Introduction
Sinir doku mühendisliği devam eden zorluklardan biri sinirleri doğal olarak yetişen hücre dışı matris, taklit eden bir sinir kanalı (NC) yaratıyor. Araştırma hücreler, mekanik, topografik, yapışkan ve kimyasal sinyaller dahil olmak üzere 1-3 ortamında birçok faktöre yanıt göstermiştir. Bu alandaki başlıca sorunlardan biri, sinyallerin uygun kombinasyonunu belirlemek ve hücre büyümesini desteklemek için 4 uzun bir süre boyunca muhafaza ipuçlarını bir sistem imal edilir. Çevresel nöronlar yumuşak alt-tabakanın tercih ettikleri bilinmektedir hizalanır lifler tarafından yönlendirilebilir ve sinir büyüme faktörü (NGF) 5-7 yanıt. Hafta boyunca kimyasal ipuçları sağlayabilir NC'ler yakın allogreftlere, sinir onarımı 8,9 güncel altın standardın için geliştirilmiş fonksiyonel iyileşmeyi sağlamak için gösterilmiştir.
Malzemeler ve üretim yöntemleri, çeşitli mekanik ve topografik üretmek için kullanılabilirdiğerleri 10-13 işaret eder. Mekanik ipuçları 1,13 kritik uygulama için uygun malzeme seçimi yaparak, seçilen malzeme doğasında vardır. Üretim yöntemleri topografik ipuçları faz ayrılması, öz-montaj ve 1,13 electrospinning dahil kontrol etmek. Mikro uygulamalar, mikroflüidik, photopatterning, dağlama, tuz halindeki salamuralar, köpükler ya da gaz için, aynı zamanda 14-17 kullanılabilir. ELEKTROSPİNNİNG nedeniyle esneklik ve üretim 13,18-23 kolaylığı doku kültürü için elyaflı alt mühendisi en popüler yolu olarak ortaya çıkmıştır. Electrospun nanolifler kendini püskürtmek ve boşaltmak için 24, kısa bir aralık üzerinden germek için neden olan polimer solüsyonuna, bir yüksek voltaj uygulanarak imal edilmektedir. Bir hizalanmış iskele topraklanmış döner mandrel üzerine elyafların toplanması ile oluşturulabilir ve bağlantısız iskeleler ve durağan bir plaka 25 üzerinde toplanır. Yapışma sinyal elyaflı skafold wit kaplanması ile elde edilebilirs fibronektin veya 26 electrospinning önce HA gibi RGD gibi bir yapışma peptidi, konjuge.
Onlar kontrollü salım için bir kaynak gerekiyor çünkü bu tür büyüme faktörleri gibi kimyasal sinyalleri, uzun dönemler boyunca korumak için en zor. Birçok sistem başarı çeşitli düzeylerde ile electrospun lifli ağlara kontrollü salımını eklemek için denenmiştir. Bu yöntemler harman elektrospinning, emülsiyon elektrospinning, çekirdek-kabuk elektrospinning ve protein konjugasyon 27 içerir. Buna ek olarak, elektro geleneksel olarak bu nedenle proteinin biyo kabul edilmelidir muhafaza, proteinin 28 canlılığını etkileyebilen uçucu bir çözücü içinde yapılır.
