Introduction
En af de aktuelle udfordringer i nervevæv teknik skaber en nerve ledning (NC), der efterligner den ekstra cellulære matrix, hvor nerverne vokser naturligt. Forskning har vist, at celler reagerer på flere faktorer i deres miljø, herunder mekaniske, topografiske, lim og kemiske signaler 1-3. En af de primære udfordringer på dette område er at fastlægge den rette kombination af signaler og opdigte et system, der kan opretholde stikord i en længere periode til at understøtte cellevækst 4. Perifere neuroner er kendt for at foretrække et blødt underlag, ledes af linie fibre og svare nervevækstfaktor (NGF) 5-7. NCs der kan give kemiske signaler i ugevis er blevet vist at tilvejebringe forbedret funktionel restitution tættere på allotransplantater, den nuværende guldstandarden til nervereparation 8,9.
Forskellige materialer og fremstillingsmetoder kan anvendes til at frembringe mekanisk og topografiskal køer 10-13. Mekaniske signaler er uløseligt forbundet med det valgte materiale, hvilket gør valget af den passende materiale for anvendelse kritiske 1,13. Produktionsmetoder til at styre topografiske tidskoder omfatter fase separation, selv-samling og electrospinning 1,13. Til mikroskala applikationer, mikrofluidik, photopatterning, ætsning, salt udvasker eller gas skum kan også anvendes 14-17. Electrospinning har vist sig som den mest populære måde at konstruere fiberholdige substrater for vævskultur grund af sin fleksibilitet og brugervenlighed produktion 13,18-23. Electrospun nanofibre er fremstillet ved anvendelse af en høj spænding til en polymer løsning får det til at frastøde sig og strække sig over en kort afstand til aflade 24. En afstemt stillads kan skabes ved at samle fibrene på en jordet roterende dorn og Alliancefri stilladser indsamles på en stationær plade 25. Adhæsion signalering kan opnås ved at overtrække den fibrøse stillads Vidh fibronectin eller konjugering vedhæftning peptid, såsom RGD, at HA før Electrospinning 26.
Kemiske signaler, såsom vækstfaktorer, er de mest vanskeligt at opretholde i længere tid, fordi de har brug for en kilde til kontrolleret frigivelse. Mange systemer er blevet forsøgt at tilføje kontrolleret frigivelse til electrospun fibrøse netværk med varierende grad af succes. Disse metoder omfatter blanding elektrospinning, emulsion elektrospinning, kerne-kappe elektrospinning og protein konjugering 27. Derudover er elektrospinning traditionelt udført i et flygtigt opløsningsmiddel, som kan påvirke levedygtigheden af proteinet 28 fastholder derfor bioaktiviteten af proteinet skal overvejes.
Denne tilgang specifikt kombinerer mekaniske, topografiske, kemiske og selvklæbende signaler for at skabe en indstillelig stillads til perifer nerve vækst. Scaffold mekanik styres præcist ved at syntetiseremethacryleret Hyaluronsyre (HA). De methacrylation websteder bruges til at vedhæfte foto reaktive tværbindere. Det tværbundne materiale ikke længere er vandopløselig og er udelukkende fordelt enzymer 29. Mængden af tværbinding ændrer nedbrydningshastigheden, mekanikere og andre fysiske egenskaber af materialet. Brug af HA med 30% methacrylation, som har et elasticitetsmodul på ~ 500 Pa, skaber en blød underlag, som er tæt på de indfødte mekanik nervevæv og er typisk foretrækkes af neuroner 26,29. Electrospinning på en roterende dorn benyttes til at skabe aligned fibre til et topografisk stikord. Brug electrospinning sammen med mikrokugler giver kemiske signaler inden stilladset over længere perioder. For at understøtte neurit vækst mikrosfærer indeholdende NGF anvendes til at skabe det kemiske signal. I modsætning til de fleste electrospun materialer HA er opløseligt i vand, således at NGF ikke støder stærke opløsningsmidler under produktionen. For at tilføje en klæbende signal, SCAffold er belagt med fibronectin. Den færdige Systemet indeholder alle fire typer signaler, der er beskrevet ovenfor: blød (mekanisk) vender (topografiske) fibre med NGF frigiver mikrosfærer (kemisk), belagt med fibronectin (lim). Produktion og afprøvning af dette system er beskrevet i denne protokol.
