Introduction
神経組織工学における継続的な課題の一つは、神経が自然に成長する細胞外マトリックスを模倣神経導管（NC）を作成します。研究は、細胞が機械的、地形、接着剤及び化学的シグナル1-3を含め、環境内のいくつかの要因に反応することが示されている。この分野における主要な課題の一つは、信号の適切な組み合わせを決定し、細胞増殖4を支持するために長時間のキューを維持することができるシステムを製作される。末梢ニューロンが軟質基板を好むことが知られており、整列した繊維により誘導され、神経成長因子（NGF）5-7に応答する。週間の化学的手がかりを提供することができnCSが近い同種移植、神経修復8,9の現在のゴールドスタンダードと改善された機能回復を提供することが示されている。
さまざまな材料および製造方法は機械的およびトポグラフィーを生成するために使用することができアルは10-13頭出し。機械的な合図は、アプリケーションのクリティカル1,13のための適切な材料の選択を行うこと、選択された材料に固有である。製造方法は地形キューが相分離、自己集合および1,13エレクトロスピニングが挙げられる制御する。マイクロスケールの用途、マイクロ流体工学、フォトパターニング、エッチング、塩浸出、またはガスフォームに対して14〜17をも使用することができる。エレクトロスピニングは、その柔軟性と生産13,18-23のしやすさに組織培養のための繊維状基材を設計するための最も一般的な方法として登場しました。電界紡糸ナノファイバーは、それ自体を撃退および24を放電するために短いギャップを横切って伸張させるポリマー溶液に高電圧を印加することにより製造される。整列足場は、接地回転マンドレル上に繊維を収集することによって作成することができ、非整列足場は、固定プレート25上に収集される。接着シグナリングは、繊維状足場ウィットをコーティングすることによって達成することができる時間フィブロネクチンまたは26をエレクトロスピニングする前に、HAへのそのようなRGDなどの接着ペプチドを、結合させる。
成長因子などの化学信号は、それらが制御された放出のためのソースを必要とするので、長期間にわたって維持することが最も困難である。多くのシステムは成功のさまざまなレベルで電界紡糸繊維質のネットワークに制御された放出を追加しようとしてきた。これらの方法は、ブレンドの電界紡糸、エマルジ ョンエレクトロスピニング、コアシェル電気紡糸およびタンパク質共役27を含む。さらに、エレクトロスピニングは、伝統的に考慮されなければならない、したがって、タンパク質の生物活性を維持し、タンパク質28の生存率に影響を与えることができる揮発性溶媒中で行われる。
このアプローチは、特に末梢神経成長のための調整可能な足場を作成するために、機械的、地形的、化学的および接着剤信号を結合対処しています。足場の力学を正確に合成することによって制御されるメタクリル化ヒアルロン酸（HA）。メタクリル化部位は、光反応性架橋剤を取り付けるために使用される。架橋された材料は、もはや水溶性ではなく、排他的に酵素29により分解される。架橋の量は、分解速度、力学と材料の他の物理的特性を変更します。 〜500 Paで引張弾性率を有する30％のメタクリル化とHAを使用して、神経組織の本来の力学に近く、一般的に、ニューロン26,29に好まれているソフトの基板を作成します。回転マンドレル上でエレクトロスピニングすると、地形のキューのための整列した繊維を作成するために使用されている。マイクロスフェアと一緒にエレクトロスピニングを使用すると、長期間にわたって足場内の化学信号を提供する。 NGFを含む神経突起成長のミクロスフェアをサポートするために、化学信号を作成するために使用される。 NGFは製造中に過酷な溶剤に遭遇しないように、ほとんどのエレクトロスピン材料とは異なり、HAは水溶性である。 、SCAを粘着信号を追加するには、ffoldは、フィブロネクチンで被覆されている。 NGFはフィブロネクチン（接着剤）でコーティングされたマイクロスフェア（化学）を放出したソフト（機械）整列（地形）繊維：完成したシステムは、上記の信号の4つのすべてのタイプが含まれています。このシステムの製造および試験は、このプロトコルに記載されている。
