Abstract
Omhulde virussen gebruiken membraanglycoproteïnen op hun oppervlak tot toetreding in gastheercellen bemiddelen. Driedimensionale structurele analyse van deze glycoproteïne 'spikes' is vaak technisch uitdagend, maar belangrijk voor het begrijpen van virale pathogenese en in geneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor virale spike structuurbepaling door middel van computationele middeling van elektronen cryo-tomografie gegevens. Electron cryo-tomografie is een techniek elektronenmicroscopie gebruikt om drie-dimensionale tomografische reconstructies volume of tomogrammen van pleomorfe biologische monsters afkomstig zoals membraan virussen in een bijna-natieve, bevroren gehydrateerde toestand. Deze tomogrammen tonen structuren plaats in drie dimensies, zij het met lage resolutie. Computationele middeling van sub-volumes, of sub-tomogrammen, nodig is om een hogere resolutie detail van het herhalen van structurele motieven, zoals virale glycoproteïne spikes te verkrijgen. Een gedetailleerde computationele aanpak voor aliGning en gemiddelde sub-tomogrammen behulp van de Jsubtomo softwarepakket wordt geschetst. Deze benadering maakt visualisatie van de structuur van virale glycoproteïne spikes aan resolutie in het bereik van 20-40 A en studie van de studie van hogere orde spike naar spike interacties op het virion membraan. Typische resultaten worden gepresenteerd voor Bunyamwera virus, een omhuld virus uit de familie Bunyaviridae. Deze familie is een structureel diverse groep van ziekteverwekkers die een bedreiging vormen voor de gezondheid van mens en dier.
Introduction
Electron cryo-tomografie is een elektronen cryo-microscopie techniek waardoor de berekening van een driedimensionaal (3D) reconstructie van complexe biologische monsters. Geschikte monsters variëren van gezuiverde macromoleculaire complexen 1, filamenten 2, bekleed blaasjes 3 en pleomorfe membraan virussen 4 op hele prokaryote cellen 5 en zelfs dunne gebieden van gehele eukaryotische cellen 6. Na het verzamelen van gegevens van een tilt-serie, 3D tomografie volumes of tomogrammen, kan worden berekend met behulp van een aantal gevestigde softwarepakketten, waaronder bsoft 7 en IMOD 8.
Twee aspecten inherent aan de studie van biologische monsters met cryo-electron tomografie beperken de biologische interpretatie van de overeenkomstige tomografische volumes. Ten eerste vanwege de beperkte elektron dosis die kan worden toegepast op biologische materialen vóór de invoering aanzienlijke stralingsschade, signal-ruisverhouding in tomografische gegevens zijn typisch zeer laag. Ten tweede, als gevolg van beperkte monster tilt geometrie tijdens gegevensverzameling, een uitzicht van het object afwezig blijft, leidt tot een zogenaamd "missing wig" artefact in het tomografische volume. Echter, beide beperkingen kunnen worden overwonnen als de tomografische volume bevat herhalende identieke structuren, zoals macromoleculaire complexen, die met succes kunnen worden gemiddeld 9-12.
Voorafgaand aan een gemiddelde van structuren uit tomogram reconstructies, moeten objecten van belang te vinden en afgestemd op de dezelfde richting. Lokaliseren van dergelijke structuren kan worden bereikt door kruiscorrelatie van een sjabloon structuur in het tomografische volume met een benadering vaak aangeduid als template matching 13. De template gebruikt in dit vergelijkingsproces kan worden afgeleid uit elektronen cryo-electron microscopie of cryo-tomografie gecombineerd met 3D reconstructie of het kan een dichtheid kaart gesimuleerd uit teeen atomaire structuur. Verschillende computational zijn ontwikkeld om deze taken uit te voeren 11.