Bu yaklaşım, özellikle periferik sinir büyüme için ayarlanabilir bir iskele oluşturmak için mekanik, topografik, kimyasal ve yapıştırıcı sinyalleri birleştirerek giderir. İskele mekanik tam sentetize edilmesi ile kontrol edilirMetakrilatlanmış Hyaluronik Asit (HA). Methacrylation siteleri fotoğraf reaktif crosslinkers bağlamak için kullanılır. Çapraz malzeme artık suda çözünür ve münhasıran enzimler 29 tarafından bozuldu. Çapraz bağlama miktarı degradasyon oranı, mekanik ve malzemenin diğer fiziksel özelliklerini değiştirir. ~ 500 Pa arasında bir gerilme modülüne sahiptir methacrylation% 30 ile HA kullanılarak, sinir dokusunun doğal mekanik yakındır ve tipik olarak nöronlar 26,29 tercih edilen yumuşak bir alt-tabakayı oluşturur. Dönen mandrel üzerinde Elektrospinning topografik bir işaret sağlayacak şekilde ayarlanır lifleri oluşturmak için kullanılır. Ile birlikte mikro-elektrospinning kullanma süreleri zarfında iskele içinde kimyasal sinyaller sağlar. Kimyasal sinyali oluşturmak için kullanılan NGF içeren nörit büyüme mikroküreler desteklemek için. NGF üretimi sırasında zorlu çözücüler karşılaşmasa bu yüzden çoğu electrospun malzemelerin aksine HA su içinde çözünür. SCA, yapışkan bir sinyali eklemek içinffold fibronektin ile kaplanır. NGF fibronektin (yapıştırıcı) ile kaplanmış mikroküreler (kimyasal) bırakmadan yumuşak (mekanik) hizalanmış (topografik) lifler: tamamlandı sisteminin yukarıda açıklanan sinyalleri dört türlerini içerir. Üretim ve bu sistemin test bu protokolü tarif edilmiştir.
Proses, bir su-içinde-yağ-içinde-su emülsiyonu ile çift mikrosferlerin üretimi ile başlar. Emülsiyon, bir yüzey aktif madde, polivinil alkol (PVA) ile stabilize edilir. İç su fazı protein içerir. Bu diklorometan (DCM) içinde çözüldü PLGA kabuk malzeme içeren, yağ fazına ilave edilir olarak, yüzey aktif madde DCM proteini koruyan fazlar arasında bir bariyer oluşturur. Bu emülsiyon, mikro kürelerin dış yüzeyini oluşturmak için polivinil alkol içeren bir su fazı içinde dağılmış daha uzundur. Kararlı bir emülsiyon, DCM buharlaşmasını sağlamak için karıştırılır. Durulama ve liyofılleme sonra kuru mikroküreler cont ile bırakılır, geri kalan proteini.
Mikroküreler tamamlandıktan sonra onlar iskelelerinin içine electrospun hazırdır. Öncelikle elektro solüsyon hazırlanır. Solüsyonun viskozitesi uygun elyaf formasyonu için çok önemlidir. Saf HA Çözümleri Bu zorunluluğa uymayan; PEO üretebilmektedir izin vermek için bir taşıyıcı polimer olarak ilave edilir. Bu mikrosferler, mikro-dağılmış olan elyaflı yapı iskeleti sonuçlanan çözeltisi ve electrospun eklenir.
Üretim işlemi tamamlandıktan sonra, protein, varlığını doğrulamak için test edilmelidir. Bunu yapmak için, NGF'ye tepki veren bir birincil hücre kullanılabilir. Bu protokol, 8-10 günlük tavuk embriyolarından sırt kök gangliyon (DRG) kullanır. Hücre demetleri NGF veya boş olanlar ile dolu küreleri içeren iskelelerinin üzerine ekilir. NGF hala canlı olup olmadığını NGF içeren iskelelerde gelişmiş akson büyümesini görmelisiniz. NGF artık geçerli değilse o olacakdeğil genişletmek için nevritlerle teşvik ve denetime benzer görünmelidir.
Burada tarif edilen prosedür, kesin malzeme basit değişiklikler, electrospinning yöntemi ve sistemi, çeşitli doku ve hücre tipleri için optimize edilebilir proteinleri ile, ancak, sinir destek üzerinde odaklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Su / Yağ / Su Çift Emülsiyon Mikroküre Üretimi
- Üretim ve% 2 iyonu giderilmiş suda bir polivinil alkol (PVA) v çözeltileri% 0.5 a / hazırlar. Berrak olana kadar 50 ° C de karıştırdıktan çözüm, bu birkaç saat alabilir. Deiyonize su içinde% 2 h / h İzopropil Alkol içinde bir çözeltisi hazırlandı.