プロセスは、水中油中水のダブルエマルジョンとマイクロスフェアの製造から始まる。エマルジョンは、界面活性剤、ポリビニルアルコール（PVA）で安定化される。内側の水相は、タンパク質が含まれています。それはジクロロメタン（DCM）に溶解PLGAシェル材料を含有する、油相に添加されると、界面活性剤は、DCMからタンパク質を保護する相の間の障壁を作成する。このエマルジョンは、ミクロスフェアの外表面を作成するためにPVAを含む別の水相中に分散しなくなる。安定したエマルジョンがDCMを蒸発させて攪拌される。洗浄および凍結乾燥した後は、乾いたマイクロスフェアの続きが残されているタンパク質をaining。
微小球が完了した後、それらを足場に電界紡糸される準備ができている。まず、電界紡糸溶液を調製。溶液の粘度は、適切な繊維形成にとって重要である。純粋なHAの解決策はこの要件を満たしていない。 PEOは、電界紡糸を可能にするために、担体ポリマーとして添加される。マイクロスフェアは、全体に分散マイクロスフェアと繊維状足場に得られた溶液とエレクトロに追加されます。
生産が完了すると、タンパク質は、その実行可能性を検証するためにテストする必要があります。これを行うには、NGFに応答する一次電池を使用することができる。このプロトコルは、8〜10日齢のニワトリ胚から後根神経節（DRG）を使用しています。セルの束は、NGFまたは空のあるもので満たされたマイクロスフェアを含む足場上に播種する。 NGFはまだ実行可能である場合は、NGFを含む足場上の強化された神経突起成長が表示されるはずです。 NGFはもはや実行可能でない場合、それは意志拡張するとコントロールのように表示されます神経突起を促進しない。
本明細書で説明正確な手順は、システムがさまざまな細胞および組織型に対して最適化することができる単純な物質への変更、エレクトロスピニング法、およびタンパク質で、しかし、神経支持体上に集光される。
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Protocol
1。水/オイル/水ダブルエマルションマイクロス制作
- 最初の脱イオン水中のポリビニルアルコール（PVA）vの溶液/ wの2％及び0.5％を準備する。透明になるまで50℃での溶液を撹拌し、これには数時間かかる場合があります。脱イオン水に2％v / vのイソプロピルアルコールの溶液を調製する。
- 希望親水性タンパク質の水溶液を調製します。下の表は、例示的製剤を提供する。
表1：実施例プロテインソリューション以下のタンパク質溶液は、正常にこのプロトコルを使用してカプセル化され、エレクトロスピニングされている。必要に応じて他の親水性タンパク質溶液を使用することができる。
- 50ミリリットルの遠心分離管に0.5％PVA溶液40mlを置き、脇に置きます。
- 15mlの遠心管中で65:35、300mgの溶解ジクロロメタン3ml中のポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）。ボルテックスミキサーは、PLGAの溶解を促進するために使用することができる。
- タンパク質溶液200μl、2％PVA溶液4μlのを結合します。 PLGA溶液（ステップ1.4）にタンパク質混合物を注ぐ。ソリューションは、主に独立したままになります。
- 氷水のビーカーにチューブを置きます。均一な乳白色のエマルションが作成されるまで、〜10ワット（RMS）でワンド超音波処理器を使用して、数秒（5-10）の解を攪拌する。
- 0.5％PVA（ステップ1.3）を含む50mlチューブ中にエマルジョンを注ぐ。 〜20秒間ボルテックスミキサーで高速でソリューションを混ぜる。解決策は、曇った外観を開発します。
- 2分間350rpmで撹拌プレート上200ミリリットルのビーカーや場所にエマルジョンを転送します。撹拌プレート上のビーカーに2％イソプロピルアルコール50mlを加える。混合物が硬化するDCMが蒸発させる1時間の最小値とPLGA攪拌継続できるようにします。
- 転送さt彼は遠心管に溶液をマイクロスフェア。
- 3分間425×gで遠心分離する。マイクロスフェアは、チューブの底に集め、白が表示されます。慎重にマイクロスフェアの上に、チューブから上清を除去し、500ミリリットルボトルに保管してください。
- 四分の三の完全かつ液体中のマイクロスフェアを再配布するためにそれを振っチューブを充填して脱イオン水でマイクロスフェアを洗い流す。
- 繰り返します1.10＆1.11 4回繰り返します。