Processen begynder med fremstilling af mikrosfærer med en vand-i-olie-i-vand Double emulsion. Emulsionen er stabiliseret med et overfladeaktivt middel, polyvinylalkohol (PVA). Den indvendige vandfase indeholder proteinet. Som det er tilsat til oliefasen, der indeholder PLGA skalmateriale opløst i dichlormethan (DCM), det overfladeaktive middel danner en barriere mellem faserne beskytter proteinet fra DCM. Denne emulsion er end dispergeret i en anden vandfase indeholdende PVA for at skabe den ydre overflade af mikrokuglerne. Den stabile emulsion omrøres for at tillade DCM'en at fordampe. Efter skylning og lyofilisere du står tilbage med den tørre mikrosfærer fortsaining proteinet.
Efter mikrokuglerne er afsluttet de er klar til at blive electrospun i stillads. Først skal du forberede elektrospinningsprocessen løsning. Viskositeten af opløsningen er kritisk for korrekt fiberdannelse. Opløsninger af ren HA ikke opfylder dette krav; PEO tilsættes som en bærerpolymer for at tillade elektrospinning. Mikrokuglerne tilsættes til opløsningen, og electrospun resulterer i en fibrøs stillads med mikrosfærer fordelt overalt.
Når produktionen er færdig, skal proteinet testes for at kontrollere dens levedygtighed. For at gøre dette, kan en primær celle, der reagerer på NGF anvendes. Denne protokol bruger dorsalrodsganglier (DRG) 8-10 dage gamle kyllingeembryoner. Cellen bundter podes på stilladser indeholdende mikrosfærer fyldt med NGF eller dem, der er tomme. Hvis NGF er stadig levedygtige, bør du se forbedrede neurite vækst på NGF indeholder stilladser. Hvis NGF ikke længere er levedygtig det vilikke fremmer neuriter at udvide og bør ligne kontrollen.
Den nøjagtige procedure, der er beskrevet heri, er fokuseret på neurale støtte, dog med enkle modifikationer af materiale, elektrospinningsteknik metode og proteiner systemet kan optimeres til forskellige celle-og vævstyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vand / Olie / Vand Dobbelt emulsion Mikrokugle Produktion
- Først forberede 2% og 0,5% w / v opløsninger af polyvinylalkohol (PVA) i deioniseret vand. Rør de løsninger ved 50 ° C, indtil klar, kan det tage flere timer. Der fremstilles en opløsning af 2% v / v isopropylalkohol i deioniseret vand.
- Fremstille en vandig opløsning af den ønskede hydrofile protein. Tabellen nedenfor giver eksempler formuleringer.
Tabel 1:. Eksempel proteinopløsninger Følgende proteinopløsninger med succes er blevet indkapslet og electrospun hjælp af denne protokol. Kan der anvendes andre hydrofile proteinopløsninger efter behov.
- Anbring 40 ml af 0,5% PVA-opløsning i et 50 ml centrifugerør og afsat.
- I et 15 ml centrifugeglas opløses 300 mg 65:35poly (mælke-co-glycolsyre) (PLGA) i 3 ml dichlormethan. En Vortex-blander kan anvendes til at accelerere PLGA opløsning.
- Kombiner 200 pi proteinopløsning og 4 pi 2% PVA-opløsning. Hæld proteinblandingen i PLGA-opløsningen (trin 1.4). Løsningerne meste forbliver adskilt.
- Glasset anbringes i et bægerglas af isvand. Ved hjælp af en stav sonikator på ~ 10 watt (RMS), omrøre opløsningen i nogle få sekunder (5-10), indtil en ensartet cremet hvid emulsion er oprettet.
- Hæld emulsionen i 50 ml rør indeholdende 0,5% PVA (trin 1.3). Bland opløsningen ved høj hastighed på en vortex-mixer til ~ 20 sek. Løsningen vil udvikle en uklar udseende.
- Overfør emulsionen til en 200 ml bægerglas og sted på en omrøringsplade ved 350 rpm i 2 min. 50 ml 2% isopropylalkohol til bægerglasset på omrøringsplade. Lad blandingen fortsat omrøring i mindst 1 time for at tillade DCM'en at fordampe og PLGA at hærde.
- Transfer than Mikrokugle opløsning i centrifugerør.
- Centrifugeres ved 425 x g i 3 minutter. Mikrosfærerne samles i bunden af røret og synes hvidt. Fjern forsigtigt supernatanten fra røret, over mikrokugler, og opbevares i en 500 ml flaske.