- Arzu edilen hidrofilik, proteinin bir sulu çözelti hazırlayın. Aşağıdaki tablo, örnek formülasyonları sağlar.
Tablo 1:. Örnek Protein Çözümleri aşağıdaki protein çözümleri başarıyla kapsüllü ve electrospun bu protokolü kullanarak edilmiştir. Gerektiğinde diğer hidrofilik, protein çözeltileri kullanılabilir.
- 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine% 0.5 PVA çözeltisi 40 ml yerleştirin ve bir kenara.
- 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 65:35 300 mg 'poli 3 ml diklorometan (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA). , Bir girdaplı karıştırıcı PLGA çözünmesini hızlandırmak için kullanılabilir.
- Protein çözeltisi ve 200 ul% 2 PVA-çözeltisinden 4 ul birleştirin. PLGA solüsyonu içine dökün protein (1.4 adım). Çözümler çoğunlukla ayrı kalacaktır.
- Buzlu su içeren bir deney kabı içine tüp yerleştirin. ~ 10 Watt (RMS) bir değnek sonikator kullanarak, bir üniforma kremsi beyaz emülsiyon oluşturulur kadar bir kaç saniye (5-10) için çözüm çalkalayın.
- % 0.5 PVA (adım 1.3) ihtiva eden 50 ml'lik bir tüp içine emülsiyonu dökün. ~ 20 saniye boyunca bir vorteks mikserde yüksek hızda çözüm karıştırın. Çözelti bulanık bir görünüm geliştirecektir.
- 2 dakika boyunca 350 rpm'de bir karıştırma plakası üzerinde 200 ml'lik bir cam ve yere emülsiyonu aktarın. Karıştırma plakası üzerinde beher% 2 izopropil alkol 50 ml ilave edilir. Karışım sertleştirmek üzere DCM buharlaşmaya izin vermek için 1 saat içinde ve en az bir PLGA için karıştırma devam etmesini sağlar.
- Transferi to santrifüj tüpleri içine mikro-küre çözeltisi.
- 3 dakika boyunca 425 x g'de santrifüj. Mikro küreler, bu tüpün altında toplanır ve beyaz görünür. Dikkatlice mikrosferler üzerinde tüpten çıkarın ve 500 ml'lik bir şişe içinde depolar.
- Tam tüpü üç çeyreği doldurulması ve sıvı içindeki mikro küreleri dağıtmak için sallama ile, iyonu giderilmiş su ile mikro küreleri durulayın.
- Tekrar 1.10 ve 1.11 dört kez yineleyin.
- Son durulama sonra, diğer örnekleri ile 500ml şişe içinde tekrar yer supernatant çıkarın. Daha sonra en az 24 saat boyunca liyofilize, santrifüj tüpü içinde toplanmıştır küreleri dondurun.
- Bir ışık mikroskobu altında veya bir Taramalı Elektron Mikroskobu ile mikroküreler gözünüzde canlandırın. 60 um'den daha büyük olmayan bir mikro-etkili üretebilmektedir içindir. Mikro-küreler çok büyük olursa, uzun sonikasyon veya girdaplama kere adım 1.6, 1.7 ya da gerekli olabilir. <li> -20 ° C derin dondurucuda kurutulmuş mikroküreler saklayın.
- Opsiyonel: Aşama 1.10 30'dan 500ml şişe içinde protein miktarı test etmek için, üreticinin talimatlarına göre, bir protein deneyi kullanın. Bu mikro-kapsüllenmiş protein üretim sürecinde kullanılan ne çözeltide miktarının çıkarılması ile yüzde hesaplamak için kullanılır.