Het middelen van glycoproteïne spikes membraan virussen, zoals HIV-1, heeft een bijzonder succesvolle benadering voor het bestuderen van de structuur 14-16 geweest. Een goed begrip van de structuur is integraal voor het openbaren van zowel de moleculaire basis van virus-gastheer interacties en begeleiden van antivirale en vaccin ontwikkeling van het ontwerp. Terwijl macromoleculaire kristallografie is de techniek van keuze voor hoge-resolutie (gewoonlijk beter dan 4 A) structuuranalyse van individuele virale glycoproteïnen complexen, de röntgenstructuren gevolg van deze methode van eiwitten geïsoleerd uit de natuurlijke omgeving membraneuze de virion . Aldus belangrijke details zoals de hogere orde structuur van virale glycoproteïnen, in het kader van het virion, blijven ontbreekt. Anderzijds, elektronen cryo-microscopie en enkel deeltje reconstructievan de gehele omhulde virussen is beperkt tot virusdeeltjes met icosahedrale symmetrie 17,18. Elektron cryotomography gecombineerd met sub-volume afstemming heeft dus ontpopt als een complementaire techniek waardoor de studie van glycoproteïne spikes van onregelmatig gevormde, pleomorfe virussen in situ.
We hebben software ontwikkeld genaamd Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) voor de detectie, de uitlijning en middeling van tomografische sub-volumes. Jsubtomo is gebruikt in de structuurbepaling van een aantal cellulaire en virale structuren 19-26. Hier schetsen we een gedetailleerd protocol, dat de bepaling virale oppervlakte-spike structuren mogelijk maakt. Te omzeilen over-verfijning van gemiddeld structuren door correleren ruis, is de 'gouden standaard' verfijning regeling aangenomen 10,27. Tot slot, de strategieën voor visualisatie en interpretatie van typische resultaten worden besproken.
Protocol
Een gedetailleerd protocol voor de computationele uitlijning en de daaropvolgende middeling van virale glycoproteïne spikes wordt geschetst. Het protocol volgt de workflow geïllustreerd in figuur 1 en combineert een geautomatiseerde zoektocht naar de spikes met initiële template structuren en een goud-standaard structuur verfijning.
Invoergegevens voor dit protocol is een set van tomografische reconstructies van de virions. Een tomogram bevat een of meer virions. Eerst wordt een klein deel van spikes hand geplukt en gebruikt voor gemiddeld en verfijnen twee onafhankelijke modellen. Deze modellen worden gebruikt om automatisch spikes te vinden op alle virusdeeltjes. Tenslotte worden twee onafhankelijke verfijningen werking en de resulterende gemiddelden worden vergeleken en gecombineerd om de uiteindelijke structuur te produceren.
De verfijning aanpak wordt aangetoond met behulp van programma's uit de Jsubtomo pakket. Programma's uit de bsoft pakket 28 worden gebruikt voor algemene afbeelding pEHANDELING taken en moleculaire grafisch pakket UCSF Chimera 29 wordt gebruikt om de resultaten te visualiseren. De namen van de afzonderlijke programma's worden gegeven in cursief en bestandsformaten worden aangeduid met hoofdletters bestandsextensies.
Figuur 1:.. Algemene strategie voor het bepalen van de structuren van het glycoproteïne spike complexen van pleomorfe membraan virussen De nummers corresponderen met de verschillende secties in het Protocol Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
1 Virus Sub-volumes extraheren uit Full-size tomogrammen
- Pick virusdeeltjes handmatig in de tomogrammen.
- Open een tomogram bestand in bshow. Definieer het middelpunt coördinaat van een virus particle met de deeltjes picking tool. Herhaal deze stap totdat alle virusdeeltjes zijn verwerkt. Opslaan virus coördinaten in een STAR-bestand.
- Herhaal stap 1.1.1 tot alle tomogrammen zijn verwerkt. Noteer het virion diameter in pixels.
OPMERKING: Als de spikes zijn moeilijk te zien in de tomogrammen, gebruiken bfilter naar low-pass filter instellen voor het tomogrammen tot 80-Å resolutie (parameter "-bandpass 80,10000").
- Run jsubtomo.py in extract modus (parameter "--mode extract") om virion sub-volumes aan individuele volume bestanden uit te pakken. Gebruik de STAR-bestanden opgeslagen in stap 1.1.1 als input-bestanden.
