Introduction
Un des défis actuels de l'ingénierie de tissu neural est de créer un conduit de nerf (NC) qui imite la matrice extra-cellulaire, où les nerfs se développent naturellement. La recherche a montré que les cellules répondent à plusieurs facteurs dans leur environnement, y compris mécanique, topographique, adhésif et des signaux chimiques 1-3. L'un des principaux défis dans ce domaine est de déterminer la combinaison appropriée de signaux et la fabrication d'un système qui peut maintenir des repères pour une période prolongée pour soutenir la croissance de la cellule 4. Neurones périphériques sont connus pour préférer un substrat souple, être dirigées par des fibres alignées, et répondent au facteur de croissance des nerfs (NGF) 5-7. CN qui peuvent fournir des indices chimiques pendant des semaines ont été montré pour fournir une meilleure récupération fonctionnelle proche de celle des allogreffes, la norme de référence actuelle pour la réparation nerveuse 8,9.
Matériaux et des méthodes de production différentes peuvent être utilisées pour produire mécanique et topographiqueal Queues de 10-13. Indices mécaniques sont inhérentes à la matière choisie, ce qui rend le choix du matériel approprié pour l'application critique 1,13. Les méthodes de production de contrôler indices topographiques comprennent la séparation de phase, l'auto-assemblage et électrofilature 1,13. Pour les applications à micro, microfluidique, photopatterning, gravure, la lixiviation de sel, ou des mousses de gaz peut également être utilisé 14-17. Électrofilage a émergé comme le moyen le plus populaire pour concevoir des substrats fibreux pour la culture de tissus en raison de sa flexibilité et de la facilité de production 13,18-23. nanofibres de électrofilées sont fabriqués en appliquant une tension élevée à une solution de polymère amenant à se repousser et étirer sur un court intervalle de s'acquitter de 24. Un échafaudage aligné peut être créé par la collecte des fibres sur un mandrin en rotation à la terre et échafaudages non alignés sont collectées sur une plaque fixe 25. signalisation d'adhérence peut être obtenue en revêtant l'échafaudage fibreux esprith fibronectine ou la conjugaison d'un peptide d'adhérence, tels que RGD, de l'HA avant électrofilage 26.
Des signaux chimiques, tels que des facteurs de croissance, sont les plus difficiles à maintenir sur de longues périodes, car ils ont besoin d'une source pour une libération contrôlée. De nombreux systèmes ont été tenté d'ajouter libération contrôlée de réseaux fibreux électrofilées avec différents niveaux de succès. Ces méthodes incluent mélange électrofilature, émulsion électrofilature, coque centrale électrofilature et protéines conjugaison 27. En outre, électrofilature se fait traditionnellement dans un solvant volatil, ce qui peut affecter la viabilité de la protéine 28, donc le maintien de l'activité biologique de la protéine doit être envisagée.
Cette approche traite spécifiquement de combiner les signaux mécaniques, topographiques, chimiques et adhésifs pour créer un échafaudage réglable de croissance des nerfs périphériques. mécanique d'échafaudage est contrôlée avec précision par la synthèseméthacrylé acide hyaluronique (HA). Les sites de méthacrylation sont utilisés pour attacher photo agents de réticulation réactifs. Le matériau réticulé est plus soluble dans l'eau et est exclusivement décomposé par les enzymes 29. La quantité de réticulant modifie la vitesse de dégradation, de la mécanique et d'autres propriétés physiques du matériau. Utilisation de HA à 30% méthacrylation, qui a un module d'environ 500 Pa à la traction, crée un substrat souple qui est proche de la mécanique natifs de tissu neural et est généralement préférée par les neurones 26,29. Électrofilage sur un mandrin rotatif est utilisé pour créer des fibres alignées à un repère topographique. Utilisation électrofilature avec microsphères fournit des signaux chimiques dans l'échafaudage sur des périodes prolongées. Pour soutenir microsphères de croissance des neurites contenant NGF sont utilisés pour créer le signal chimique. Contrairement à la plupart des matériaux électrofilées HA est soluble dans l'eau de sorte que le NGF ne rencontre pas de solvants agressifs pendant la production. Pour ajouter un signal d'adhésif, la scaffold est enduite avec de la fibronectine. Le système complet comprend les quatre types de signaux décrits ci-dessus: alignement des fibres douces (mécaniques) topographiques (NGF) avec libération des microsphères (chimique) revêtue avec de la fibronectine (adhésif). Production et les essais de ce système est décrite dans ce protocole.