- Skyl mikrosfærer med demineraliseret vand ved at fylde røret tre fjerdedele fuld og ryste det at omfordele mikrosfærerne i væsken.
- Gentag trin 1.10 & 1.11 fire gange.
- Efter den sidste skylning, supernatanten fjernes igen, og plads i 500 ml flaske med de andre prøver. Frys mikrokugleme indsamlet i centrifugeglasset, så lyofilisere mindst 24 timer.
- Pletterne af mikrosfærer under et lysmikroskop eller et scanningselektronmikroskop. Mikrosfærer ikke større end 60 um er effektiv elektrospinning. Hvis mikrosfærerne er for store, kan det være nødvendigt længere sonikering eller hvirvlende gange i trin 1.6 eller 1.7. <li> Opbevar de tørrede mikrosfærer i en -20 ° C fryser.
- Valgfrit: Brug en proteinanalyse, ifølge producentens anvisninger, for at teste mængden af protein i 500 ml flaske fra trin 1,10 30. Dette bruges til at beregne procentandelen af protein indkapslet i mikrokuglerne, ved at trække beløbet i opløsningen fra det, der blev anvendt i fremstillingsprocessen.
Bemærk: For at visualisere protein placering i mikrosfæren tilføje Rhodamin 2 ug / ml til PLGA-opløsningen 31 og indkapsle et FITC-konjugeret protein Figur 1 viser et eksempel..
2. Electrospinning med mikrosfærer
- Før fremstilling elektrospinningsteknik opløsning skabe en 0,5% w / v opløsning af fotoinitiator, i deioniseret vand ved at opløse ved 37 ° C. Denne proces kan tage flere timer.
- Opret en 2% vægt / vol methacryleret hyaluronsyre (Meha) (se Burdick et al. Til syntese) 29, 3%w / v 900 kD poly (ethylenoxid) (PEO) og 0,05% w / v foto-initiator opløsning i deioniseret vand.
- Beregn den korrekte mængde Meha og PEO for den ønskede lydstyrke. For eksempel, 10 ml elektrospinningsteknik løsning kræver 200 mg Meha og 300 mg PEO.
- Opløs PEO i deioniseret vand ved 90% af det ønskede slutvolumen (9 ml for dette eksempel). Dette kan tage flere timer, kan en opvarmet omrøringsplade eller et vandbad ved 37 ° C anvendes til at fremskynde processen.
- Næste tilføje Meha og bruge en hvirvelblander at røre opløsningen, indtil klar. Dette vil kun tage et par minutter.
- Endelig tilføje 0,5% foto initiator løsning til at udfylde de resterende 10% volumen (1 ml for dette eksempel).
- Tilføj mikrosfærer i den ønskede koncentration op til 400 mg / ml. Bland opløsningen på en vortex-blander, indtil mikrosfærerne er jævnt fordelt i opløsningen.
- Opløsningen overføres til en sprøjte og vedhæfte en 6 tommer 18 gauge blndt spids nål.
- Placer sprøjten i en sprøjte pumpe og sæt den til at dispensere ved 1,2 ml / time.
- Tape et lag af aluminiumsfolie om indsamling plade eller dorn. Dette giver mulighed for nem oprydning og opbevaring af det færdige stillads. En roterende dorn benyttes til at skabe aligned fibre. En flad plade eller stationær dorn vil resultere i tilfældigt arrangerede fibre.
- Forbind stelledning fra en højspændingsledning kilde til samling apparatet. Forbind den positive ledning til nålen.
- Juster sprøjtepumpe og indsamling overflade, således at der er 15 cm mellem nålespidsen og indsamling overflade.
- Start polymer pumpning, når opløsningen er synlig ved enden af sprøjten, tænde for spændingskilden og indstil spændingen til 24 kV. FORSIGTIG: Når spændingen er tændt må du ikke røre nogen metal del af systemet. Oplad kan også springe korte afstande fra elektrificeret dele til huden.
- Kør opløsningen, indtil desired stillads tykkelse er opnået. Når du er færdig slukke spændingskilde og sprøjte pumpe.
- Fjern folie med stillads vedlagt. Fuldførte stilladser, der indeholder protein, er lagret i en -20 ° C fryser.
