Introduction
En av de pågående utfordringer i nervevev teknikk er å skape en nerveledning (NC) som etterligner de ekstra cellulær matrise, hvor nerver vokse naturlig. Forskning har vist at cellene svare på flere faktorer i deres miljø, inkludert mekanisk, topografiske, lim og kjemiske signaler 1-3. En av hovedutfordringene i dette felt er å bestemme den passende kombinasjon av signaler, og fremstilling av et system som kan opprettholde signaler i en lengre periode for å støtte cellevekst 4. Perifere nerveceller er kjent for å foretrekker et mykt underlag, bli dirigert av innrettede fibre og svare på nervevekstfaktor (NGF) 5-7. Norsk kontinentalsokkel som kan gi kjemiske signaler i flere uker har vist seg å gi bedre funksjonell bedring tettere til det av allografter, gjeldende gullstandarden for nervereparasjon 8,9.
Forskjellige materialer og produksjonsmetoder kan anvendes for å produsere mekanisk og topografiskal Køer 10-13. Mekaniske signaler er iboende i materialet valgt, noe som gjør valg av passende materiale for anvendelse kritisk 1,13. Produksjonsmetoder for å kontrollere topografiske signaler inkluderer faseseparasjon, selv-montering og electro 1,13. For mikroprogrammer, MicroFluidics, photopatterning, etsing, salt igler, eller gass-skum kan også brukes 14-17. Electro har dukket opp som den mest populære måten å konstruere fibrøse underlag for vev kultur på grunn av sin fleksibilitet og enkel produksjon 13,18-23. Elektrospunnede nanofiltre er fremstilt ved å påføre en høy spenning til en polymeroppløsning slik at det å slå tilbake i seg selv, og strekker seg over en kort gap til å slippe ut 24. En justert stillaset kan skapes ved å samle fibrene på et jordet dreiende spindel og alliansefrie stillaser er samlet på en stillestående plate 25. Adhesjon signale kan oppnås ved å belegge den fibrøse stillaset with fibronektin eller conjugating en vedheft-peptid, slik som RGD, til HA før electro 26.
Kjemiske signaler, slik som vekstfaktorer, som er mest vanskelig å opprettholde over lengre perioder, fordi de trenger en kilde for kontrollert frigjøring. Mange systemer har blitt forsøkt å legge kontrollert utslipp til elektrospunnede fibernett med varierende grad av suksess. Disse metodene inkluderer blanding electrospinning, emulsjon electrospinning, core shell electrospinning og protein conjugation 27. I tillegg er elektrospinning tradisjonelt gjort i et flyktig oppløsningsmiddel, som kan påvirke levedyktigheten av proteinet 28, således opprettholde bioaktivitet av proteinet må tas i betraktning.
Denne tilnærmingen spesifikt omhandler kombinere mekanisk, topografiske, kjemiske og lim signaler for å skape en fleksibel stillas for perifer nerve vekst. Stillas mekanikk styres nøyaktig ved å syntetiseremethacrylated Hyaluronsyre (HA). De methacrylation nettsteder blir brukt til å feste foto reaktive crosslinkers. Den fornettede materialet ikke lenger er vannløselige og er utelukkende fordelt av enzymer 29. Mengden av tverrbindings endrer nedbrytningshastigheten, mekanikere og andre fysiske egenskaper av materialet. Ved hjelp av HA med 30% methacrylation, som har en strekkmodul ~ 500 Pa, skaper et mykt underlag som er nær de innfødte mekanikken i nervevev og er vanligvis foretrukket av nevroner 26,29. Elektrospinning på en roterende dor brukes til å skape innrettede fibre for en topografisk signalet. Ved hjelp av electro sammen med mikrosfærer gir kjemiske signaler i stillaset over lengre perioder. For å støtte neurite vekst-mikrokuler inneholdende NGF blir brukt til å skape det kjemiske signal. I motsetning til de fleste materialer elektrospunnede HA er oppløselig i vann slik at NGF ikke støter sterke løsningsmidler under fremstillingen. For å legge til en selvklebende signal, SCAffold er belagt med fibronectin. Det ferdige systemet inneholder alle fire typer signaler som er beskrevet ovenfor: myke (mekanisk) justert (topografiske) fibrer med NGF slippe sfærer (kjemisk) belagt med fibronectin (lim). Produksjon og testing av dette systemet er beskrevet i denne protokollen.