Le processus commence par la production de microsphères ayant une double émulsion eau-dans-huile-dans-eau. L'émulsion est stabilisée par un agent tensioactif, l'alcool polyvinylique (PVA). La phase aqueuse interne contient de la protéine. Comme il est ajouté à la phase huileuse, qui contient le matériau de coque PLGA dissous dans du dichlorométhane (DCM), le tensioactif forme une barrière entre les phases de protection de la protéine à partir du DCM. Cette émulsion est dispersée dans l'autre à la phase aqueuse contenant du PVA afin de créer la surface externe des microsphères. L'émulsion stable est agitée pour permettre le DCM à s'évaporer. Après rinçage et lyophilisation vous êtes de gauche avec la suite microsphères secaining la protéine.
Une fois que les microsphères sont remplis, ils sont prêts à être électrofilées dans les échafaudages. D'abord, vous préparez la solution de électrofilature. La viscosité de la solution est crucial pour la formation de fibres approprié. Solutions de HA pure ne répondent pas à cette exigence; PEO est ajouté en tant que polymère de support pour permettre électrofilage. Les microsphères sont ajoutées à la solution résultante et électrofilées dans un échafaudage fibreux avec des microsphères réparties sur l'ensemble.
Une fois que la production est terminée, la protéine doit être testé afin de vérifier sa viabilité. Pour ce faire, une cellule primaire qui répond au NGF peut être utilisé. Ce protocole utilise les ganglions rachidiens (DRG) du 8-10 jours embryons de poulet. Les faisceaux de cellules sont ensemencées sur des échafaudages contenant des microsphères remplies de NGF ou ceux qui sont vides. Si le NGF est encore viable, vous devriez voir une croissance accrue des neurites sur les échafaudages contenant NGF. Si le NGF n'est plus viable, il serapas promouvoir neurites pour étendre et devrait ressembler à la commande.
La procédure exacte décrite ici porte sur l'appui de neurones, cependant, avec des modifications simples à la matière, procédé électrofilage, et des protéines du système peut être optimisée pour différents types cellulaires et tissulaires.
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Protocol
1 Eau / Huile / Eau Double Emulsion production de microsphères
- Préparer d'abord 2% et 0,5% p / v des solutions d'alcool polyvinylique (PVA) dans l'eau désionisée. Incorporer les solutions à 50 ° C jusqu'à ce qu'il dégage, ce qui peut prendre plusieurs heures. Préparer une solution de 2% v / v d'alcool isopropylique dans de l'eau déminéralisée.
- Préparer une solution aqueuse d'une protéine hydrophile souhaitée. Le tableau ci-dessous fournit des exemples de formulations.
Tableau 1:. Exemple Protein Solutions Les solutions de protéine suivants ont été encapsulés avec succès électrofilées et en utilisant ce protocole. D'autres solutions de protéines hydrophiles peuvent être utilisés en fonction des besoins.
- Placer 40 ml de la solution de PVA à 0,5% dans un tube de 50 ml centrifugeuse et mettre de côté.
- Dans un tube à centrifuger de 15 ml dissoudre 300 mg de 65:35poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) dans 3 ml de dichlorométhane. Un mélangeur vortex peut être utilisé pour accélérer la dissolution du PLGA.
- Mélanger 200 ul de solution de protéine et 4 ul de solution de PVA à 2%. Verser le mélange de protéines dans la solution de PLGA (étape 1.4). Les solutions restent la plupart du temps séparé.
