistas, estes dois sinais devem ser combinados. Vários métodos têm sido estudados para proporcionar liberação prolongada de proteína dentro do arcabouço fibroso electrospun para a regeneração do nervo, mas nenhum até agora têm sido capazes de liberação sustentada por mais de 60 dias. Além disso, padronização de libertação do factor de crescimento não tem sido possível. Aqui nós descrevemos um sistema para combinar electrospinning com PLGA entrega microesfera para fornecer ambos os sinais.
Os métodos tradicionais para o fabrico de microesferas de PLGA, tais como o protocolo descrito por de Boer et al. </ Em>, produzido microesferas muito maiores 33 (300 ± 100 mm) que não poderia suportar o processo de eletrofiação. Várias tentativas de incorporá-los no andaimes foram infrutíferas. Isto levou à utilização de um sonicador, em lugar do misturador de vórtice, para dispersar melhor a primeira emulsão e criar esferas menores. Uma vez que as microesferas eram suficientemente pequena, que passou facilmente através da agulha e electrospun juntamente com o resto da solução. A solução de electrospinning primário neste protocolo é dissolvido em água, em vez de um solvente dura, para evitar danos no NGF e proporcionar um substrato para o crescimento de células hospitaleiro 28.
Muitos métodos foram testados para fornecer sinais topográficas e químicas aos locais de lesões nervosas. Algumas das tentativas iniciais para fornecer NGF lesões envolvido colocando soluções do NGF livre ou microesferas contendo NGF para o centro de um tubo de silicone sólido nervo (NF) 36. Estes screscimento do nervo upported; no entanto eles não fornecem pistas adicionais ou permitir que a capacidade de padrão a localização dos fatores de crescimento na NC. Em um exemplo mais recente Yan et. . ai utilizado poli [(ácido láctico)-CO - [(ácido glicólico) -alt- (L-lisina)]] (PLGL) modificado por enxerto de Gli-Arg-Gli-Asp-Gly (péptido RGD) e NGF para fabricar condutas nervosas PLGL-RGD-NGF 37. Da mesma forma, estes desde que o sinal químico que promoveu o crescimento do nervo, mas não forneceu outras pistas. Outro estudo utilizou NGF encapsulado em microesferas com andaimes electrospun acima e abaixo deles 38. Este sistema prevê ambas as pistas topográficas de um andaime fibroso em combinação com NGF como um sinal químico. No entanto, a libertação durou apenas uma semana, o que não é suficiente para suportar a reparação de nervos periféricos, e a localização das microesferas não é bem controlada.
Outros pesquisadores concentraram-se em incorporar os sinais químicos nas fibras. Uma atendidashod cria e emulsão da proteína hidrófila com um polímero hidrofóbico. Este método foi capaz de fornecer pistas topográficas e químicas, no entanto 60% da proteína foi lançado nos primeiros 12 dias 39. Outro exemplo usado electrospinning coaxial para encapsular NGF dentro de poli (ácido láctico-caprolactona) (P (LLA-CL)) fibras 40,41. Este método proporcionou resultados semelhantes ao de autógrafos em um modelo de nervo ciático de ratos. No entanto, equipamento especial é preciso para electrospinning coaxial e não está claro em que velocidade a proteína foi lançado, e se isso pode ser sustentado. A combinação de sinais topográficos na forma de fibras electrospun alinhados e sinais químicos através de microesferas que liberam por mais de dois meses, conforme descrito aqui, fornece pistas múltiplas sinérgicas e é altamente ajustável para proporcionar um ambiente personalizado.
Há várias questões que precisam ser considerados quando eletrofiação; fatores ambientais podem afetar eletrospinagem de qualquer solução. Uma mudança inesperada na umidade, por exemplo, pode ter um efeito significativo nos resultados electrospinning e causar fibras inconsistentes. Tendo uma sala separada que pode ser controlada ambientalmente é muito útil. Uma temperatura de 70 ° C com 50% de humidade foi utilizada para estas experiências. Outro problema potencial com um sistema de electrospinning é curto-circuitos; muitas vezes eles produzem faíscas óbvias entre a seringa e metal peças na bomba. Para evitar isso, lugar de plástico ou outro isolante entre elas; armazenamento de alimentos peso saco plástico funciona bem. Da mesma forma, as cargas elétricas dispersos no ambiente podem causar o material se acumular em locais inesperados. Para evitar isso, você pode criar um gabinete com placas de acrílico ou outro material isolante. Mais informações sobre como ajustar as condições de electrospinning podem ser encontrados na revisão de Sill 24.
Os próximos passos desse procedimento incluirá encapsular outro growth fatores para criar andaimes mais dinâmicos que contenham vários fatores de crescimento. Por exemplo, o NGF tem sido mostrada a funcionar sinergicamente com celular glial Factor de Crescimento Derivado de suportar neurónios sensoriais e motoras 3. Usando microesferas de PLGA, podemos controlar a taxa de liberação, alterando a L: razão G, o que nos permitiria entregar vários fatores de crescimento a uma taxa diferente. Um gradiente de as microesferas também podem ser gerados para construir um sistema de suporte mais complexo que dirige o comportamento das células. Além disso, factores de adesão vai ser conjugado directamente ao material de andaime através de uma reacção de adição de Michael 26. Finalmente, o sistema vai ser testado com um modelo de nervo ciático de rato, in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
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