Introduction
En av utmaningarna i neural tissue engineering skapar en nervledning (NC) som härmar extracellulära matrix, där nerverna växer naturligt. Forskning har visat att celler svarar på flera faktorer i sin omgivning, inklusive mekaniska, topografiska, lim och kemiska signaler 1-3. En av de främsta utmaningarna på detta område är att bestämma lämplig kombination av signaler och tillverka ett system som kan hålla ledtrådar under en längre period för att stödja tillväxten cell 4. Perifera nervceller är kända för att föredra en mjuk substrat, regisseras av inriktade fibrer och svara på nervtillväxtfaktorn (NGF) 5-7. NCs som kan ge kemiska signaler i veckor har visat sig ge förbättrad funktionell återhämtning närmare den för allografter, den nuvarande standarden för nervreparation 8,9.
Olika material och produktionsmetoder kan användas för att producera mekanisk och topografiskal Köer 10-13. Mekaniska ledtrådar är inneboende i det valda materialet, vilket gör valet av lämpliga material för tillämpningen kritiska 1,13. Produktionsmetoder för att styra topografiska ledtrådar inkluderar fasseparation, självorganisering och elektrospinning 1,13. För mikroskala applikationer, mikrofluidik, photopatterning, etsning, salt leaches eller gas skum kan också användas 14-17. Electro har blivit den mest populära sättet att konstruera fibrösa substrat för vävnadsodling på grund av dess flexibilitet och produktions 13,18-23. Elektrospunna Nanofiber tillverkas genom att tillämpa en hög spänning till en polymerlösning orsakar det att stöta bort sig själv och sträcker sig över en kort lucka att släppa 24. En linje byggnadsställning kan skapas genom att samla fibrerna på en jordad roterande spindel och alliansfria byggnadsställningar samlas på en stationär platta 25. Vidhäftning signalering kan åstadkommas genom att belägga det fibrösa scaffold with fibronektin eller konjugering av en vidhäftnings peptid, såsom RGD, till HA innan elektrospinning 26.
Kemiska signaler, såsom tillväxtfaktorer, är de svåraste att hålla under längre perioder eftersom de behöver en källa för kontrollerad frisättning. Många system har försökt att lägga till kontrollerad frisättning till elektrospunna fibrösa nätverk med varierande nivåer av framgång. Dessa metoder innefattar blandning electro, emulsion electro, core skal electro och proteinkonjugering 27. Dessutom är electro traditionellt görs i ett flyktigt lösningsmedel, vilket kan påverka lönsamheten av proteinet 28, alltså upprätthålla bioaktivitet av proteinet måste beaktas.
Detta tillvägagångssätt tar specifikt kombinerar mekaniska, topografiska, kemiska och självhäftande signaler för att skapa en avstämbar klätterställning för perifer nervtillväxt. Scaffold mekanik är exakt styrd av syntetiserametakrylerad hyaluronsyra (HA). De methacrylation ställen används för att fästa fotoreaktiva tvärbindare. Det tvärbundna materialet inte längre är vattenlösliga och uteslutande fördelade på enzymer 29. Mängden tvärbindning förändrar nedbrytningshastigheten, mekanik och andra fysikaliska egenskaper hos materialet. Använda HA med 30% methacrylation, som har en dragmodul av ~ 500 Pa, skapar en mjuk underlag som ligger nära de infödda mekanik nervvävnad och är vanligtvis föredras av nervceller 26,29. Electro på en roterande dorn används för att skapa inriktade fibrer för en topografisk cue. Använda electro tillsammans med mikrosfärer ger kemiska signaler inom byggnadsställning under längre perioder. För att stödja neurite tillväxtmikrosfärer innehållande NGF används för att skapa den kemiska signalen. Till skillnad från de flesta elektrospunna material HA är löslig i vatten så att NGF inte möter starka lösningsmedel under produktionen. För att lägga till en klistersignal, scaffold är belagd med fibronektin. Den färdiga systemet innehåller alla fyra typer av signaler som beskrivs ovan: mjuka (mekaniska) linje (topografiska) fibrer med NGF släppa mikrosfärer (kemisk) belagd med fibronektin (lim). Produktion och testning av detta system beskrivs i detta protokoll.