- Placer le tube dans un bêcher d'eau glacée. L'utilisation d'un appareil à ultrasons baguette à ~ 10 Watts (RMS), agiter la solution pendant quelques secondes (5-10) jusqu'à obtenir une émulsion crémeuse blanc uniforme est créé.
- Verser l'émulsion dans le tube de 50 ml contenant 0,5% de PVA (étape 1.3). Mélanger la solution à haute vitesse sur un vortex pendant environ 20 secondes. La solution sera de développer un aspect trouble.
- Transfert de l'émulsion dans un bécher de 200 ml et placer sur une plaque d'agitation à 350 tours par minute pendant 2 min. Ajouter 50 ml de 2% d'alcool isopropylique dans le bêcher sur la plaque d'agitation. Laisser le mélange sous agitation continue pendant au moins 1 heure pour permettre l'évaporation du DCM et le PLGA à durcir.
- Transfert til microsphère solution dans des tubes de centrifugation.
- Centrifuger à 425 g pendant 3 min. Les microsphères seront recueillir au bas du tube et apparaissent en blanc. Retirez délicatement le surnageant du tube, au-dessus des microsphères, et stocker dans une bouteille de 500 ml.
- Rincer les microsphères avec de l'eau déminéralisée en remplissant le tube aux trois quarts plein et en l'agitant de redistribuer les microsphères dans le liquide.
- Répétez les étapes 1.10 et 1.11 quatre fois.
- Après le rinçage final, éliminer le surnageant de nouveau et le placer dans la bouteille de 500 ml avec les autres échantillons. Geler les microsphères recueillies dans le tube de centrifugeuse, puis lyophiliser pendant au moins 24 heures.
- Visualisez les microsphères sous un microscope optique ou un microscope électronique à balayage. Microsphères ne dépassant pas 60 um sont pour électrofilature efficace. Si les microsphères sont trop grandes, plus sonication ou vortex temps peuvent être nécessaires à l'étape 1.6 ou 1.7. <li> Conserver les microsphères séchées dans un congélateur à -20 ° C.
- Facultatif: utiliser un dosage de protéines, selon les instructions du fabricant, pour tester la quantité de protéine dans le flacon de 500 ml à partir de l'étape 30 1,10. Il est utilisé pour calculer le pour cent de la protéine encapsulée dans des microsphères, en soustrayant la quantité de la solution à partir de ce qui a été utilisé dans le processus de production.
Remarque: Afin de visualiser la localisation de la protéine dans la microsphère ajouter Rhodamine 2 ug / ml de la solution de PLGA 31 et encapsuler une protéine conjuguée au FITC La figure 1 montre un exemple..
2. Électrofilage avec microsphères
- Avant de préparer la solution de filage électrostatique, créer une solution à 0,5% p / v de photo-initiateur, dans de l'eau désionisée par dissolution à 37 ° C. Ce processus peut prendre plusieurs heures.
- Créez un 2% p / v méthacrylé acide hyaluronique (Meha) (voir Burdick et al. Pour la synthèse) 29, 3%p / v 900 kD poly (oxyde d'éthylène) (PEO) et de 0,05% en poids / solution d'initiateur de photo v dans de l'eau désionisée.
- Calculer le montant exact de Meha et PEO pour le volume souhaité. Par exemple, 10 ml de solution nécessite électrofilage 200 mg de MEHA et 300 mg de POE.
- Dissoudre le PEO dans de l'eau désionisée à 90% du volume final désiré (9 ml pour cet exemple). Cette opération peut prendre plusieurs heures, une plaque d'agitation chauffée ou un bain d'eau à 37 ° C peuvent être utilisés pour accélérer le processus.
- Ensuite, ajoutez la meha et utiliser un vortex de remuer jusqu'à ce que la solution claire. Cela ne prendra que quelques minutes.
- Enfin ajouter la solution d'initiateur photo 0,5% pour remplir le volume restant de 10% (1 ml pour cet exemple).