Prosessen begynner med fremstillingen av mikrokuler med en vann-i-olje-i-vann-emulsjon dobbel. Emulsjonen er stabilisert med et overflateaktivt middel, polyvinylalkohol (PVA). Den indre vannfasen inneholder proteinet. Som det tilsettes til oljefasen, inneholdende PLGA skallmaterialet oppløst i diklormetan (DCM), opprettes det overflateaktive middel en barriere mellom fasene beskytte proteinet fra DCM. Denne emulsjon er enn dispergert i en annen vannfase som inneholder PVA for å lage den ytre overflaten av mikrokulene. Den stabile emulsjon blir omrørt for å tillate DCM til å fordampe. Etter skylling og lyofilisere er du igjen med tørre mikrosfærer fortsaining proteinet.
Etter sfærer er fullført de er klar til å bli elektrospunnede inn stillaser. Først du forberede electro løsning. Viskositeten av løsningen er kritisk for riktig fiberdannelse. Løsninger av ren HA ikke oppfyller dette kravet; PEO er tilsatt som en bærer polymer for å tillate elektrospinning. Mikrokulene blir tilsatt til oppløsningen og elektrospunnede resulterer i en fibrøs stillas med mikrosfærer fordelt i hele.
Når produksjonen er fullført, bør proteinet bli testet for å verifisere sin levedyktighet. For å gjøre dette, kan en primær celle som reagerer på NGF brukes. Denne protokollen bruker de dorsale nerveknutene (DRG) fra 8-10 dag gamle kylling embryoer. Cellen bunter sås på stillaser som inneholder mikrosfærer fylt med NGF eller de som er tom. Hvis NGF er fortsatt levedyktig bør du se forbedret neurite vekst på NGF inneholder stillaser. Dersom NGF ikke lenger er levedyktig det vilikke fremme neurites å utvide og bør ligne på kontrollen.
Den nøyaktige fremgangsmåte som er beskrevet heri er fokusert på nevrale støtte, men med enkle modifikasjoner av materialet, electro fremgangsmåte og proteiner kan systemet bli optimalisert for forskjellige celler og vevstyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vann / olje / vann-Double Emulsion mikrosfære Produksjon
- Først forberede 2% og 0,5% vekt / volum oppløsninger av polyvinylalkohol (PVA) i avionisert vann. Rør løsningene ved 50 ° C til klart, kan dette ta flere timer. Tilbered en oppløsning av 2% volum / volum isopropylalkohol i avionisert vann.
- Tilbered en vandig oppløsning av det ønskede hydrofile protein. Tabellen nedenfor gir eksempel formuleringer.
Tabell 1:. Eksempel Protein Solutions De følgende proteinløsninger har blitt innkapslet og elektrospunnede bruker denne protokoll. Andre hydrofile proteinoppløsninger kan benyttes etter behov.
- Plasser 40 ml av 0,5% PVA-løsningen i en 50 ml sentrifugerør og satt til side.
- I et 15 ml sentrifugerør oppløse 300 mg av 65:35poly (melkesyre-ko-glykolsyre) (PLGA) i 3 ml diklormetan. En virvelblander kan benyttes for å akselerere PLGA oppløsning.
- Kombiner 200 mL av proteinoppløsningen og med 4 pl 2% PVA-løsning. Hell den proteinblanding inn i PLGA-oppløsningen (trinn 1.4). Løsningene vil forbli stort sett separat.
- Plasser slangen i et beger med isvann. Ved hjelp av en tryllestav sonicator på ~ 10 Watt (RMS), agitere løsningen i noen sekunder (5-10) inntil en jevn kremhvit emulsjon er opprettet.
- Hell emulsjonen inn i 50 ml rør inneholdende 0,5% PVA (trinn 1.3). Bland løsningen ved høy hastighet på en vortex-blander for ~ 20 sek. Løsningen vil utvikle en skyet utseende.
- Overfør emulsjonen til en 200 ml begerglass og plasser på en røreplate ved 350 rpm i 2 min. Tilsett 50 ml av 2% isopropanol i begerglasset på røreplaten. Tillat blandingen å fortsette omrøring i minst 1 time for å tillate at DCM til å fordampe og PLGA å herde.
- Transfer than mikrosfære løsningen i sentrifugerør.