3. Protein Bioaktivitet Testing
- Forbered celledyrkningsmedier. Tilsæt 10% v / v føtalt bovint serum, 1% v / v L-glutamin og 1% v / v penicillin-streptomycin til Dulbeccos Modified Eagles Medium.
- Vælg dækglas, der passer fuldstændigt ind i en brøndplade.
- Brug 3 (trimethoxysilyl) propylmethacrylat at behandle dækglassene som beskrevet af fabrikanten. Methacrylation øger stillads tilslutning til dækglas.
- Vedhæft methacrylerede dækglas til samlingen område af electrospinner med aftagelig dobbeltklæbende tape før electrospinning. Spinning onto dækglas letter håndtering og visning.
- Electrospin til den ønskede tykkelse, som beskrevet ovenfor.
- Enfter electrospinning forsigtigt fjerne dækglas fra dorn. Placer stilladset coatede dækglas i en klar kvælstof kammer og sikre, at alt ilt er udrenset.
- Placer kammeret og stillads under en 10 mW / cm 2 365 nm lys i 15 min. Efter tværbinding sted i passende størrelse brønde. Sørg for, at stilladset vender opad.
- Placer stilladser under en bakteriedræbende lampe i 30 minutter for at sterilisere. Hvis det ønskes fibronectin eller andet protein anvendes som en belægning for at forbedre celleadhæsion. Følg producentens anvisninger til at belægge stilladser.
- Harvest dorsalrodsganglier (DRG) som tidligere beskrevet af Hollenbeck 32. En DRG vil være behov for afprøvet hver stillads dækket dækglas.
- Placer 100-200 ml medier på hvert stillads i brønde. Anbring forsigtigt en DRG på hvert stillads i medierne dråbe. For tyk stillads kan være behov for flere medier; DRG skal være fuldt nedsænket og ikke floaTing.
- Inkubér stilladset og DRG ved 37 ° C i 4 timer for at gøre det muligt for cellen at holde sig til stilladset.
- Fyld medierne til det passende niveau for den godt og læg tilbage i inkubatoren. Fortsæt inkubation i 4-6 dage.
- Efter inkubationsperioden forsigtigt fjerne mediet fra hver brønd og forsigtigt vaske en gang med PBS. Fix celler i 30 minutter ved anvendelse af 4% w / v paraformaldehyd.
- Farv celler under anvendelse af et antistof pletten for neurofilament. Dette vil gøre det muligt at visualisere af neuritudvækst til kvantificering. DAPI kan også anvendes til at vise kernerne i cellerne. Et eksempel farvningsprotokollen blev beskrevet af Sundararaghavan og kolleger 14.
- Pletterne af cellerne under anvendelse af et fluorescensmikroskop.
- Placer godt plade på scenen af mikroskopet.
- Find cellemassen ved hjælp af filter og excitation indstillinger for DAPI.
- Når cellen er skifte filteret FITC at visualisere de udvidede neuritter. Usynge sting funktionen på mikroskopet indsamle og kombinere så mange billeder som er nødvendigt for at se hele strukturen. Gentag for DAPI, FITC og lyse felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrosfærer 50 ± 14 um i diameter med en over 85% protein indkapsling er blevet konsekvent produceret og electrospun i stilladser. Størrelse blev bestemt af imaging prøver af mikrokugler, fra tre forskellige produktionsserier. De billeder, hvor fanget på et optisk mikroskop og længder, hvor målt ved anvendelse af kommerciel lab software. Figur 1 viser et histogram af størrelsesfordelingen. Indkapslingshastigheden blev også testet fra tre separate mikrokugle partier, ved at kvantificere det protein, der undslap under fremstillingsprocessen.
Figur 2 viser repræsentative mikrosfærer med rhodamin (2 ug / ml) i PLGA skallen og bovint serumalbumin (BSA) -FITC indkapslet i. Billederne blev taget med et fluorescerende mikroskop. Skallen kan tydeligt ses (rød) med proteinet koncentreres på den indvendige (grøn).
At evaluere indkapsling mikrosfærens var fyldt med BSA og testet for protein frigivelse med en Bradford Protein Assay. PLGA nedbrydes ved hydrolyse af ester-bindinger, hvilket skaber større huller til protein flugt. Mikrosfærerne fortsætte frigive mere end 60 dage (Figur 3). Frigivelsen begynder med en indledende burst derefter fortsætter som mikrosfærer nedbryde.