- Geef een grootte (parameter "--size") ~ 25% groter dan de grootste virion in de dataset. Bijvoorbeeld als het virion is ~ 200 pixels in diameter, gebruik afmeting 250 x 250 x 250 pixels.
- Output-bestanden van het virion volumes zullen in MAP-formaat. Daarnaast maakt een begeleidend STAR-bestand voor elke virion volume (parameter "--output").
- Normaliseren virion volumes in bimg (parameter "-rescale 0,1").
2 Generatie van twee onafhankelijke Initial Modellen
- Kies een subset van pieken in het virion sub-volumes.
- Open een virion sub-volume MAP bestand in bshow. Definieer het middelpunt coördinaat van een piek met behulp van de deeltjes-picking tool, toegankelijk via het venster Toolbox. Herhaal deze stap totdat alle duidelijk onderscheiden spikes zijn verwerkt. Opslaan spike coördinaten in een STAR-bestand.
- Herhaal indien nodig stap 2.1.1 voor andere virusdeeltjes tot ongeveer 200 glycoproteïne spikes zijn verwerkt. Opmerking spike afmetingen in pixels.
OPMERKING: ~ 200 spikes zijn een ruwe leidraad en meer kan nodig zijn voor sommige toepassingen. Als het mogelijk is, gericht op spikes halen in verschillende oriëntaties. Vermijd het plukken alleen top uitzicht.
- Wijs een eerste zicht vector om de spikes door het uitvoeren jviews.py. Gebruik de STAR-bestanden gegenereerd in stap 2.1.1 als input-bestanden.
NOTE: Deze weergave vector benadert de richting van de piek met verwijzing naar het virion.- Gebruik de centrale coördinatie van de standpunten toe te wijzen voor een bolvormige virion. Als bijvoorbeeld het virion wordt gecentreerd (na stap 1.2) in een doos met een afmeting van 250 x 250 x 250 pixels, de centrale coördinaat 125.125.125 pixels (optie "--Radial 125.125.125").
- Om van het uitzicht voor een draadvormige virion toewijzen, elk virion sub-volume in bshow te openen met behulp van de STAR-bestand gedefinieerd in stap 2.1.1 als het invoerbestand. Definieer de twee eindpunten van de gloeidraad met de gloeidraad picking gereedschap en sla het STAR-bestand. Herhaal deze stap totdat alle STAR-bestanden zijn bijgewerkt en voer jviews.py met de bijgewerkte STAR-bestanden als input-bestanden (--option Segment).
- Genereer een echte ruimte masker met behulp jsubtomo_create_mask.py. Zorg ervoor dat de werkelijke ruimte masker is van dezelfde afmeting enionen zullen worden gebruikt voor de gemiddelde structuur (zie 2.6.2) en is groot genoeg om zowel de nagel en een patch van de onderliggende membraan bevatten.
- Genereer een wederkerige ruimte masker met behulp jsubtomo_create_wedgemask.py. De wederzijdse ruimte masker wordt gebruikt om gebieden uit te sluiten in de 'missing wig' regio als gevolg van enkele as verzamelen tomografie gegevens. Ervoor te zorgen dat het is van dezelfde afmetingen als zal worden gebruikt voor de gemiddelde structuur (zie 2.6.2).
- Genereer een selectie bestand (SEL-bestand) het definiëren van virusdeeltjes die behoren tot sets "1" en "2" met jsubtomo_evenodd.py en de STAR-bestanden gegenereerd in stap 2.2.
- Genereer eerste twee gemiddelden met behulp jsubtomo_create_averages.py.
- Gebruik de SEL-bestand gegenereerd in stap 2.5 als het invoerbestand.
- Geef een grootte (parameter "--size") ten minste 32 pixels groter dan de grootste afmeting van de spike. Bijvoorbeeld, als de piek is ~ 40 pixels lang, Gebruik afmeting 72 x 72 x 72 pixels.
- Breng een hoge symmetrie (bijvoorbeeld, c100) het gemiddelde (parameter "--symmetry c100"), een cilindrische gemiddelde rond de lange as van de piek te benaderen. Gebruik symmetrization aan geluid de eerste gemiddelden verminderen.
- Zorg voor een unieke naam voor de uitgang van de bestanden van het project (parameter "--suffix").