- 最後のすすぎに続いて、他のサンプルで再び500ミリリットルボトル内の場所上清を除去。その後少なくとも24時間、凍結乾燥、遠心管に集めミクロスフェアを凍結する。
- 光学顕微鏡下で、または走査型電子顕微鏡で微小球を可視化する。 60ミクロンよりも大きくないマイクロスフェアは、効果的なエレクトロスピニングのためのものです。マイクロスフェアが大きすぎる場合、より長い超音波処理またはボルテックス時間は、ステップ1.6または1.7で必要とされ得る。 <李>は、-20℃の冷凍庫内で乾燥微小球を保管してください。
- オプション：ステップ1.10 30から500ミリリットルボトルにタンパク質の量をテストするために、製造者の指示に従って、タンパク質アッセイを使用してください。これは、製造工程において使用したものと溶液中の量を減算することにより、マイクロスフェア中にカプセル化タンパク質のパーセントを計算するために使用される。
注：PLGA溶液31ミリリットルにローダミンを2μg/を追加し、FITC結合タンパク質をカプセル化マイクロスフェア中のタンパク質の位置を視覚化するために、図1に例を示します。
マイクロスフェアと2。エレクトロスピニング
- 電界紡糸溶液を調製する前に、37℃で溶解することによって脱イオン水に、光開始剤のw / v溶液0.5％を作成する。このプロセスには数時間かかることがあります。
- 29（バーディックらを参照してください。合成のための）2％W / Vメタクリル化ヒアルロン酸（MeHAを）を作成し、3％/ 900 kDのポリ（エチレンオキシド）（PEO）v及び0.05％wの脱イオン水vの光開始剤溶液/ wである。
- 所望の体積のためMeHAをとPEOの正確な量を計算します。例えば、電界紡糸溶液10mlをMeHAをとPEO 300mgの200mgのを必要とする。
- 所望の最終体積（この例では9 ml）を90％の脱イオン水にPEOを溶解する。これには数時間かかることがあり、37℃で加熱撹拌プレートまたは水浴プロセスを加速するために使用することができる。
- 次MeHAを追加し、透明になるまでソリューションを撹拌するボルテックスミキサーを使用しています。これはほんの数分かかります。
- 最後に、残りの10％の体積（この例では1 ml）を充填するために0.5％の光開始剤溶液を添加する。
- 400 mg / mlの最大所望の濃度でマイクロスフェアを追加します。マイクロスフェアが均等に溶液中に分散されるまで、ボルテックスミキサー上に溶液を混ぜる。
- シリンジにソリューションを移し、6インチの18ゲージのBLを添付UNT先端の針。
- シリンジポンプにシリンジを配置し、1.2ミリリットル/時間で分配するように設定します。
- 収集プレートまたはマンドレル上にアルミ箔の層をテープで固定します。これは、完成した足場を簡単にクリーンアップとストレージが可能になります。回転マンドレルは、整列した繊維を作成するために使用されている。平板または固定マンドレルは、ランダムに配置された繊維になります。
- 収集装置に高電圧電源からアース線を接続する。針に正のリードを接続します。
- ニードルチップと収集面間に15センチあるように、シリンジポンプ及び収集面を調整する。
- ソリューションは、注射器の最後に表示されている場合、ポリマーポンプを起動し、電圧源をオンにし、24 kVの電圧を設定する注意 ：電圧がオンにされると、システムの金属部分に触れないでください。チャージはまた、皮膚に帯電部分から短い距離をジャンプすることがあります。
- Dまで溶液を実行します。esired足場の厚さが達成される。完了すると、電圧源とシリンジポンプをオフにしてください。
- 添付足場とホイルを外します。タンパク質を含む完成した足場は、-20℃の冷凍庫に保存されている。
3タンパク質生物活性試験
- 細胞培養培地を準備します。追加の10％v / vのウシ胎児血清ダルベッコ改変イーグル培地に1％v / vのL-グルタミン、および1％v / vのペニシリン - ストレプトマイシン。
- ウェルプレートに完全にフィットするカバーガラスを選択します。
- 製造業者によって記載されるようにカバースリップを治療するために3-（トリメトキシシリル）プロピルメタクリレートを使用する。メタクリル化は、カバースリップの足場付着性を向上させます。