- Ajouter microsphères à la concentration souhaitée allant jusqu'à 400 mg / ml. Mélanger la solution sur un agitateur vortex jusqu'à ce que les microsphères sont distribuées uniformément dans la solution.
- Transférer la solution dans une seringue et fixer un calibre 18 bl 6 poucesaiguille de pointe unt.
- Placez la seringue dans une pompe à seringue et mis à distribuer à 1,2 ml / h.
- Collez une feuille de papier d'aluminium sur la plaque de collection ou mandrin. Cela permet de faciliter le nettoyage et le stockage de l'échafaud fini. Un mandrin rotatif est utilisé pour créer des fibres alignées. Un plateau ou mandrin fixe se traduira par des fibres disposées au hasard.
- Connectez le fil de terre à partir d'une source d'alimentation haute tension de l'appareil de collecte. Connecter le fil positif à l'aiguille.
- Ajuster la surface de la pompe à seringue et la collecte de sorte qu'il n'y a 15 cm entre la pointe de l'aiguille et la surface de collecte.
- Lancer le pompage de polymère, lorsque la solution est visible à l'extrémité de la seringue, tourner sur la source de tension et régler la tension de 24 kV. ATTENTION: Une fois que la tension est allumé ne pas toucher une partie métallique du système. Charge peut également sauter sur de courtes distances à partir de pièces électrifiées pour la peau.
- Exécutez la solution jusqu'à ce que dépaisseur d'échafaudage esired est atteint. Lorsque vous avez terminé désactiver source de tension et la pompe à seringue.
- Retirer la feuille avec échafaudage fixé. Échafaudages remplis contenant des protéines sont stockées dans un congélateur à -20 ° C.
3. Protein Test bioactivité
- Préparation des milieux de culture cellulaire. Ajouter 10% v / v de sérum bovin fœtal, 1% v / v de L-glutamine et 1% v / v de pénicilline-streptomycine à milieu de Eagle modifié par Dulbecco.
- Sélectionnez des lamelles de verre qui correspondent complètement dans une plaque de puits.
- Utilisation de 3 (triméthoxysilyl) propyl méthacrylate de traiter les lamelles de la manière décrite par le fabricant. Méthacrylation améliore échafaud respect des lamelles.
- Fixez lamelles méthacrylés à la zone de collecte de la ElectroSpinner avec du ruban adhésif double face amovible avant électrofilature. Spinning sur les lamelles facilite la manipulation et la visualisation.
- Electrospin à l'épaisseur désirée, comme décrit ci-dessus.
- Après avoir Électrofilage retirer délicatement les lamelles de mandrin. Placez l'échafaud lamelles enrobées dans une chambre d'azote claire et veiller à ce que tout l'oxygène est purgé.
- Placer la chambre sous un échafaudage et 10 mW / cm 2 la lumière à 365 nm pendant 15 min. Après réticulation lieu dans la plaque et de taille appropriée. Assurez-vous que le côté de l'échafaudage vers le haut.
- La place des échafaudages sous une lampe germicide pendant 30 min à stériliser. Si la fibronectine ou tout autre protéine désirée est utilisé comme un revêtement pour améliorer l'adhérence cellulaire. Suivez les instructions du fabricant pour les échafaudages de manteau.
- Récolte les ganglions rachidiens (DRG) comme décrit précédemment par Hollenbeck 32. Un DRG sera nécessaire pour chaque lamelle d'échafaudage recouvert testé.
- Passer 100-200 ul de milieu sur chaque échafaudage dans la plaque de puits. Placez délicatement un DRG sur chaque échafaudage dans la gouttelette de médias. Pour échafaud épaisseur plus de médias peuvent être nécessaires; DRG doivent être entièrement immergé et non Floating.
- Incuber l'échafaud et DRG à 37 ° C pendant 4 heures pour permettre à la cellule de se conformer à l'échafaud.