- Gebruik de echte ruimte masker gegenereerd in stap 2.3 om weg te maskeren achtergrond (parameter "--mask"). Gebruik de reciproke ruimte masker gegenereerd in stap 2.4 tot verantwoordelijk voor het verlies van signaal ingevoerd bij de aanwezigheid van een ontbrekende wig (parameter "--Mask").
3 Gold-standaard Iteratief Alignment en middeling van de twee Initial Spike Modellen
Iteratief uitlijnen en het gemiddelde van de eerste twee modellen gegenereerd in hoofdstuk 2 met jsubtomo_iterate_gold.py.
- Fase I. Het doel van deze fase is om het te verfijnenrichting van het uitzicht vector. De input-bestand is de SEL-bestand gegenereerd in stap 2.5.
- Gebruik een 8-graden hoekige sampling (parameter "--angles 8,8,8").
- Laat 16 graden veranderingen in de richting van de steker bekijken vector (parameter "--thetaphilimit 16"), maar behouden de hoek rond de (parameter "--alphalimit 0") spike lengteas vastgesteld.
- Laat kleine translationeel verschuivingen (bijvoorbeeld 5 pixels) om rekening te houden met onnauwkeurigheden in manuele picking van de spikes (parameter "--shiftlimit 5").
- Breng een hoge symmetrie (bijvoorbeeld, c100) het gemiddelde (parameter "--symmetry c100"), een cilindrische gemiddelde rond de lange as van de piek te benaderen.
OPMERKING: Symmetrization wordt gebruikt om ruis in de gemiddelden te verminderen. - Gebruik de echte ruimte masker en de reciproke ruimte masker gegenereerd in de stappen 2.3 en 2.4 om weg te maskeren omgeving spikes en zijn goed voor de ontbrekende wig (parameters "--Mkaarten "en" --Mask "respectievelijk).
- Gebruik de twee MAP-bestanden gegenereerd in 2.6 (aangeduid door de volgende tags "even" en "oneven" in de bestandsnaam) als sjablonen (parameters "--Template1" en "--Template2", respectievelijk).
- Breng een low pass filter op 50-Å resolutie (parameter "--resolution") om de uitlijning vooringenomenheid te voorkomen.
- Breng een bin factor 2 te versnellen van de (parameter "--bin 2") verfijning.
- Run 5 iteraties van de aanpassing en het gemiddelde (parameters "--firstiter 1 --lastiter 5").
- Fase II. Het doel van deze fase is de hoek rond de weergave vector verfijnen. De input-bestand is de output SEL bestand uit stap 3.1.9.
- Meten van de precieze afmetingen van de piek door het openen van de low-pass gefilterd MAP-bestand gegenereerd in de laatste iteratie in stap 3.1.9 (aangegeven met tag "_lp" in de bestandsnaam) in bshow. Genereer een nieuwe echtespace masker eveneens naar stap 2.3 de piek definieert maar sluit meeste membraan en naburige pieken.
OPMERKING: De optimale grootte van het masker afhankelijk van de grootte en kenmerken van de nagel. - Gebruik 8 graden hoekige sampling (parameter "--angles 8,8,8") als voorheen.
- Toestaan 180 graden veranderingen in de hoek rond de piek view vector (parameter "- alphalimit 180"), maar houdt de theta en phi hoeken vast (parameter "--thetaphilimit 0").
- Gebruik geen translationeel verschuivingen niet toestaan (parameter "--shiftlimit 0").
- Gebruik geen symmetrie niet van toepassing op de gemiddelden (weglaten parameter "--symmetry").
- Gebruik de reciproque ruimte masker gegenereerd in stap 2.4 om rekening te houden met de ontbrekende wig.
- Gebruik de twee MAP-bestanden gegenereerd in de laatste iteratie van stap 3.1.9 zonder symmetrie (aangeduid door de volgende tags "even_nosym" en "odd_nosym" in de bestandsnaam) als sjablonen (parameters R20, - Template1 "en" --Template2 ", respectievelijk).