Processen börjar med framställning av mikrosfärerna med en vatten-i-olja-i-vatten dubbelemulsion. Emulsionen stabiliseras med ett ytaktivt medel, polyvinylalkohol (PVA). Den inre vattenfasen innehåller proteinet. Såsom den sättes till oljefasen, innehållande PLGA skalmaterialet upplöstes i diklormetan (DCM), skapar det ytaktiva medlet en barriär mellan faserna som skyddar proteinet från DCM. Denna emulsion är än dispergerad i en annan vattenfas innehållande PVA för att skapa den yttre ytan av mikrosfärerna. Den stabila emulsionen omröres för att tillåta DCM avdunsta. Efter sköljning och frystorkning du är kvar med den torra mikrosfärer fortsaining proteinet.
Efter att mikrosfärerna är avslutade de är redo att Electrospun i byggnadsställningar. Först förbereder electrolösningen. Viskositeten för lösningen är kritisk för korrekt fiberbildning. Lösningar av ren HA uppfyller inte detta krav; PEO tillsätts som en bärarpolymer för att möjliggöra elektrospinning. Mikrosfärerna sattes till lösningen och electrospun vilket resulterar i en fibrös scaffold med mikrosfärer fördelade i hela.
När produktionen är klar, bör proteinet testas för att kontrollera dess lönsamhet. För att göra detta, kan en primär cell som svarar på NGF användas. Detta protokoll använder dorsalrotsganglier (DRG) 8-10 dagar gamla kycklingembryon. Cell buntar sås på byggnadsställningar mikrosfärer fyllda med NGF eller de som är tomma. Om NGF fortfarande lönsamt bör du se förbättrade neurite tillväxt på NGF innehåller byggnadsställningar. Om NGF inte längre är lönsamt kommer detMarknadsför inte neurites att utvidga och borde likna kontrollen.
Det exakta förfarandet som beskrivs här är inriktad på neural stöd, dock med enkla ändringar av materialet, elektrospinning metod och proteiner systemet kan optimeras för olika cell och vävnadstyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Vatten / Olja / Vatten Double Emulsion Microsphere Production
- Först förbereda 2% och 0,5% vikt / volym lösningar av polyvinylalkohol (PVA) i avjoniserat vatten. Rör lösningarna vid 50 ° C tills den är klar, kan det ta flera timmar. Bered en lösning av 2% vol / vol Isopropanol i avjoniserat vatten.
- Bered en vattenlösning av önskad hydrofil proteinet. Tabellen nedan ger exempel formuleringar.
Tabell 1:. Exempel proteinlösningar Följande proteinlösningar har framgångsrikt inkapslade och electrospun användning av detta protokoll. Andra hydrofila proteinlösningar kan användas efter behov.
- Häll 40 ml av PVA-lösningen 0,5% i ett 50 ml centrifugrör och ställ åt sidan.
- I ett 15 ml centrifugrör upplösa 300 mg av 65:35poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) (PLGA) i 3 ml diklormetan. En virvelblandare kan användas för att accelerera PLGA upplösning.
- Kombinera 200 l av proteinlösning och 4 l av 2% PVA-lösning. Häll proteinblandningen in i PLGA-lösning (steg 1,4). Lösningarna kommer att förbli mestadels separat.
- Placera röret i en bägare med isvatten. Med hjälp av en trollstav sonicator på ~ 10 watt (RMS), agitera lösningen under några sekunder (5-10) tills en jämn krämig vit emulsion skapas.
- Häll emulsionen in i 50 ml rör innehållande 0,5% PVA (steg 1,3). Blanda lösningen vid hög hastighet på en vortexblandare för ~ 20 sek. Lösningen kommer att utveckla ett grumligt utseende.
- Emulsionen överfördes till en 200 ml bägare och placera på en omrörningsplatta vid 350 rpm under 2 min. Tillsätt 50 ml 2% isopropylalkohol till bägaren på omrörningsplatta. Låt blandningen under fortsatt omrörning under minst 1 timme för att tillåta DCM avdunsta och PLGA härda.
- Transfer tHan mikrosfär lösning i centrifugrör.
- Centrifugera vid 425 xg under 3 min. Mikrosfärema samlar på botten av röret och verkar vita. Ta försiktigt bort supernatanten från röret, ovanför mikrosfärerna, och förvara i en 500 ml flaska.