- Remplissez les médias au niveau approprié pour le bien et remettez-le dans l'incubateur. Continuer incubation pendant 4-6 jours.
- Après la période d'incubation retirer soigneusement les médias de chaque puits et laver délicatement une fois avec PBS. Fixer les cellules pendant 30 min à l'aide de 4% en poids / volume de paraformaldéhyde.
- Cellules tache avec une tache d'anticorps pour neurofilaments. Cela permettra la visualisation de la croissance des neurites, pour la quantification. DAPI peut également être utilisé pour visualiser les noyaux des cellules. Un exemple de protocole de coloration a été décrit par Sundararaghavan et ses collègues 14.
- Visualisez les cellules en utilisant un microscope à fluorescence.
- Placez plaque bien sur la scène du microscope.
- Localisez la masse cellulaire en utilisant les filtres et d'excitation paramètres de DAPI.
- Une fois que la cellule est passer le filtre à FITC pour visualiser les neurites prolongées. Uchanter la fonction de point sur le microscope collecter et combiner autant d'images que nécessaire pour voir l'ensemble de la structure. Répétez l'opération pour DAPI, FITC et le champ lumineux.
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Representative Results
Microsphères 50 ± 14 um de diamètre avec une protéine encapsulation plus de 85% ont été régulièrement produite et électrofilé dans les échafaudages. Taille a été déterminée par l'imagerie des échantillons de microsphères de trois lots de production distinctes. Les images capturées sur lequel un microscope optique et où les longueurs mesurées en utilisant un logiciel commercial. Laboratoire La figure 1 montre un histogramme de la distribution de la taille. taux d'encapsulation a également été testé à partir de trois lots séparés de microsphères, par la quantification de la protéine qui a échappé pendant le processus de production.
La figure 2 montre des microsphères de représentation à la rhodamine (2 pg / ml) dans du PLGA -FITC coquille et albumine de sérum bovin (BSA) encapsulé à l'intérieur. Les images ont été prises avec un microscope à fluorescence. La coquille peut être clairement vu (rouge) avec la protéine concentrée sur l'espace intérieur (vert).
Pour évaluer l'encapsulation, la microsphères ont été remplis avec de la BSA et testés pour la libération de protéines avec un dosage de protéines Bradford. PLGA se décompose par hydrolyse des liaisons ester, créant des écarts plus importants pour la protéine évasion. Les microsphères continuent de libération depuis plus de 60 jours (Figure 3). La libération commence par une explosion initiale se poursuit alors que les microsphères se décomposent.
Après électrofilage les microsphères peuvent être vus à travers la structure fibreuse 3D. Figure 4 montre une image SEM de l'échafaudage complet où les sphères peuvent être vus dans plusieurs couches (indiqué par des flèches). Répartition des microsphères dans les échafaudages a été mesurée comme étant de 15,3 ± 3,6 sphères / mm 2. L'échafaudage détient les microsphères en place empêchant la migration hors du site cible. Comme les microsphères se décomposent, ils libèrent du NGF dans l'échafaudage pour encourager 33,34 de croissance des neurites. Cela crée une distribution continue de la protéine tout au long de l'échafaudage pour soutenir la croissance de et les cellules encourager à s'infiltrer dans l'échafaud.
Enfin, les ganglions de la racine dorsale (DRG) ont été utilisés pour tester la viabilité du NGF dans les microsphères, à l'intérieur de l'échafaudage. Figure 5 montre un DRG ensemencées sur un échafaudage contenant des microsphères chargées avec le NGF à côté de microsphères contenant une protéine sans en eux. Il ya plus extensions neuritiques visibles s'étendant de la DRG sur l'échafaud NGF, indiquant que le NGF est resté viable et stimule la croissance.
Figure 1 de la distribution de taille des microsphères. Microsphères produites par ce protocole sont de 50 ± 14 m de diamètre. Le graphique montre un histogramme du diamètre de la microsphère à 5 um bacs.