- Sentrifuger ved 425 x g i 3 min. Mikrosfærene vil samle seg på bunnen av røret, og synes hvitt. Fjern forsiktig supernatanten fra røret, over sfærer, og oppbevar i en 500 ml flaske.
- Skyll mikrosfærene med avionisert vann ved å fylle røret tre fjerde full og riste det å omfordele mikrosfærene i væsken.
- Gjenta trinn 1.10 og 1.11 fire ganger.
- Etter siste skylling, fjern supernatanten igjen og plass på 500 ml flaske med de andre prøvene. Fryse mikrosfærene samlet i sentrifugerør, og deretter lyofilisere i minst 24 timer.
- Visual mikrosfærene under et lysmikroskop eller med et elektronmikroskop. Mikrokuler ikke er større enn 60 mikrometer er for effektiv elektrospinning. Hvis mikrokulene er for stor, kan lengre sonicating eller virvling ganger være nødvendig i trinn 1.6 eller 1.7. <li> Oppbevar de tørkede sfærer i en -20 ° C fryser.
- Alternativ: Bruk et protein assay, i henhold til produsentens instruksjoner, for å teste hvor mye protein i 500 ml flaske fra trinn 1.10 30. Dette blir brukt til å beregne prosent av proteinet innkapslet i mikrokulene, ved å trekke fra mengden i oppløsningen fra det som ble benyttet i produksjonsprosessen.
Bemerk: For å visualisere proteinet sted i mikrosfære legge Rhodamine 2 pg / ml til PLGA-løsning 31 og innkapsle et FITC-konjugert protein Figur 1 viser et eksempel..
2. electro med Microspheres
- Før fremstilling av elektrospinning løsning, oppretter en 0,5% w / v løsning av fotoinitiator, i avionisert vann ved oppløsning ved 37 ° C. Denne prosessen kan ta flere timer.
- Opprett en 2% w / v methacrylated hyaluronsyre (MEHA) (se Burdick et al. For syntese) 29, 3%w / v 900 kD poly (etylenoksid) (PEO) og 0,05% w / v foto initiator-løsning i avionisert vann.
- Beregne riktig mengde MEHA og PEO for ønsket volum. For eksempel, 10 ml electro løsningen krever 200 mg MEHA og 300 mg av PEO.
- Oppløs PEO i avionisert vann ved 90% av det ønskede sluttvolum (9 ml for dette eksempel). Dette kan ta flere timer, kan et oppvarmet røreplate eller et vannbad ved 37 ° C benyttes for å akselerere prosessen.
- Deretter tilsettes MEHA og bruke en vortex mixer å hisse løsningen inntil klart. Dette vil bare ta noen få minutter.
- Tilsett til slutt 0,5% bildet initiator-løsning for å fylle de gjenværende 10% volum (1 ml for dette eksempel).
- Legg mikrokuler i den ønskede konsentrasjon opp til 400 mg / ml. Bland løsning på en vortex-blander inntil mikrokulene er jevnt fordelt i oppløsningen.
- Overfør løsningen på en sprøyte og sett på en 6 tommers 18 gauge blunt tip nål.
- Plasser sprøyten i en sprøytepumpe og sett den til å dispensere ved 1,2 ml / time.
- Tape et lag av aluminiumsfolie på oppsamlingsplaten eller mandrel. Dette gir enkel opprydding og oppbevaring av det ferdige stillaset. En roterende spindel benyttes til å lage innrettede fibre. En flat plate eller stasjonær dor vil resultere i tilfeldig ordnet fibre.
- Koble jordledningen fra en høy spenning strømkilde til samlingen apparat. Koble den positive ledningen til nålen.
- Juster sprøytepumpe og oppsamlingsflate, slik at det er 15 cm mellom nålespissen og oppsamlingsflate.
- Start polymer pumping, når løsningen er synlig i enden av sprøyten, slå på spenningskilden og sette spenningen til 24 kV. FORSIKTIG: Når spenningen er slått på ikke røre noe metall del av systemet. Charge kan også hoppe korte avstander fra elektrifisert deler til huden.
- Kjør løsningen før desired stillaset tykkelse er oppnådd. Når du er ferdig slår du av spenningskilde og sprøytepumpe.
- Fjern folien med stillas vedlagt. Utførte stillas som inneholder protein blir lagret i en -20 ° C fryser.