. Mikrosferde protein yer PLGA solüsyonu 31 ml x 2 Rhodamine ug / ekleyin ve bir FITC konjüge protein kapsüllemek görselleştirmek için 1 bir örneğini göstermektedir: Not.
Mikrokürelerin 2. Elektrospinning
- Önceki elektro çözeltisinin hazırlanması için, 37 ° C sıcaklıkta eritilmesi ile, iyonu giderilmiş su içinde foto-başlatıcı bir% 0.5 w / v solüsyonu oluşturmak. Bu işlem birkaç saat sürebilir.
- Hyaluronik asit (Meha) metaakrilat karşı 29,% 3 (Burdick ve ark. Sentez için bakınız) w / 2% oluşturma/ hac 900 kD poli (etilen oksid) (PEO) ve% 0.05 w / v, deiyonize su içinde foto başlatıcı ağırlık solüsyonu.
- İstenen hacme için Meha ve PEO doğru miktarını hesaplayın. Örneğin, çözelti, 10 ml electrospinning Meha, 200 mg ve 300 mg PEO gerektirir.
- Istenen son hacminin (9 Bu örnek için mi)% 90 deiyonize su içinde çözülür PEO. Bu işlem birkaç saat sürebilir, 37 ° C'de ısıtılmış bir karıştırma plakası veya su banyosu işlemi hızlandırmak için kullanılabilir.
- Sonraki Meha ekleyin ve berraklaşana kadar karıştırın çözelti üzere, bir girdaplı karıştırıcı kullanılır. Bu sadece bir kaç dakika sürer.
- Son olarak geriye kalan% 10 hacim (bu, örneğin, 1 mi) doldurmak üzere% 0.5 foto başlatıcı çözeltisi ekleyin.
- 400 mg / ml kadar, istenen yoğunlukta mikro küreleri ekleyin. Bu mikrosferler, eşit çözelti içinde dağıtılır kadar vorteksli bir mikserde çözüm karıştırın.
- Bir şırıngaya çözüm aktarın ve 6 inç ve 18 kalibrelik bl iliştirmekulastırınız ucu iğne.
- Bir şırınga pompası şırınga ve 1.2 ml / saat olarak dağıtmak için ayarlanmış.
- Toplama plakası ya da bir mandrel üzerine bir alüminyum folyo tabakası bantlayın. Bu bitmiş skafoldun kolay temizlemek ve saklanmasına olanak vermektedir. Bir dönen mandrel uyumlu lifleri oluşturmak için kullanılır. Düz bir plaka ya da hareketsiz mandrel rasgele düzenlenmiş fiberlerin sonuçlanacaktır.
- Toplama aparatı ile yüksek gerilim güç kaynağından topraklama kablosu bağlayın. Iğne pozitif kablosunu bağlayın.
- Iğne ucu ve toplama yüzeyi arasında 15 cm olacak şekilde şırınga pompası ve bir toplama yüzeyi ayarlayın.
- Çözüm şırınganın ucunda görünür olduğunda, polimer pompalama başlatın, gerilim kaynağı açmak ve 24 kV DİKKAT gerilimini ayarlamak:. Sisteminin herhangi bir metal parçası dokunmayın üzerindeki gerilim açıldıktan sonra. Şarj ayrıca cilde elektrikli parçalardan kısa mesafelerde atlayabilir.
- D kadar çözüm çalıştırınesired iskele kalınlığı elde edilir. Tam bir gerilim kaynağı ve şırınga pompası kapattığınızda.
- Iskele ekli ile folyoyu çıkartın. Tamamlanan proteini içeren iskeleler -20 ° C dondurucu içinde saklanır.
3. Protein biyoaktivitenin test edilmesi
- Hücre kültürü ortamı hazırlayın. Ekleme,% 10 h / h Fetal Sığır Serumu Dulbecco Modified Eagle Medium,% 1 h / h, L-glutamin, ve% 1 hacim / hacim Penisilin-Streptomisin.