Efter Electrospinning mikrosfærerne kan ses i hele 3D fibrøse struktur. Figur 4 viser et SEM-billede af hele skelettet, hvor kuglerne kan ses i flere lag (angivet med pile). Fordeling af mikrosfærer i skeletterne blev målt til at være 15,3 ± 3,6 kugler / mm 2. Stilladset holder mikrokuglerne i stedet forhindrer migration væk fra målområdet. Som mikrosfærerne nedbryde de frigiver NGF i stilladset for at fremme neurit vækst 33,34. Dette skaber en kontinuerlig levering af protein hele stillads til at understøtte væksten af celler og tilskynde celler til at infiltrere stilladset.
Endelig blev dorsalrodsganglierne (DRG) anvendes til at afprøve holdbarheden af NGF i mikrosfærerne, i stilladset. Figur 5 viser en DRG podet på et stillads mikrosfærer fyldt med NGF ved siden af en indeholdende mikrosfærer med ingen protein i dem. Der er længere neurit extensions synlige strækker sig fra DRG på NGF stillads, der indikerer, at NGF forblev levedygtige og stimulere væksten.
Figur 1. Mikrokugle størrelsesfordeling. Mikrosfærer fremstillet ved denne protokol er 50 ± 14 um i diameter. Grafen viser et histogram af mikrosfærediameter i 5 um spande.
2highres.jpg "/>
Figur 2. Fluorescerende Billede af mikrosfærer. 2 ug / ml rhodamin blev inkluderet i PLGA-opløsningen at visualisere mikrosfære skallen (rød) og BSA-FITC blev indkapslet at visualisere protein (grøn). Protein kan tydeligt ses i kuglen. Skala bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Protein Udgivelse Curve. BSA frigivelse fra mikrosfærerne end 60 dage blev målt ved hjælp af en Bradford Protein Assay. Den indledende burst skyldes sandsynligvis til BSA, der blev fastgjort til den ydre overflade. Som PLGA bryder ned, er proteinet frigives over tid.
/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Stillads indeholdende mikrosfærer. Elektrospinningsprocessen tillader mikrosfærer skal indarbejdes i hele dybden af stilladset. (A) Pile angiver placeringen af mikrosfærer. Målestok = 500 um. (B) høj forstørrelse billede af en mikrosfære med nanofibre fra stilladset ovenover. Skala bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. NGF Bioaktivitet Test. Dorsalrodsganglier primære celler blev høstet fra 8 dage gamle chick æg og podet på stilladser med NGF fyldte mikrosfærer (A) eller tomme mikrosfærer (B). DRGblev farvet med et neurofilament antistof FITC sekundært antistof og DAPI at visualisere cellekerner. Billeder viser øget neuritudvækst i nærvær af NGF mikrosfærer som indikeret ved FITC farvede neuritter (grøn). Dette viser udgivet NGF er levedygtig og kan fremme væksten. Billeder blev taget med et konfokalt mikroskop. Skala bar = 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange undersøgelser har vist, at nervecellerne kan rettes ved topografiske signaler (fiber justering) og kemiske signaler (vækstfaktorer) 1,2,10,11,35. Electrospinning er en let metode til at skabe aligned fibre. Vækstfaktorer fremme nerve vækst, men for at medtage dem i nerve kanaler (NC), er en metode til vedvarende frigivelse kræves. At skabe et mere robust system med både køer, bør disse to signaler kombineres. Flere metoder er tidligere blevet undersøgt for at give forlænget frigivelse af protein i den electrospun fibrøse stillads til nerveregenerering men ingen til dato har været i stand til vedvarende frigivelse for mere end 60 dage. Derudover har mønsterdannelse af vækstfaktor frigivelse ikke været muligt. Heri beskriver vi et system til at kombinere electrospinning med PLGA mikrosfære levering til at give begge signaler.
Traditionelle metoder til at fremstille PLGA mikrokugler, såsom protokollen beskrevet af de Boer et al. </ Em>, produceret meget større mikrosfærer 33 (300 ± 100 um), der ikke kunne modstå elektrospinningsprocessen. Adskillige forsøg på at integrere dem i stilladser var forgæves. Dette førte til anvendelsen af en sonikator, i stedet for vortex-blander, for bedre at sprede den første emulsion og skabe mindre kugler. Når mikrosfærerne var små nok, de let passerede gennem nålen og electrospun sammen med resten af opløsningen. Den primære elektrospinningsteknik opløsning i denne protokol er opløst i vand, snarere end en barsk opløsningsmiddel, for at forhindre beskadigelse af NGF og tilvejebringe et gæstfrit substrat for cellevækst 28.