3. Protein bioaktiviteten Testing
- Forbered cellekulturmedier. Tilsett 10% v / v kalvefosterserum, 1% volum / volum L-glutamin og 1% v / v Penicillin-Streptomycin i Dulbeccos modifiserte Eagles medium.
- Velg glassDekk som passer helt inn i en brønn plate.
- Bruk 3- (Trimethoxysilyl) propyl-metakrylat for å behandle Dekkglass som beskrevet av produsenten. Methacrylation forbedrer stillaset tilslutning til Dekkglass.
- Fest methacrylated Dekk til samlingen område av electrospinner med avtagbar dobbeltsidig tape før electro. Spinning på Dekk letter håndtering og visning.
- Electrospin til ønsket tykkelse, som beskrevet ovenfor.
- After electro forsiktig fjerne dekkglass fra dor. Plasser stillaset belagt dekkglass i en klar nitrogen kammer og sørge for at all oksygen er renset.
- Plasser kammeret og stillaset under 10 mW / cm 2 365 nm lys i 15 min. Etter kryssbinding sted til riktig størrelse vel plate. Sørg for at stillaset siden vender opp.
- Plasser stillaser under a bakteriedrepende lampe i 30 min for å sterilisere. Hvis ønskelig fibronektin eller annet protein blir brukt som et belegg for å forbedre celle adhesjon. Følg produsentens instruksjoner for å belegge stillaser.
- Innhøsting Dorsal nerveknutene (DRG) som tidligere beskrevet av Hollenbeck 32. En DRG vil være nødvendig for hver stillaset dekket dekk testet.
- Plasser 100-200 pl av mediet på hver stillaset i brønnplate. Plasserer en DRG nøye på hver stillas i media dråpene. For tykk stillas flere medier kan være nødvendig; DRG må være helt under vann og ikke floaTing.
- Inkuber stillaset og DRG ved 37 ° C i 4 timer for å tillate cellen å følge den stillaset.
- Fyll media til et passende nivå for brønnen og sett tilbake i inkubatoren. Fortsett ruger for 4-6 dager.
- Etter inkubasjonstiden Fjern forsiktig medier fra hver brønn og forsiktig vaske en gang med PBS. Løs-celler i 30 minutter ved anvendelse av 4% w / v paraformaldehyd.
- Flekk celler ved hjelp av et antistoff flekken for neurofilament. Dette vil tillate visual av neurite utvekst for kvantifisering. DAPI kan også brukes til å vise kjerner av cellene. Et eksempel farging protokollen ble beskrevet av Sundararaghavan og kolleger 14.
- Visual cellene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
- Plasser brønn plate på scenen av mikroskopet.
- Finn cellemassen ved hjelp av filtrer og eksitasjon innstillinger for DAPI.
- Når cellen er skifte filteret til FITC for å visualisere de utvidede neurites. Usynge stingfunksjon på mikroskopet samle og kombinere så mange bilder som nødvendig for å se hele strukturen. Gjenta for DAPI, FITC og lyse felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrokuler 50 ± 14 mikrometer i diameter med en over 85% protein innkapsling har vært konsekvent produsert og elektrospunnede i stillaser. Størrelse ble bestemt ved å avbilde prøver av mikrokuler fra tre separate produksjonspartier. Bildene der fanges opp på et optisk mikroskop og lengder, hvor målt ved bruk av kommersielt laboratorium programvare. Figur 1 viser et histogram av den størrelsesfordeling. Innkapsling Renten ble også testet fra tre separate mikrosfære partier, ved å tallfeste proteinet som rømte under produksjonsprosessen.
Figur 2 viser representative mikrosfærer med Rhodamine (2 ug / ml) i PLGA skall og bovint serumalbumin (BSA) FITC innkapslet i. Bildene ble tatt med et fluorescerende mikroskop. Skallet kan sees tydelig (rød) med protein konsentrert på interiøret (grønn).
For å evaluere innkapsling, mikros var fylt med BSA og testet for protein utgivelsen med en Bradford Protein Assay. PLGA bryter ned ved hydrolyse av ester obligasjoner, noe som skaper større åpninger for protein flukt. Mikrosfærene fortsette å slippe over 60 dager (figur 3). Frigivelsen begynner med en innledende utbrudd fortsetter deretter som mikrosfærer bryte ned.