- Breng een low pass filter op 50-Å resolutie (parameter "--resolution") in de eerste iteratie om de uitlijning vooringenomenheid te voorkomen. Pas de filterparameters in de daaropvolgende iteraties automatisch (parameter "--adaptivefilter") gebaseerd op goud-standaard Fourier Shell Correlation (FSC) tussen de twee onafhankelijke gemiddelden. Gebruik 0,143-criterium (parameter "--fsccrit 0.143"). Laat verfijning niet toe voorbij de eerste nul van het contrast overdrachtsfunctie (CTF) (parameter "--minhires"), tenzij CTF correctie toegepast op het tomogram.
- Run 5-10 herhalingen van uitlijning en een gemiddelde (bijvoorbeeld parameters "--firstiter 6 --lastiter 15"). Toezicht houden op de veranderingen in de gerapporteerde resolutie. Wanneer er geen significante veranderingen worden waargenomen, kan het proces worden gestopt.
- Meten van de precieze afmetingen van de piek door het openen van de low-pass gefilterd MAP-bestand gegenereerd in de laatste iteratie in stap 3.1.9 (aangegeven met tag "_lp" in de bestandsnaam) in bshow. Genereer een nieuwe echtespace masker eveneens naar stap 2.3 de piek definieert maar sluit meeste membraan en naburige pieken.
- Beoordelen van de mate van symmetrie in de structuur door examining de resulterende laagdoorlaatfilter MAP-bestand (aangegeven met tag "_lp" in de bestandsnaam) in hersenschim. Bijvoorbeeld, als de piek is een trimere complex, moet 3-voudige symmetrie duidelijk zijn.
- Fase III. Het doel van deze fase is de hoek rond de weergave vector te verfijnen correcte symmetrie. De input-bestand is de output SEL bestand uit stap 3.2.9. De parameters zijn hetzelfde als in stap 3.2 met een paar uitzonderingen:
- Houd rekening met de veranderingen in de hoek rond de piek view vector. Als bijvoorbeeld de structuur 3-voudige symmetrie, veranderingen van 60 graden in de alfa hoek maakt (parameter "--alphalimit 60").
- Breng de correcte symmetrie (bijvoorbeeld c3) het gemiddelde (parameter --symmetry c3 ").
- Gebruik de twee MAP-bestanden gegenereerd in de laatste iteratie in stap 3.2.9 (aangeduid door de volgende tags "even" en "oneven" in de bestandsnaam) als input template bestanden (parameters "--Template1" en --Template2).
- Run 5-10 herhalingen van uitlijning en een gemiddelde (bijvoorbeeld parameters "--firstiter 16 --lastiter 25"). Toezicht houden op de veranderingen in de gerapporteerde resolutie. Wanneer er geen significante veranderingen worden waargenomen, kan het proces worden gestopt.
- Fase IV. Het doel van deze fase is om nauwkeurig gelijktijdig te verfijnen alle drie hoeken. De input-bestand is de output SEL bestand uit stap 3.4.4. De parameters zijn hetzelfde als in stap 3.4 met een paar uitzonderingen:
- Laat 8 graden veranderingen in de hoek rond de piek view vector (parameter "- alphalimit 8") en 8 graden veranderingen in de richting van de steker bekijken vector (parameter "--thetaphilimit 8"). Verfijnen van de oriëntaties aan nauwkeurigheid 4 graden (parameters "--angles 8,8,8 --iterate 2").
- Laat kleine verschuivingen (bijvoorbeeld 5 pixels) om rekening te houden met onnauwkeurigheden in de vorige uitlijning stappen (parameter "--shiftlimit 5").
- Use de twee MAP-bestanden gegenereerd in de laatste iteratie in stap 3.4.4 (aangeduid door de volgende tags "even" en "oneven" in de bestandsnaam) als input template bestanden (parameters "--Template1" en --Template2).
- Run 5-10 herhalingen van uitlijning en een gemiddelde (bijvoorbeeld parameters "--firstiter 26 --lastiter 35"). Toezicht houden op de veranderingen in de gerapporteerde resolutie. Wanneer er geen significante veranderingen worden waargenomen, kan het proces worden gestopt.