- Skölj mikrosfärerna med avjoniserat vatten genom att fylla röret tre fjärdedelar fulla och skaka det att omfördela mikrosfärema i vätskan.
- Upprepa steg 1.10 & 1.11 fyra gånger.
- Efter den sista sköljningen, avlägsna supernatanten igen och plats i 500 ml flaska med de andra proverna. Frys mikrosfärerna som samlats in i centrifugröret, sedan lyofilisera minst 24 tim.
- Visualisera mikrosfärema under ett ljusmikroskop eller med ett svepelektronmikroskop. Mikrosfärer ingen större än 60 | im är för effektiv elektrospinning. Om mikrosfärer är för stora, kan längre sonicating eller virvelbildning tider krävas i steg 1.6 eller 1.7. <li> Förvara de torkade mikrosfärerna i en -20 ° C frys.
- Tillval: Använd en proteinanalys, enligt tillverkarens instruktioner, för att testa mängden protein i 500 ml flaska från steg 1,10 30. Detta används för att beräkna den procent av proteinet inkapslas i mikrosfärerna, genom att subtrahera mängden i lösningen från det som används i tillverkningsprocessen.
Obs: För att visualisera protein plats i mikrosfären lägga Rhodamine 2 mikrogram / ml till PLGA lösningen 31 och kapsla in ett FITC konjugerad protein Figur 1 visar ett exempel..
2. Electro med mikrosfärer
- Före framställning electro lösning, skapa en 0,5% vikt / volym lösning av fotoinitiator, i avjoniserat vatten genom upplösning vid 37 ° C. Denna process kan ta flera timmar.
- Skapa en 2% vikt / volym metakrylerad hyaluronsyra (MEHA) (se Burdick et al. För syntes) 29, 3%w / v 900 kD poly (etylenoxid) (PEO) och 0,05% vikt / volym fotoinitiator lösning i avjoniserat vatten.
- Beräkna den korrekta mängden MEHA och PEO till den önskade volymen. Till exempel, 10 ml elektrospinning lösning kräver 200 mg MEHA och 300 mg av PEO.
- Upplös PEO i avjoniserat vatten vid 90% av den önskade slutliga volymen (9 ml för detta exempel). Detta kan ta flera timmar, kan en uppvärmd omrörarplatta eller vattenbad vid 37 ° C användas för att påskynda processen.
- Nästa tillsätt MEHA och använda en virvelblandare för att röra om i lösningen tills klar. Det tar bara några minuter.
- Slutligen tillsätt 0,5% fotoinitiator lösning för att fylla de återstående 10% volym (1 ml för det här exemplet).
- Lägg mikrosfärer i önskad koncentration på upp till 400 mg / ml. Blanda lösningen på en vortexblandare till dess att mikrosfärerna är jämnt fördelade i lösningen.
- Överför lösningen till en spruta och bifoga en 6 tum 18 gauge blunt spets nål.
- Placera sprutan på en sprutpump och ställa in den att dosera på 1,2 ml / timme.
- Tape ett skikt av aluminiumfolie på uppsamlingsplattan eller dorn. Detta möjliggör enkel sanering och förvaring av den färdiga ställningen. En roterande dorn används för att skapa riktade fibrer. En plan platta eller stationär dorn resulterar i slumpmässigt ordnade fibrer.
- Anslut jordledningen från en högspänningskälla till uppsamlingsanordningen. Anslut den positiva ledningen till nålen.
- Justera sprutpumpen och uppsamlingsytan så att det finns 15 cm mellan nålspetsen och uppsamlingsytan.
- Starta polymer pumpning, när lösningen är synligt i slutet av sprutan, slå på spänningskällan och ställer in spänningen till 24 kV. VARNING: När spänningen slås på ska du inte röra någon metall del av systemet. Charge kan också hoppa korta avstånd från elektrifierade delar till huden.
- Kör lösningen tills desired scaffold tjocklek uppnås. När du är klar stänger spänningskälla och sprutpump.
- Ta bort folien med byggnadsställning bifogas. Färdig byggnadsställningar innehållande protein lagras i en -20 ° C frys.
3 Protein Bioaktivitet Testing
- Förbered cellodlingsmedier. Lägg 10% volym / volym fetalt bovint serum, 1% volym / volym L-glutamin och 1% volym / volym penicillin-streptomycin till Dulbeccos modifierade Eagles medium.