- Bir plaka tamamen içine sığacak seçiniz cam lamelleri.
- Üretici tarafından tarif edildiği gibi tedavi etmek için lamelleri 3-(trimetoksisilil) propil metakrilat kullanın. Methacrylation lamelleri iskele bağlılığı artırır.
- Electrospinning önce çıkarılabilir çift taraflı bant ile electrospinner toplanma alanına metakrile lamelleri takın. Lamelleri üzerine İplik işleme ve görüntüleme kolaylaştırır.
- Yukarıda tarif edildiği gibi arzu edilen kalınlığına Electrospin.
- Biryıkıldıktan sonra dikkatlice mandrelinden lamelleri çıkarın elektrospinning. Net azot odasına İSKELE kaplı lamelleri yerleştirin ve tüm oksijen temizlendi olduğundan emin olun.
- 15 dakika boyunca, 10 mW / cm 2, 365 nm ışık altında haznesi ve iskele yerleştirin. Uygun büyüklükte plaka içine bir yer çapraz bağlama sonrası. Iskele tarafı yukarı dönük olduğundan emin olun.
- 30 dakika boyunca bir antiseptik lamba altında Yer iskelelerinin sterilize etmek. İstenen fibronektin ya da diğer protein hücre yapışmasını geliştirmek için bir kaplama olarak kullanılırsa. Kat iskelelerinin için üreticinin talimatlarına uyun.
- Hasat Dorsal Kök Ganglia (DRG) gibi daha önce Hollenbeck 32 tarafından tarif. Bir DRG test edilen her iskele kaplı lamel için gerekli olacaktır.
- Oyuklu bir plaka içerisinde her bir platform üzerinde ortam 100-200 ul koyun. Dikkatlice ortam damlacık her bir platform üzerinde bir DRG yerleştirin. Kalın İskele için daha fazla medya gerekli olabilir; DRG tamamen batık ve FLOA değil gerekirting.
- Hücre iskeleti iskelesine yapışmasının sağlanması için 4 saat boyunca 37 ° C'de iskele ve DRG inkübe edin.
- Kuyunun için uygun seviyeye medyayı doldurun ve geri kuvöz içine yerleştirin. 4-6 gün inkübe devam edin.
- İnkübasyon süresinden sonra, dikkatli bir şekilde, her bir oyuktan ortamını çıkarın ve hafifçe bir kez PBS ile yıkayın. / Hac% 4 paraformaldehid ağırlık ile 30 dakika boyunca hücreleri saptamak.
- Nörofilament bir antikor leke kullanılarak Leke hücreleri. Bu ölçümü için nörit büyümesinin görselleştirme sağlayacaktır. DAPI ayrıca hücrelerin çekirdekleri görüntülemek için kullanılabilir. Bir örnek boyama protokolü Sundararaghavan ve arkadaşları 14 tarafından tarif edilmiştir.
- Bir floresan mikroskop kullanılarak hücrelerin görselleştirmek.
- Mikroskop sahnede plaka yerleştirin.
- DAPI'nin için filtre ve uyarma ayarları kullanarak hücre kitlesini bulun.
- Hücrenin kez genişletilmiş nevritlerle görselleştirmek için FITC'ye için filtreyi geçiş olduğunu. Utoplamak ve tüm yapıyı görmek için gerekli olduğunca çok fotoğraf birleştirmek mikroskop dikiş fonksiyonu şarkı. DAPI'nin, FITC'ye ve parlak bir alan için tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
85 üzerinde% protein kapsülleme çapında mikroküreler ± 14 mikron 50 sürekli üretilen ve iskeleler içine electrospun edilmiştir. Ebat üç ayrı üretim serisi ikinci mikro-örnekleri görüntüleme ile saptanmıştır. Ticari laboratuar yazılımı kullanılarak ölçülür bir optik mikroskop ve uzunlukları üzerinde tutulmuş ve görüntüler. Şekil 1 boyut dağılımının bir histogramı gösterir. Encapsulation oranı da üretim sürecinde kaçan protein miktarının tarafından, üç ayrı Microsphere partilerden test edildi.