Etter electro mikrosfærene kan ses gjennom 3D fiberstruktur. Figur 4 viser et SEM-bilde av den komplette stillaset hvor kulene kan sees i flere lag (indikert ved pilene). Fordeling av mikrosfærer i stillasene ble målt til å være 15,3 ± 3,6 kuler / mm 2. Stillaset har mikrokulene på plass hindrer migrering bort fra målstedet. Som sfærer bryte ned de slipper NGF i stillaset for å oppmuntre neurite vekst 33,34. Dette skaper en kontinuerlig levering av protein i hele stillaset til å understøtte veksten av celler og stimulerer cellene til å infiltrere inn i stillaset.
Til slutt ble de dorsale nerveknutene (DRG) brukes til å teste levedyktighet av NGF i sfærer, innenfor stillas. Figur 5 viser en DRG sådd på et stillas som inneholder mikrosfærer lastet med NGF ved siden av en som inneholder mikrosfærer med ingen protein i dem. Det er lengre neurite utvidelser synlige strekker seg fra DRG på NGF stillaset, som indikerer at NGF forble levedyktig og stimulere til vekst.
Figur 1. mikrosfære størrelsesfordeling. Mikrokuler fremstilt ved denne protokollen er 50 ± 14 pm i diameter. Grafen viser et histogram av diameteren microsphere i fem mikrometer binger.
2highres.jpg "/>
Figur 2. Fluorescerende Bilde av 2 pg / ml Rhodamine mikrokuler. Ble inkludert i PLGA-løsning for å visualisere mikrosfære skall (rød) og BSA-FITC ble innkapslet for å visualisere proteinet (grønn). Protein kan tydelig sees innenfor sfæren. Scale bar = 20 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Protein Slipp Curve. BSA utgivelse fra mikrosfærer over 60 dager ble målt ved hjelp av en Bradford Protein Assay. Den første serie er sannsynlig på grunn av BSA som var festet til den ytre overflate. Som PLGA bryter sammen, blir protein frigjøres over tid.
/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Stillasinneholdende mikrokuler. The electro Prosessen tillater mikrokulene som skal innlemmes i hele dybden av stillaset. (A) Piler indikerer plasseringen av mikrosfærer. Skala bar = 500 um. (B) høy forstørrelse bilde av en mikrosfære med nanofiltre fra stillaset over den. Scale bar = 20 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. NGF bioaktivitet Test. Dorsal nerveknutene primære celler ble høstet fra 8 dager gamle dama egg og sådd på stillaser med NGF fylt sfærer (A) eller tomme sfærer (B). DRGsble farget med en neurofilament antistoff, FITC sekundært antistoff og DAPI å visualisere cellekjerner. Bilder viser økt neurite utvekst i nærvær av NGF lastet sfærer som indikert av FITC farget neurites (grønn). Dette viser utgitt NGF er levedyktig og kan fremme vekst. Bilder ble tatt med en konfokal mikroskop. Scale bar = 200 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange studier har vist at nerveceller kan bli regissert av topografiske signaler (fiber justering) og kjemiske signaler (vekstfaktorer) 1,2,10,11,35. Elektrospinning er lettvinte metode for å lage innrettede fibre. Vekstfaktorer stimulere nervevekst, men for å inkludere dem i nerve ledninger (NC), er en fremgangsmåte for vedvarende frigjøring er nødvendig. Å skape et mer robust system med både pekepinner, bør disse to signalene kombineres. Flere metoder har blitt tidligere studert for å gi forlenget frigjøring av protein i den elektrospunnede fibrøst stillas for nerve regenerering, men ingen til dags dato har vært i stand til vedvarende frigivelse i over 60 dager. I tillegg fordelingen av vekstfaktor frigjøring har ikke vært mulig. Heri vi beskriver et system for å kombinere elektrospinning med PLGA mikrosfære levering til å gi begge signaler.
Tradisjonelle metoder for å fremstille PLGA mikrokuler, så som protokollen beskrevet av de Boer et al. </ Em>, produseres mye større mikrokuler 33 (300 ± 100 mikrometer) som ikke kunne tåle de elektrospinning prosessen. Flere forsøk på å innlemme dem i stillasene var mislykket. Dette har ført til bruk av et sonicator, i stedet for den vortex-blander, for bedre å dispergere den første emulsjon og lage mindre kuler. Når mikrokulene var liten nok, de lett føres gjennom nålen og elektrospunnede sammen med resten av oppløsningen. Den primære elektrospinning løsning i denne protokollen er oppløst i vann, i stedet for en hard oppløsningsmiddel, for å hindre skade på NGF og gi et gjest substrat for 28 cellevekst.