- Välj glas täckglas som passar helt in i en brunnar.
- Använd 3- (trimetoxisilyl) propylmetakrylat att behandla täckglas såsom beskrivs av tillverkaren. Methacrylation förbättrar byggnadsställning vidhäftning till täckglas.
- Bifoga metakrylerade täck till uppsamlingsområdet i electrospinner med avtagbar dubbelhäftande tejp innan elektrospinning. Spinning på täck underlättar hantering och visning.
- Electrospin till önskad tjocklek, såsom beskrivits ovan.
- Ettfter Electro försiktigt bort täck från spindeln. Placera ställningen belagda täckglas i en tydlig kvävekammaren och se till att allt syre rensas.
- Placera kammaren och byggnadsställning enligt en 10 mW / cm 2 365 nm ljus under 15 min. Efter tvärbindning plats i lämplig storlek brunnar. Se till att ställningen sidan är vänd uppåt.
- Placera ställningar inom en bakteriedödande lampa i 30 min för att sterilisera. Om så önskas fibronektin eller annat protein används som en beläggning för att förbättra celladhesion. Följ tillverkarens instruktioner för att belägga ställningar.
- Harvest dorsala rotganglier (DRG) såsom tidigare beskrivits av Hollenbeck 32. En DRG kommer att behövas för varje byggnadsställning täckt täck testas.
- Placera 100-200 l av media på varje byggnadsställning i brunnar. Placera försiktigt en DRG på varje byggnadsställning i media droppen. För tjock byggnadsställning mer media kan behövas; DRG måste vara helt under vatten och inte floaTing.
- Inkubera scaffold och DRG vid 37 ° C under 4 h för att medge cellen att vidhäfta till ställningen.
- Fyll medierna till lämplig nivå för väl och lägg tillbaka in i inkubatorn. Fortsätt inkubation under 4-6 dagar.
- Efter inkubationstiden försiktigt bort media från varje brunn och försiktigt tvätta en gång med PBS. Fixera cellerna under 30 min med användning av 4% vikt / volym paraformaldehyd.
- Stain-celler med användning av en antikropp fläck för neurofilament. Detta gör det möjligt att visualisera av neuritutväxt för kvantifiering. DAPI kan också användas för att visa cellkärnorna. Ett exempel färgningsprotokollet beskrevs av Sundararaghavan och kollegor 14.
- Visualisera cellerna med användning av ett fluorescensmikroskop.
- Placera brunnsplatta på scenen av mikroskopet.
- Leta reda på cellmassan med hjälp av filter och excitation inställningar för DAPI.
- När cellen är byta filtret till FITC att visualisera de utökade neurites. Usjunger stygnfunktionen på mikroskopet samla och kombinera så många bilder som behövs för att se hela strukturen. Upprepa för DAPI, FITC och ljusa fält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrokulor 50 ± 14 nm i diameter med en över 85% protein inkapsling har konsekvent producerat och electrospun i byggnadsställningar. Storlek bestämdes genom avbildning prover av mikrosfärer från tre separata tillverkningssatser. Bilderna var tagna på ett optiskt mikroskop och längder där mätt med användning av kommersiell labb mjukvara. Figur 1 visar ett histogram över storleksfördelningen. Inkapsling hastighet testades också från tre separata mikrosfärsatser, genom att kvantifiera protein som rymt under produktionsprocessen.
Figur 2 visar representativa mikrosfärer med Rhodamine (2 | ig / ml) i PLGA skalet och bovint serumalbumin (BSA) -FITC inkapslat inom. Bilderna togs med hjälp av en fluorescerande mikroskop. Skalet kan tydligt ses (röd) med proteinet koncentreras på insidan (grön).
För att utvärdera inkapsling, mikrosfärens fylldes med BSA och testades för protein utgivning med en Bradford Protein Assay. PLGA bryts ned genom hydrolys av esterbindningar, skapar större klyftor för protein fly. Mikro fortsätter släppa i över 60 dagar (Figur 3). Frisättningen börjar med en inledande skur fortsätter sedan såsom mikrosfärer bryta ner.