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Figure 2: l'éditeur de microsphères fluorescentes. 2 ug / ml de rhodamine a été inclus dans la solution de PLGA pour visualiser l'enveloppe de la microsphère (rouge) et BSA-FITC a été encapsulé pour visualiser la protéine (vert). Les protéines peuvent être clairement vu dans la sphère. Barre d'échelle = 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 protéines sortie de courbe. BSA libération des microsphères plus de 60 jours a été mesurée en utilisant un dosage de protéines Bradford. La salve initiale est probablement due à de la SAB qui était attaché à la surface extérieure. Comme le PLGA tombe en panne, la protéine est libérée au fil du temps.
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Figure 4 Échafaudages contenant des microsphères. Le processus de électrofilature permet microsphères à être incorporés dans toute la profondeur de l'échafaud. (A) Les flèches indiquant l'emplacement des microsphères. bar = 500 um d'image. (B) à fort grossissement à l'échelle d'une microsphère avec les nanofibres de l'échafaudage au-dessus. Barre d'échelle = 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 cellules primaires bioactivité du NGF test. Ganglions rachidiens ont été récoltées à partir de 8 jours de vieux oeufs de poulet et ensemencées sur des échafaudages avec des microsphères remplies NGF (A) ou des microsphères vides (B). DRGont été colorées avec un anticorps anti-neurofilaments, l'anticorps secondaire FITC et DAPI pour visualiser les noyaux cellulaires. Images montrent une augmentation de la croissance des neurites en présence de microsphères NGF chargés comme indiqué par neurites colorées FITC (vert). Cette montre a publié NGF est viable et peut favoriser la croissance. Les images ont été prises avec un microscope confocal. Barre d'échelle = 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
De nombreuses études ont montré que les cellules nerveuses peuvent être dirigées par des indices topographiques (alignement de la fibre) et des signaux chimiques (facteurs de croissance) 1,2,10,11,35. Électrofilage est une méthode facile pour créer des fibres alignées. Les facteurs de croissance stimulent la croissance du nerf, mais dans le but de les inclure dans des conduits nerveuses (NC), un procédé de libération prolongée est requise. Pour créer un système plus robuste avec les deux indices, ces deux signaux doivent être combinées. Plusieurs méthodes ont déjà été étudié pour assurer une libération prolongée de protéines dans l'échafaudage fibreux électrofilé pour la régénération des nerfs, mais aucun à ce jour ont été capable de libération prolongée pendant plus de 60 jours. En outre, la structuration du facteur de croissance de presse n'a pas été possible. Nous décrivons ici un système à combiner électrofilature avec la livraison de microsphères de PLGA de fournir les deux signaux.
Les méthodes traditionnelles pour fabriquer des microsphères de PLGA, comme le protocole décrit par de Boer et al. </ Em>, produit beaucoup plus microsphères 33 (300 ± 100 mm) qui ne pouvait pas supporter le processus de électrofilature. Plusieurs tentatives de les intégrer dans les échafaudages ont été infructueuses. Cela a conduit à l'utilisation d'un appareil à ultrasons, à la place du mélangeur vortex, afin de mieux disperser la première émulsion et de créer des petites sphères. Une fois que les microsphères sont suffisamment petits, ils passent facilement à travers l'aiguille et électrofilées avec le reste de la solution. La solution d'électrofilage primaire dans ce protocole est dissous dans de l'eau, plutôt qu'un solvant dur, pour éviter d'endommager le NGF et fournir un substrat hospitalier pour la croissance des cellules 28.