- エレクトロスピニングの前に取り外し可能な両面テープでelectrospinnerの収集領域へのメタクリル化カバーガラスを取り付けます。カバースリップ上に紡績することは取り扱いや閲覧が容易になります。
- 上記のように所望の厚さにエレクトロスピニング。
- AFTERは慎重にマンドレルからカバースリップを削除エレクトロスピニング。明確な窒素室に足場コーティングしたカバーガラスを置き、全ての酸素がパージされることを確認してください。
- 15分間は10mW / cm 2の 365nmの光の下でチャンバーと足場を置きます。適切なサイズのウェルプレートに場所を架橋した後。足場側が上を向いていることを確認します。
- 30分間殺菌灯の下に置いて足場を滅菌する。所望であれば、フィブロネクチンまたは他のタンパク質は、細胞接着を強化するためのコーティングとして使用される。コート足場に、メーカーの指示に従ってください。
- 収穫後根神経節（DRG）、以前にホーレンベック32によって記述。一つのDRGは、試験した各足場に覆わカバースリップのために必要とされます。
- ウェルプレートの各足場上のメディア100〜200μLを置きます。慎重メディア滴の各足場に1 DRGを置く。厚手の足場のために複数のメディアが必要になる場合があります。 DRGは、完全に水没する必要があり、floaませんティン。
- 細胞は足場に付着させ4時間、37℃で足場およびDRGをインキュベートします。
- ウェルについての適切なレベルにメディアを記入し、バックインキュベーターに配置します。 4-6日間培養を続けます。
- インキュベーション期間の後、慎重に各ウェルから培地を除去し、穏やかにPBSで一回洗浄します。 / vパラホルムアルデヒドwの4％を用いて30分間、細胞を固定します。
- ニューロフィラメントに対する抗体染色を用いて染色する細胞。これは定量化のための神経突起伸長を可視化することができます。 DAPIは、細胞の核を表示するために使用することができる。例えば、染色プロトコルはSundararaghavanおよび同僚14によって記載された。
- 蛍光顕微鏡を用いて細胞を視覚化する。
- 顕微鏡のステージ上ウェルプレートを置きます。
- DAPI用のフィルタおよび励起の設定を使用して、細胞塊を見つけます。
- セルたら拡張神経突起を可視化するために、FITCにフィルタを切り替えることである。 U収集し、全体の構造を見るために必要な数の画像を組み合わせ、顕微鏡でのステッチ機能を歌う。 DAPI、FITC及び明視野に対して繰り返します。
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Representative Results
85％のタンパク質カプセル化微小球は直径50±14μmで、一貫して足場に生産され、エレクトロれています。サイズは、3つの別個の製造バッチから微小球のサンプルを撮像することによって決定した。商業ラボソフトウェアを使用して測定光学顕微鏡および長さに撮影された画像。 図1は、サイズ分布のヒストグラムを示す。封入率は、製造プロセス中に脱出したタンパク質を定量することにより、3つの個別のミクロスフェアバッチから試験された。
図2は、内にカプセル化されたPLGAシェルおよびウシ血清アルブミン（BSA）-FITCにおけるローダミン（2μg/ ml）を有する代表的な微小球を示している。画像は、蛍光顕微鏡を用いて撮影した。シェルは、明らかに内部の（緑色）で濃縮タンパク質と（赤）を見ることができる。
、ミクロスフェアのカプセル化を評価するためsはBSAで満たし、ブラッドフォード（Bradford）タンパク質アッセイによるタンパク質の放出について試験した。 PLGAは、タンパク質の脱出のための大きなギャップを作る、エステル結合の加水分解によって分解する。マイクロスフェアは、60日以上（ 図3）のために放出し続けている。リリースは、マイクロスフェアが崩壊につれて続ける初期バーストで始まる。
ミクロスフェアをエレクトロスピニングした後、3D繊維構造体全体に見られる。 図4は、球が複数の層（矢印）に見ることができる完全な足場のSEM画像を示す。足場における微小球の分布は、15.3±3.6球/ mm 2であることが測定された。足場は、標的部位から離れて移動を防止場所に微小球を保持している。ミクロスフィアが崩壊として、彼らは、神経突起の成長33,34を奨励するために足場にNGFを放出する。これはの成長をサポートするために、足場全体に質の継続的な配信を作成する細胞や足場に浸潤する細胞をお勧めします。