Şekil 2, içinde yer alan PLGA kabuk ve sığır serum albümini (BSA) içinde -FITC rodamin (2 ug / ml) ile temsil küreleri gösterir. Görüntüler floresan mikroskop kullanılarak alınmıştır. Kabuk açıkça iç (yeşil) konsantre proteini ile (kırmızı) görülebilir.
, Mikro küre kapsül değerlendirmeks BSA ile doldurulur ve bir Bradford protein deneyi ile birlikte protein salma için şöyle test edilmiştir. PLGA Protein kaçış büyük boşluklar yaratmak, ester bağlarının hidrolizi ile ayırır. Mikroküreler 60 günden fazla (Şekil 3) için serbest devam ediyor. Mikroküreler yıkmak gibi bir başlangıç patlama sonra devam ile serbest başlar.
Mikro küreleri electrospinning sonra 3D elyaflı yapı boyunca görülebilir. 4 (oklar ile belirtilen) küreler, çok katmanlı olarak görülebilir tam skafoldun bir SEM görüntüsünü göstermektedir. Iskeleleri mikro-dağılımı 15.3 ± 3.6 küreler / mm2 olduğu ölçüldü. Skafold hedef bölgede uzak göçünü önler yerine mikro küreleri tutar. Mikroküreler yıkmak gibi onlar nörit büyüme 33,34 teşvik etmek yapı iskelesi NGF'sine bırakın. Bu büyümesini desteklemek için yapı iskeletinin her yerinde proteininin sürekli bir ulaştırılmasını hücreleri ve teşvik hücreleri iskelesi içine sızmak.
Son olarak, arka kök gangliası (DRG) iskele içinde, mikro-NGF canlılığını test etmek için kullanıldı. DRG 5, bunların herhangi bir protein ile bir sonraki ihtiva eden mikro küreciklerin, NGF ile yüklü mikro-küreler ihtiva eden bir yapı iskeleti üzerine ekildi göstermektedir. NGF yaşayabilecek durumda kalır ve büyümeyi teşvik edildiğini gösterir, NGF içerine DRG uzanan görünür uzun nörit uzantıları vardır.
Şekil 1. Mikroküre boyut dağılımı., Bu protokol tarafından üretilen MİKROSFERLERİ çapı ± 14 mikron 50 vardır. Grafik, 5 um ambarlarda mikro küre çapının eden bir histogramı gösterir.
2highres.jpg "/>
Mikroküreler. 2 ug / ml Rodamin, Şekil 2. Floresan Resim mikroküre kabuk (kırmızı) ve BSA-FITC ile protein (yeşil) görselleştirmek için kapsül haline getirilmiştir görselleştirmek için PLGA çözeltisi dahil edilmiştir. Protein açıkça kürenin içinde görülebilir. Ölçek çubuğu = 20 mikron. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Protein Yayın eğri. 60 gün boyunca, bir Bradford protein deneyi kullanılarak ölçülmüştür mikro küreciklerden BSA bırakın. Ilk patlama dış yüzeyine bağlı olduğu BSA'ya bağlı muhtemeldir. PLGA parçalayan olarak, protein, zaman içinde serbest bırakılır.