Efter elektrospinning mikrosfärema kan ses i hela 3D fibrösa strukturen. Figur 4 visar en SEM-bild av den kompletta byggnadsställning där sfärerna kan ses i flera skikt (visas med pilar). Fördelning av mikrosfärer i de ställningar mättes till 15,3 ± 3,6 sfärer / mm 2. Ställningen håller mikrosfärer i stället förhindrar bort migration från målplatsen. Eftersom mikrosfärerna bryta ner de släpper NGF i ställningen för att främja neurite tillväxt 33,34. Detta skapar en kontinuerlig leverans av proteinet genom hela byggnadsställning för att stödja tillväxten av celler och uppmuntra celler att nästla sig in i ställningen.
Slutligen var dorsalrotsganglier (DRG) användes för att testa viabiliteten av NGF i mikrosfärerna, inom ställningen. Figur 5 visar en DRG ympades på en byggnadsställning som innehåller mikrosfärer laddade med NGF bredvid ett som innehåller mikrosfärer med inget protein i dem. Det finns längre neurite förlängningar synliga sträcker sig från DRG på NGF schavotten, indikerar att NGF var fortsatt livskraftig och stimulerar tillväxt.
Figur 1 Mikrosfär storleksfördelning. Mikrosfärer som produceras av detta protokoll är 50 ± 14 nm i diameter. Diagrammet visar ett histogram över den mikrosfärdiameter på 5 | im lagerplatser.
2highres.jpg "/>
Figur 2. fluorescerande bild av mikrosfärer. 2 | ig / ml rodamin ingick i PLGA-lösning för att visualisera den mikrosfär skal (röd) och BSA-FITC var inkapslad för att visualisera protein (grön). Protein kan tydligt ses i sfären. Skala bar = 20 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Protein Release Curve. BSA frisättning från mikrosfärerna över 60 dagar mättes med hjälp av en Bradford Protein Assay. Den initiala utbrottet beror sannolikt på BSA som var fäst vid den yttre ytan. Som PLGA bryts ned, är protein frigörs över tiden.
/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Scaffold innehållande mikrosfärer. The electrospinning process tillåter mikrosfärerna som skall införlivas i hela djupet av byggnadsställning. (A) pilar som anger läget för mikrosfärerna. Skala bar = 500 nm. (B) Hög förstoring bild av en mikrosfär med nanofibrer från ställningen ovanför. Skala bar = 20 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. NGF Bioaktivitet Test. Dorsalrotsganglier primära celler skördades från 8 dagar gamla kyckling ägg och såddes på byggnadsställningar med NGF fyllda mikrosfärer (A) eller tomma mikrosfärer (B). DRGfärgades med ett neurofilament antikropp, FITC sekundär antikropp och DAPI att visualisera cellkärnorna. Bilder visar ökad neuritutväxt i närvaro av NGF-laddade mikrosfärer såsom anges med FITC färgade neuriter (grönt). Detta visar släppt NGF är livskraftig och kan främja tillväxten. Bilder togs med ett konfokalt mikroskop. Skala bar = 200 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många studier har visat att nervceller kan regisseras av topografiska ledtrådar (fiberinriktnings) och kemiska signaler (tillväxtfaktorer) 1,2,10,11,35. Electro är en enkel metod för att skapa inriktade fibrer. Tillväxtfaktorer stimulera nervtillväxt men för att inkludera dem i nervledningar (NC), krävs en metod för fördröjd frisättning. För att skapa ett mer robust system med både ledtrådar, bör dessa två signaler kombineras. Flera metoder har tidigare studerat för att ge förlängd frisättning av protein i den electrospun fibrösa klätterställning för nervregeneration men ingen hittills har kunnat fördröjd frisättning i över 60 dagar. Dessutom har mönstring av tillväxtfaktorfrigör inte varit möjlig. Häri beskriver vi ett system att kombinera electro med PLGA mikrosfär leverans för att ge båda signalerna.
Traditionella metoder för att fabricera PLGA-mikrosfärer, såsom det protokoll som beskrivs av de Boer et al. </ Em>, producerade mycket större mikrosfärer 33 (300 ± 100 nm) som inte kunde motstå electroprocessen. Flera försök att integrera dem i de ställningar misslyckades. Detta har lett till användning av en sonikator, i stället för den virvelblandare, för att bättre dispergera den första emulsionen och skapa mindre sfärer. När mikrosfärerna var tillräckligt små, de lätt passera genom nålen och electrospun tillsammans med resten av lösningen. Den primära electrospinning lösningen i detta protokoll är upplöst i vatten, i stället för en hård lösningsmedel, för att förhindra skador på NGF och tillhandahålla en gäst substrat för celltillväxt 28.