最後に、後根神経節（DRG）は足場内、マイクロスフェアでNGFの生存能力を試験するために使用した。 図5は 、DRGが次のその中にタンパク質を含まないマイクロスフェアを含むものにNGFを搭載したマイクロスフェアを含む足場に播種を示しています。 NGFは実行可能なままであり、成長を刺激していることを示す、NGF足場上のDRGから延びる可視の長い神経突起の拡張機能があります。
図1マイクロスフェアサイズ分布。このプロトコルによって生成微小球は、直径が50±14μmである。グラフは、5μmのビン微小球の直径のヒストグラムを示す。
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図2微小球の蛍光像は 2μg/ mlのローダミンはミクロスフェアシェル（赤）を可視化するためにPLGA溶液に含まれていたとBSA-FITCは、タンパク質（緑）を可視化するためにカプセル化された。タンパク質は明らかに球の中を見ることができる。スケールバー=20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
60日間の図ミクロスフェアから3タンパク質盤曲線。BSAの放出は、Bradfordタンパク質アッセイを用いて測定した。初期バーストは、外表面に付着したBSAに起因する可能性がある。 PLGAが故障したように、タンパク質は、経時的に放出される。
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ミクロスフェアを含む図4の足場。電界紡糸プロセスは、ミクロスフェアは、足場の深さ全体に組み込まれることを可能にする。微小球の位置を示す（A）の矢印。その上の足場からのナノファイバーで1微小球のスケールバー=500μmの。（B）高倍率画像。スケールバー=20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5 NGF生物活性をテストします。後根神経節の一次細胞は、8日齢のニワトリの卵から採取し、NGFが充填されたマイクロスフェア（A）または空のマイクロスフェア（B）と足場に播種した。 DRGを細胞核を可視化するために神経フィラメント抗体、FITC二次抗体およびDAPIで染色した。画像は、FITC染色された神経突起（緑色）により示されるようにNGFを充填したミクロスフェアの存在下で神経突起伸長の増加を示している。これはリリースNGFが実行可能であると成長を促進することができます示しています。画像は、共焦点顕微鏡を用いて撮影した。スケールバー=200μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
多くの研究は、神経細胞が地形手がかり（繊維配向）および化学的手がかり（成長因子）1,2,10,11,35によって指示することができることを示している。エレクトロスピニングは、整列した繊維を作成するための容易な方法です。成長因子は、神経成長を促すが、神経導管（NC）にそれらを含めるために、持続放出のための方法が必要とされる。両方の手がかりとより堅牢なシステムを作成するには、次の2つの信号が結合されるべきである。いくつかの方法が以前に神経再生のためのエレクトロ繊維状足場内のタンパク質の持続放出を提供するために研究されてきたが、今日までの、いずれも60日間を超えて持続放出が可能なされていない。さらに、成長因子放出のパターニングが不可能であった。本明細書では、両方の信号を提供するために、PLGAミクロスフェア送達に電界紡糸を結合するシステムを説明する。
従来の方法は、そのようなデ·ボーアらによって概説したプロトコルとして、PLGAマイクロスフェアを作製した。</ em>の、エレクトロスピニング法に耐えることができなかった非常に大きく、微小球33（300±100μm）を生産した。足場に組み込むには、いくつかの試みは成功しなかった。これは、より良い最初のエマルジョンを分散させ、より小さな球体を作成するために、ボルテックスミキサーの代わりに、超音波処理器を使用することにつながった。微小球が十分に小さかったならば、彼らは簡単に解決策の残りの部分と一緒に、針とエレクトロを通過した。このプロトコルの主電界紡糸溶液は、NGFへの損傷を防止し、細胞増殖28親切な基質を提供するために、かなり過酷な溶剤よりも、水に溶解する。