4 generatie en onderlinge afstemming van Zaden voor de Virus Surface voor Template Matching
- Genereer zaden zich gelijkmatig over het virionoppervlak voor template matching en wijs een eerste zicht vector om de zaden door het uitvoeren jviews.py. Gebruik de STAR-bestanden gegenereerd in stap 1.2.2 als input-bestanden. Genereer ongeveer 1,5 keer meer zaden dan het verwachte aantal spikes.
NOTE: Deze weergave vector benadert de richting van de piek die het dichtst bij elk zaadje punt.- Gelijkmatig verdeeld zaden op een ruwweg sferisch virion (parameter "--Even") genereren, geef de straal (parameter "--radius"), hoekige scheiding (bijvoorbeeld 20 graden) van de zaden (parameter "--angle 20" ) en de centrale coördinaat van het virion. Bijvoorbeeld, indien het virion wordt gecentreerd (na stap 1.2) in een doos met een afmeting van 250 x 250 x 250 pixels, de centrale coördinaat 125.125.125 pixels (optie "--origin 125.125.125") .
- Gelijkmatig verdeeld zaden op een filamenteuze deeltje te genereren, gebruikt u de parameter "--Filament" en geef zowel de straal en spiraalvormige symmetrie parameters (opkomst en twist).
OPMERKING: De spiraalvormige symmetrie parameters worden hier alleen gebruikt als een handige manier van het definiëren van gelijkmatig verdeeld zaad posities en ze hoeven niet om de werkelijke volgorde van de spikes op de gloeidraad weerspiegelen.
- Genereer twee onafhankelijke gemiddelden van het virus oppervlak als explained in paragraaf 2.
- Genereer een SEL-bestand definiëren van virusdeeltjes die behoren tot sets "1" en "2" met jsubtomo_evenodd.py en de STAR-bestanden gegenereerd in stap 4.1.
OPMERKING: Om de onafhankelijkheid van de datasets, eventuele eerdere toewijzing van de virusdeeltjes in groepen te garanderen "1" en "2" moet hetzelfde blijven.
- Genereer een SEL-bestand definiëren van virusdeeltjes die behoren tot sets "1" en "2" met jsubtomo_evenodd.py en de STAR-bestanden gegenereerd in stap 4.1.
- Verfijnen de positie van de zaden.
- Volg de instructies in stap 3.1, tenzij anders vermeld. Gebruik de SEL-bestand gegenereerd in stap 4.2.1 als het invoerbestand.
- Laat de zaden alleen verschuiven langs de loodrecht op het membraan (parameter "--zshiftlimit"). Pas de toegestane mate van verschuiving afhankelijk van hoeveel de virions afwijken ideale bolvormige geometrie (bijvoorbeeld parameter --zshiftlimit 25 ").
- Gebruik de twee MAP-bestanden gegenereerd in stap 4.2 (aangeduid door de volgende tags "even" en "oneven" in de bestandsnaam) als input template bestanden (parameters "--TemPlate1 "en --Template2).
- Gebruik een uniek achtervoegsel om te voorkomen dat het overschrijven van de oorspronkelijke ingang STAR-bestanden (bijvoorbeeld parameter "--suffix _seeds").
- Gebruik binning van 4 tot en met het versnellen van de (parameter "--bin 4") berekening en een low-pass filter (bijvoorbeeld parameter "--resolution 50").
- Genereer Chimera marker bestanden (CMM) van de geraffineerde zaad STAR-bestanden met behulp van jviews.py (parameter "--cmm"). Onderzoek de zaden door het openen van de CMM-bestanden (en de bijbehorende virion MAP-bestanden) in hersenschim. Zorg ervoor dat de verfijnde zaden worden afgestemd correct ten opzichte van het virus membraan.
OPMERKING: Verschillende kleuren kunnen worden gebruikt om afzonderlijke sets van merkers (parameter "--color") differentiëren. Ook de verfijnde markers kan worden gekleurd op basis van hun kruis correlatiecoëfficiënt (bijvoorbeeld parameter "--fomcolor 0.1,0.3").