/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
Şekil küreleri içeren 4 İskele. Elektro işlemi mikro-skafoldun derinliği boyunca yerleştirilmesine olanak sağlar. Mikro-konumunu gösteren (A) 'Oklar. Üstündeki iskeletinin nanoliflerden sadece bir mikro-Ölçü bar = 500 um. (B) Yüksek büyütme görüntü. Ölçek çubuğu = 20 mikron. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. test NGF Biyoaktivite. Dorsal Kök Gangliyon birincil hücreler 8 günlük civciv yumurta hasat edilir ve NGF'nin doldurulmuş mikro-(A) ya da boş mikroküreler (B) iskeleler üzerine serpildi. DRG'ler, hücre, çekirdeklerini görselleştirmek için bir sinir lifi antikorun FITC sekonder antikor ve DAPI ile boyanmıştır. FITC lekeli nevritlerin (yeşil) ile belirtildiği gibi Çıkan NGF'nin yüklenen mikrosferlerin mevcudiyetinde nörit büyümesinin artış göstermektedir. Bu NGF canlı ve büyümeyi teşvik edebilir yayınlandı gösterir. Görüntüler konfokal mikroskop ile alınmıştır. Ölçek çubuğu = 200 mikron. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birçok çalışma, sinir hücreleri, topografik ipuçlarının (fiber hizalama) ve kimyasal uyaranlara (büyüme faktörleri) 1,2,10,11,35 yönettiği edilebileceğini göstermiştir. Elektro uyumlu lifleri oluşturmak için, basit bir yöntemdir. Büyüme faktörleri, sinir büyüme ancak sinir boruları (NC) içine dahil etmek için, uzun süreli salınımı için bir yöntem gereklidir ediyoruz. Her iki ipuçları ile daha sağlam bir sistem oluşturmak için, bu iki sinyal kombine edilmelidir. Çeşitli yöntemler, daha önce sinir rejenerasyonu için electrospun lifli yapı iskeleti içinde proteinin uzun süre ile verilebilmesini sağlamak için çalışmalar yapılmıştır, ancak bugüne kadar hiçbiri 60 gün boyunca salımı mümkün olmuştur. Buna ek olarak, büyüme faktörü verildiği yapıya model mümkün olmamıştır. Bu yazıda hem sinyalleri vermeye PLGA mikrosferdir teslim elektrospinning birleştirmek için bir sistemi tanımlamak.
Geleneksel yöntemleri, de Boer ve ark tarafından ana hatları çizilen protokol olarak PLGA mikro kürecikler imal etmek. </ Em>, elektro sürecini dayanamadı (300 ± 100 mikron) çok daha büyük mikroküreler 33 üretti. Iskelelerinin içine dahil çeşitli girişimleri başarısız olmuştur. Bu daha önce emülsiyonu dağıtmak ve daha küçük küreler oluşturmak için, girdaplı karıştırıcı yerine bir sonikatöre kullanımına yol açmıştır. Bu mikrosferler, yeterince küçük sonra, kolayca çözeltinin geri kalanı ile birlikte iğne ve electrospun geçirildi. Bu protokol ana çözelti, elektro NGF'ye zarar görmesini önlemek ve hücre büyümesi 28 için dostça bir alt tabaka oluşturmak için, daha sert bir çözücü değil, su içinde eritilir.
Birçok yöntemler sinir yaralanması sitelerine topografik ve kimyasal sinyaller sağlamak için test edilmiştir. Yaralanmalara NGF sağlamayı ilk denemelerde Bazı silisyum sinir boru (NC) 36 merkezine serbest NGF veya NGF içeren mikro-çözümler koyarak içeriyordu. Bu temizledesteklenecek sinir büyüme; Ancak onlar, ek ipuçları sağlamak veya desen beceri kazanmalarını NC büyüme faktörlerinin yerini izin vermedi. Daha yeni bir örnek Yan ve içinde. al. ikinci poli [(laktik asit) -ko - [(glikolik asit) -alt- (L-lisin)]] GIy-Arg-GIy-Asp-Gly (RGD peptideleri) aşılanarak değiştirilir (PLGL) ve NGF'nin imal edilmesi için PLGL RGD-NGF sinir kanalları 37. Benzer şekilde, bu sinir büyümesini terfi kimyasal sağlanan sinyal, ancak diğer ipuçlarını vermedi. NGF kullanılan bir diğer çalışmada yukarıda ve bunlardan 38 aşağıda electrospun iskeleleri ile mikrosferlerde kapsüllü. Bu sistem, bir kimyasal işaret olarak, NGF ile birlikte bir lifli yapı iskeleti topografik ipuçlarını hem de sağlamaktadır. Ancak, serbest sadece periferik sinir onarımı desteklemek için yeterince uzun olmayan bir hafta süren ve mikroküreler yeri iyi kontrol edilmez.