Mange metoder er blevet testet for at give topografiske og kemiske signaler til nerveskade websteder. Nogle af de tidlige forsøg på at levere NGF til skader involveret sætte opløsninger af frit NGF eller mikrosfærer indeholdende NGF i centrum af et fast silicium nerve ledning (NC) 36. Disse filtreupported nervevækstfaktor; men de ikke giver yderligere information eller tillade evnen til at mønsteret placeringen af vækstfaktorer i NC. I en nyere eksempel Yan et. al. anvendes poly [(mælkesyre)-co - [(glycolsyre) -alt- (L-lysin)]] (PLGL) modificeret ved podning af Gly-Arg-Gly-Asp-Gly (RGD peptid) og NGF fabrikere PLGL-RGD-NGF nerve ledningerne 37. Tilsvarende gælder disse forudsat det kemiske signal, der fremmes nerve vækst, men gav ikke andre signaler. En anden undersøgelse anvendte NGF indkapslet i mikrosfærer med electrospun stilladser over og under dem 38. Dette system giver både topografiske tidskoder af en fibrøs stillads i kombination med NGF som en kemisk stikord. Imidlertid frigivelse varede kun en uge, hvilket ikke er lang nok til at understøtte perifer nerve reparation, og placeringen af mikrosfærerne ikke er velkontrolleret.
Andre forskere har fokuseret på at inkorporere de kemiske signaler ind i fibrene. Én opfyldtHod skaber og emulsion af den hydrofile protein med en hydrofob polymer. Denne metode kunne give topografiske og kemiske signaler, men 60% af proteinet blev udgivet i de første 12 dage 39. Et andet eksempel anvendes koaksiale electrospinning at indkapsle NGF inden poly (mælkesyre-caprolacton) (P (LLA-CL)) fibre 40,41. Denne metode forudsat lignende resultater autograf på en rotte iskiasnerven model. Dog er særligt udstyr behov for koaksial electrospinning og det er uklart, på hvilket niveau proteinet blev frigivet, og hvis dette kunne opretholdes. Kombinationen af topografiske signaler i form af på linie electrospun fibre og kemiske signaler gennem mikrosfærer, der frigiver i over 2 måneder, som beskrevet her, giver flere synergistiske tidskoder og er yderst afstemmelige at tilvejebringe et tilpasset miljø.
Der er flere spørgsmål, der skal overvejes, når electrospinning; miljømæssige faktorer kan påvirke electrospinning nogen løsning. En uventet ændring i luftfugtighed, for eksempel, kan have en betydelig effekt på elektrospinningsprocessen resultater og forårsage inkonsekvente fibre. Under et særskilt rum, der kan miljømæssigt styres er meget nyttigt. En temperatur på 70 ° C med 50% fugtighed blev anvendt til disse eksperimenter. Et andet potentielt problem med et electrospinning system er kortslutninger; de ofte skaber åbenlyse gnister mellem sprøjten og metalstykker på pumpen. For at forhindre dette sted plast eller en anden isolator mellem dem; opbevaring af fødevarer taske vægt plast fungerer godt. Ligeledes kan herreløse elektriske ladninger i miljøet forårsage væsentlig at ophobe sig i uventede steder. For at undgå dette kan du oprette en indhegning med acrylplader eller andet isolerende materiale. Yderligere oplysninger om justering af electrospinning betingelser kan findes i den anmeldelse af Sill 24.
De næste skridt for denne procedure vil omfatte indkapsle anden groGJ faktorer til at skabe mere dynamiske stilladser, der indeholder flere vækstfaktorer. For eksempel har NGF vist sig at fungere synergistisk med gliacelle vækstfaktor for at støtte sensoriske og motoriske neuroner 3. Brug PLGA mikrokugler, kan vi kontrollere frigivelseshastigheden ved at ændre L: G-ratio, der gør det muligt for os at levere forskellige vækstfaktorer på forskellige sats. En gradient af mikrosfærerne kan også genereres til at bygge en mere kompliceret støttesystem, der dirigerer celle adfærd. Derudover vil adhæsionsfaktorer konjugeres direkte til stillads materiale gennem en Michael additionsreaktion 26. Endelig vil systemet blive testet med en in vivo rotte iskiasnerven model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W.
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