De nombreuses méthodes ont été testées pour fournir des signaux topographiques et chimiques à des sites de lésions nerveuses. Certaines des premières tentatives de fournir NGF à des blessures impliqués proposer des solutions de NGF libre ou microsphères contenant NGF dans le centre d'un solide conduit de nerf de silicium (NC) 36. Ces scroissance nerveuse upported; mais ils n'ont pas fourni des indices supplémentaires ou permettent la possibilité de modèle de l'emplacement des facteurs de croissance dans la NC. Dans un exemple plus récent Yan et. . al utilisé poly [(acide lactique)-CO - [(acide glycolique) -alt- (L-lysine)]] (PLGL) modifié par greffage Gly-Arg-Gly-Asp-Gly (peptide RGD) et NGF à fabriquer PLGL-RGD-NGF conduits 37 nerveuses. De même, ceux-ci à condition que le signal chimique qui a favorisé la croissance de nerf, mais n'ont pas fourni d'autres indices. Une autre étude a utilisé NGF encapsulé dans des microsphères avec des échafaudages électrofilées ci-dessus et en dessous de 38. Ce système ne fournit à la fois les indices topographiques d'un échafaudage fibreux en combinaison avec le NGF comme un signal chimique. Cependant, la libération n'a duré qu'une semaine, ce qui n'est pas assez long pour soutenir réparation des nerfs périphériques, et l'emplacement des microsphères n'est pas bien contrôlée.
D'autres chercheurs ont mis l'accent sur l'intégration des signaux chimiques dans les fibres. Un METhod crée et émulsion de la protéine hydrophile avec un polymère hydrophobe. Cette méthode a été en mesure de fournir des repères topographiques et chimiques, mais 60% de la protéine a été libéré dans les 12 premiers jours 39. Un autre exemple utilisé électrofilature coaxial pour encapsuler NGF dans le poly (acide lactique-caprolactone) (P (LLA-CL)) fibres 40,41. Cette méthode a donné des résultats similaires à l'autographe dans un modèle de nerf sciatique de rat. Toutefois, un équipement spécial est nécessaire pour électrofilature coaxial et on ne sait pas à quelle vitesse la protéine a été libéré, et si cela pouvait être soutenue. La combinaison de repères topographiques sous forme de fibres électrofilées alignés et signaux chimiques par des microsphères qui libèrent plus de 2 mois comme décrit ici, fournit de multiples indices synergiques et est très configurable pour fournir un environnement personnalisé.
Il ya plusieurs questions qui doivent être pris en compte lors électrofilature; facteurs environnementaux peuvent affecter electrosépinglage de toute solution. Un imprévu dans l'humidité, par exemple, peut avoir un effet significatif sur les résultats de électrofilature et causer des fibres incompatibles. Avoir une pièce séparée qui peut être contrôlé de l'environnement est très utile. Une température de 70 ° C avec 50% d'humidité a été utilisé pour ces expériences. Un autre problème potentiel avec un système d'électrofilage est un court-circuit; ils créent souvent des étincelles évidentes entre la seringue et les pièces métalliques de la pompe. Pour éviter cela, le plastique ou un autre endroit isolant entre eux; stockage des aliments le poids du sac plastique fonctionne bien. De même, les charges électriques parasites dans l'environnement peuvent causer un s'accumuler dans des endroits inattendus. Pour éviter cela, vous pouvez créer une enceinte avec des feuilles d'acrylique ou autre matériau isolant. Plus d'informations sur le réglage des conditions de électrofilature peut être trouvé dans la revue de Sill 24.
Les prochaines étapes de cette procédure comprendront encapsulation autre growth facteurs pour créer des échafaudages plus dynamiques contenant des facteurs de croissance multiples. Par exemple, le NGF a été montré à travailler en synergie avec le facteur de croissance dérivé des cellules gliales cellulaire pour soutenir les neurones sensoriels et moteurs 3. Utilisation de microsphères de PLGA, nous pouvons contrôler la vitesse de libération en modifiant le rapport L: G, ce qui nous permettra de proposer divers facteurs de croissance à taux différent. Un gradient de microsphères peut également être généré à construire un système de support plus complexe qui dirige le comportement des cellules. En outre, les facteurs d'adhésion sont conjugués directement à la matière d'accrochage par l'addition de la réaction de Michael d'un 26. Enfin, le système sera testé avec un modèle de rat in vivo du nerf sciatique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W.
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