Många metoder har testats för att ge topografiska och kemiska signaler till nervskadeplatser. Några av de tidiga försöken att ge NGF skador inblandade sätta lösningar av fri NGF eller mikrosfärer innehållande NGF i mitten av en fast kiselnervledning (NC) 36. Dessa arupported tillväxt nerv; men de inte ge ytterligare ledtrådar eller tillåta möjligheten att mönstret placeringen av tillväxtfaktorer i NC. I ett senare exempel Yan et. . al användes poly [(mjölksyra)-CO - [(glykolsyra) -alt- (L-lysin)]] (PLGL) modifierat genom ympning Gly-Arg-Gly-Asp-Gly (RGD-peptid) och NGF att fabricera PLGL-RGD-NGF nerv ledningarna 37. Likaså dessa förutsatt den kemiska signal som främjas nervtillväxt, men kom inte med andra signaler. En annan studie som används NGF inkapslat i mikrosfärer med elektrospunna ställningar ovanför och under dessa 38. Detta system ger både topografiska ledtrådar i en fiberbyggnadsställning i kombination med NGF som en kemisk kö. Emellertid endast frigör varade en vecka, vilket inte är tillräckligt lång för att stödja perifer nervreparation, och placeringen av mikrosfärerna inte är väl kontrollerad.
Andra forskare har fokuserat på att införliva de kemiska signaler i fibrerna. En uppfylldahod skapar och emulsionen av den hydrofila protein med en hydrofob polymer. Denna metod kunde tillhandahålla topografiska och kemiska signaler, men 60% av proteinet släpptes de första 12 dagarna 39. Ett annat exempel används koaxialelectro att inkapsla NGF inom poly (mjölksyra-kaprolakton) (P (LLA-Cl)) fibrer 40,41. Denna metod förutsatt resultat liknande autograf i en råttischiasnerven modell. Dock speciell utrustning behövs för koaxialelectro och det är oklart i vilken takt proteinet släpptes, och om detta skulle kunna upprätthållas. Kombinationen av topografiska ledtrådar i form av inriktade elektrospunna fibrer och kemiska signaler via mikrosfärer som frigör mer än 2 månader som beskrivs här, ger flera synergi ledtrådar och är mycket avstämbara att ge en anpassad miljö.
Det finns flera frågor som måste beaktas vid elektrospinning; miljöfaktorer kan påverka electrossätter på någon lösning. En oväntad förändring av fukt, till exempel, kan ha en betydande effekt på electro resultaten och orsaka inkonsekventa fibrer. Att ha ett separat rum som kan vara miljö kontrolleras är till stor hjälp. En temperatur av 70 ° F med 50% fuktighet användes för dessa experiment. Ett annat potentiellt problem med en electro system kortslutning; de skapar ofta uppenbara gnistor mellan sprutan och metallbitar på pumpen. För att förhindra detta ställe plast eller annan isolator mellan dem; matförvaring påse vikt plast fungerar bra. På samma sätt kan herrelösa elektriska laddningar i miljön orsakar materialet ansamlas i oväntade platser. För att undvika detta kan du skapa en kapsling med akrylskivor eller annat isolerande material. Mer information om justering electro förhållanden finns i översynen av Sill 24.
Nästa steg i detta förfarande kommer att omfatta kapsla andra growth faktorer för att skapa mer dynamiska ställningar som innehåller flera tillväxtfaktorer. Exempelvis har NGF visat sig fungera synergistiskt med gliacellsmarkörer tillväxtfaktor att stödja sensoriska och motoriska nervceller 3. Använda PLGA-mikrosfärer, kan vi styra frisättningshastigheten genom att ändra L: G-förhållande, vilket skulle göra det möjligt för oss att leverera olika tillväxtfaktorer vid olika takt. En gradient av mikrosfärerna kan också genereras för att bygga ett mer komplext stödsystem som styr cellens beteende. Dessutom kommer adhesionsfaktorer konjugeras direkt till scaffold materialet genom en Michael additionsreaktion 26. Slutligen kommer systemet att testas med en in vivo råttischiasnervmodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W.
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