Mange metoder har blitt testet for å gi topografiske og kjemiske signaler til nerveskade nettsteder. Noen av de tidlige forsøk på å gi NGF til skader er involvert sette oppløsninger av fri NGF eller mikrokuler inneholdende NGF inn i midten av en fast silisium nerveledning (NC) 36. Disse supported nerve vekst; men de ikke gi ytterligere signaler eller la muligheten til mønsteret plasseringen av vekstfaktorer i NC. I en nyere eksempel Yan et. . al brukt poly [(melkesyre) -CO - [(glykolsyre) -alt- (L-lysin)]] (PLGL) modifisert ved poding Gly-Arg-Gly-Asp-Gly (RGD peptidet) og NGF å fabrikkere PLGL-RGD-NGF nerve rør 37. Tilsvarende disse forutsatt at kjemisk signal som fremmet nerve vekst, men ikke gi andre signaler. En annen studie brukt NGF innkapslet i mikrosfærer med elektrospunnede stillaser over og under dem 38. Dette systemet gir både topografiske signaler av en fibrøs stillas i kombinasjon med NGF som en kjemisk kø. Imidlertid frigjøring varte bare en uke, som ikke er lang nok til å støtte perifere nervereparasjon, og plasseringen av mikrokulene er ikke godt kontrollert.
Andre forskere har fokusert på å innlemme de kjemiske signalene inn i fibrene. En møtthod skaper og emulsjon av den hydrofile protein med en hydrofob polymer. Denne metoden var i stand til å gi topografiske og kjemiske signaler, men 60% av proteinet som ble utgitt i de første 12 dager 39. Et annet eksempel brukes koaksial elektrospinning for å innkapsle NGF i løpet av poly (melkesyre-kaprolakton) (P (lla-CL)) fibre 40,41. Denne metoden gitt resultater som ligner på autograf i en rotte-modell isjiasnerven. Imidlertid er spesialutstyr trenger for koaksial electrospinning og det er uklart hva vurdere protein ble utgitt, og hvis dette kunne opprettholdes. Kombinasjonen av topografiske signaler i form av sammenstilte elektrospunnede fiber og kjemiske signaler gjennom mikrosfærer som slipper i over to måneder, som beskrevet her, gir flere synergi signaler og er svært fleksibel for å gi et tilpasset miljø.
Det er flere spørsmål som må vurderes når electro; miljøfaktorer kan påvirke electroslåsing av en hvilken som helst løsning. En uventet endring i fuktighet, for eksempel, kan ha en betydelig effekt på de elektrospinnings resultater og forårsake inkonsistente fibre. Å ha et eget rom som kan miljømessig kontrollert er svært nyttig. En temperatur på 70 ° C med 50% fuktighet ble brukt for disse eksperimentene. Et annet potensielt problem med en electro system er kortslutninger; De lager ofte åpen gnister mellom sprøyte og metall biter på pumpen. For å forhindre dette, sted plast eller annen isolator mellom dem; mat oppbevaringspose vekt plast fungerer godt. På samme måte kan streif elektriske ladninger i miljøet føre materialet til å akkumulere i uventede steder. For å unngå dette kan du lage en innhegning med akrylplater eller annet isolerende materiale. Mer informasjon om justering av elektrospinnings betingelser finnes i anmeldelsen av Sill 24.
De neste trinnene for denne prosedyren vil omfatte innkapsle andre growth faktorer for å skape mer dynamiske stillasene som inneholder flere vekstfaktorer. For eksempel, har NGF blitt vist å virke synergistisk med glial celleavledet vekstfaktor for å støtte sensoriske og motoriske nevroner 3. Ved hjelp av PLGA mikrosfærer, kan vi kontrollere utgivelsen hastighet ved å endre L: G forhold, som ville tillate oss å levere ulike vekstfaktorer på annen sats. En gradient av mikrosfærene kan også genereres for å bygge en mer kompleks støttesystem som dirigerer celleadferd. I tillegg vil adhesjons-faktorer være konjugert direkte til stillasmaterialet gjennom en Michael-addisjonsreaksjon 26. Til slutt, vil systemet bli testet med en in vivo rottehoftenervene modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W.
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