多くの方法は、神経損傷部位に地形的および化学的信号を提供するために試験されている。怪我にNGFを提供する初期の試みのいくつかは、固体シリコンの神経導管（NC）36の中心に自由NGFまたはNGFを含むマイクロスフェアの溶液を入れて関与。これらのupported神経成長;しかし、彼らは追加の手がかりを提供したり、パターンノースカロライナ州の成長因子の場所をする能力を許可していませんでした。もっと最近の例Yan らには。 。ら使用されるポリ[（乳酸） -コ- [（グリコール酸）-alt-（L-リジン）]]（PLGL）を製造するためのGly-Argを、グリシン-アスパラギン-グリシン（RGDペプチド）およびNGFをグラフトすることにより修飾されPLGL-RGD-NGFの神経導管37。同様に、これらは神経成長を促進したが、他の手がかりを提供しなかった化学信号を提供した。別の研究では、上記と38その下エレクトロ足場とマイクロスフェア中にカプセル化NGFを使用していました。このシステムは、化学的な合図として、NGFと組み合わせて、繊維状足場の地形的な手がかりの両方を提供します。ただし、リリースは末梢神経の修復をサポートするのに十分な長さではなく、微小球の位置がうまく制御されていない週、続いた。
他の研究者は、繊維に化学的シグナルを組み込むことに焦点を当てている。一つは、会ったHODは作成され、疎水性ポリマーと親水性タンパク質のエマルジョン。しかしながら、この方法は、タンパク質の60％が最初の12日間39に発売された、地形や化学手がかりを提供することができました。同軸エレクトロスピニングに使用される別の例は、ポリ（乳酸-カプロラクトン）（P（LLA-CL））繊維40,41内にNGFをカプセル化する。この方法は、ラット坐骨神経モデルでサイン会と同様の結果が得られた。しかし、特別な装置は、同軸エレクトロスピニングのために必要であり、それは、タンパク質がリリースされたどのような割合では不明であるが、これは持続することができれば。ここで説明するように2ヶ月以上離しマイクロスフェアを通して整列電界紡糸繊維や化学手がかりの形で地形手がかりの組み合わせは、複数の相乗的な手がかりを提供し、カスタマイズされた環境を提供することが非常に調整可能です。
電界紡糸する際に考慮される必要があるいくつかの問題があります。環境要因がelectrosに影響を与えることができるすべてのソリューションのピン止め。湿度の予期しない変化は、例えば、エレクトロスピニングの結果に重要な影響を与えると矛盾繊維を引き起こす可能性がある。環境的に制御することができる別の部屋を持つことは非常に便利です。湿度50％で70°Fの温度がこれらの実験に使用した。エレクトロスピニングシステムに伴う別の潜在的な問題は短絡である。彼らはしばしばポンプ上の注射器と金属片の間明白な火花を作成します。それらの間のこの場所のプラスチックまたは他の絶縁体を防止するために、食品保存袋の重量プラスチックが適しています。同様に、環境内の浮遊電荷は材料が予期しない場所に蓄積する可能性があります。これを回避するには、アクリル板等の絶縁材料との同梱を作成することができます。エレクトロスピニング条件を調整することの詳細については、シル24による審査で見つけることができます。
この手順の次のステップは、他のGROをカプセル化が含まれます複数の成長因子を含む、よりダイナミックな足場を作成するための要因WTH。例えば、NGFは、感覚および運動ニューロン3をサポートするために、グリア細胞由来成長因子と相乗的に作用することが示されている。 PLGAミクロスフェアを用いて、Lを変化させることによって放出速度を制御することができる：私たちは異なる速度でさまざまな成長因子を送達することを可能にするG比は、。微小球の勾配は、細胞の挙動を指示し、より複雑な支援システムを構築するために生成することができる。また、接着因子は、マイケル付加反応26を介して足場材料に直接結合される。最後に、システムは、in vivoでのラット坐骨神経モデルを用いて試験する。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W.
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