Diğer araştırmacılar, elyaflar içine kimyasal sinyalleri içeren odaklanmıştır. Bir araya geldiduvarcı oluşturur ve bir hidrofobik polimer ile hidrofilik protein emülsiyonu. Bu yöntem proteinin ancak% 60 ilk 12 gün 39 yılında piyasaya sürüldü, topografik ve kimyasal ipuçları verebilmektedir. Koaksiyal elektro kullanılan bir diğer örneği, bir poli (laktik asit-kaprolakton) (P (LLA-CL)) lifler 40,41 içinde NGF saklanması. Bu yöntem, fareye ait siyatik siniri modelinde imza benzer sonuçlar vermiştir. Ancak, özel ekipman koaksiyel Elektrospinning için gereken ve bu sürekli olabilir eğer proteinin serbest bırakıldı oranı ne belirsizdir, ve. Burada tarif edildiği gibi 2 ay boyunca serbest mikro-ile hizalanmış electrospun lifler ve kimyasal ipuçlarının şeklinde topografik ipuçlarının kombinasyonu, sinerjistik çoklu sıra sağlayan ve özel bir ortam sağlamak için son derece tarafından ayarlanabilir.
Electrospinning dikkate alınması gereken birkaç husus vardır; Çevresel faktörler etkileyebilir elektroşömineherhangi bir çözümün iğneleyerek. Nemde beklenmeyen bir değişim, örneğin, elektro sonuçlar üzerinde önemli bir etkisi vardır ve tutarsız lifleri neden olabilir. Çevre kontrol edilebilir ayrı bir oda olması çok yararlıdır. % 50 nem ile 70 ° F arasında bir sıcaklık Bu deneyler için kullanılmıştır. Bir elektro sistemi ile bir diğer potansiyel sorun kısa devre olduğu; genellikle pompa üzerinde şırınga ve metal parçalar arasında bariz kıvılcım oluşturabilir. Bu, yer plastik veya bunların arasında başka bir izolatör önlemek için; gıda depolama çantası ağırlığı plastik iyi çalışıyor. Benzer şekilde, ortamda kaçak elektrik şarjları malzeme beklenmedik yerlerde birikmesine neden olabilir. Bunu önlemek için akrilik levhalar veya diğer yalıtım malzemesi ile bir muhafaza oluşturabilirsiniz. Elektrospinning şartlarını ayarlamak hakkında daha fazla bilgi Sill'deki 24 tarafından gözden bulunabilir.
Bu işlem için sonraki adımları, diğer gro encapsulating içerecektirfaktörlerin wth birden büyüme faktörleri içeren daha dinamik iskeleleri oluşturun. Örneğin NGF, duyu ve motor nöronların 3 desteklemek için Glial Hücre Türevli Büyüme Faktörü ile sinerjik çalışır gösterilmiştir. PLGA mikro-küreler kullanarak, L değiştirerek bırakma hızını kontrol edebilir: US farklı bir oranda çeşitli büyüme faktörleri elde edilmesine olanak sağlar olan G oranı,. Mikro-küreciklerin gradyanı da hücre davranışını yönlendiren daha karmaşık bir destek sistemi oluşturmak için oluşturulabilir. Buna ek olarak, yapışma faktörler, Michael ekleme reaksiyonu ile 26 iskele malzemesi direkt olarak konjüge edilir. Son olarak, sistem, bir in vivo sıçan siyatik sinir modelinde test edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W.
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