5 Gold-standard Iteratief Alignment en middeling van de Spike Structuur
Alle pieken in het virion sub-volumes met behulp van lokale template matching rond de verfijnde zaden automatisch te lokaliseren en af te stemmen en het gemiddelde van de gevonden spikes. Gebruik gemiddelden gegenereerd uit een subset van de hand geplukt spikes als initiële templates.
- Voeren lokale template matching rond de zaden van alle pieken met programma jsubtomo_iterate_gold.py gemiddeld. Volg de instructies in stap 3.5, tenzij anders vermeld.
- De input-bestand is de SEL-bestand voor de verfijnde zaden gegenereerd in stap 4.3.
- Gebruik een voldoende grote beperking voor het uitzicht vector hoek. Bijvoorbeeld, als zaden werden gegenereerd om de 20 graden (stap 4.1), gebruikt u een hoek iets groter dan de helft van deze waarde (parameter "--thetaphilimit 12"). Houd rekening met de veranderingen in de hoek rond de piek view vector.
- Laat zaden verschuiven in het vlak van het membraan (parameter"--xyshiftlimit"). Bijvoorbeeld, als het zaad-tot-zaad afstand is 25 pixels, gebruik dan de totale verschuiving iets meer dan de helft van deze (bijvoorbeeld parameters "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
LET OP: Extra translationeel verschuivingen kan nodig zijn als de MAP-bestanden gegenereerd in stap 3.5 worden gecentreerd op een andere afstand van het virion centrum dan de zaden. - Gebruik de twee MAP-bestanden gegenereerd in stap 3.5 (aangeduid door de volgende tags "even" en "oneven" in de bestandsnaam) als input template bestanden (parameters "--Template1" en --Template2).
- Gebruik de huidige resolutie van de MAP-bestanden gegenereerd in stap 3.5 (parameter --resolution).
- Run 5-10 herhalingen van template matching, afstemming en middeling (bijvoorbeeld parameters "--firstiter 1 --lastiter 10"). Toezicht houden op de veranderingen in de gerapporteerde resolutie. Wanneer er geen significante veranderingen worden waargenomen, kan het proces worden gestopt.
- Na elke iteratie, Exclusief overlappende hits. Bijvoorbeeld als de breedte van de piek is 30 pixels, exclusief klappen die dichter dan 30 pixels naar andere klappen (parameter "--mindist 30").
- Uitsluiten klappen met een laag kruis correlatie coëfficiënt. Bijvoorbeeld, zijn de beste 75% spikes voor elk virion (parameter "--topp 75").
OPMERKING: Hits met een laag kruis correlatie coëfficiënt zijn waarschijnlijk vals positieve klappen vertegenwoordigen.
6 Visualisatie van de resultaten
- Open de verfijnde structuur van de piek in de hersenschim voor visualisatie en montage van atomaire structuren.
- Gebruik de low-pass gefilterd MAP-bestand (aangegeven met tag "lp") die in de laatste herhaling in stap 5.1.6 als het invoerbestand.
- Gebruik de resolutie aangegeven in stap 5.1.6 voor cross-correlatie gebaseerde montage in chimera "Fit in Kaart" tool.
- Maak een composiet-model van de virion gebruik jsubtomo_create_model.py.
- Gebruik de low-pass gefilterd MAP-bestand (aangegeven met tag "lp") die in de laatste herhaling in stap 5.1.6 als de input MAP bestand (parameter "--Template").
- Gebruik een STAR-bestand gegenereerd in de laatste herhaling in stap 5.1.6 als de input STAR-bestand.
- Gebruik het masker bestand gegenereerd in stap 3.2.1 rekening te houden met overlappende dichtheden in het samengestelde model (parameter "--mask").
- Geven de grootte van het virion MAP-bestand om een samengesteld model van dezelfde grootte (parameter "--size") genereren.
- Open het samengestelde model voor visualisatie in chimera.
Representative Results
We tonen de toepassing van het sub-tomogram middeling workflow hierboven voor de omhulling glycoproteïne complex van Bunyamwera virus (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) met een eerder gepubliceerde data set 24. Gegevensverzameling en verfijning parameters worden opgesomd in tabel 1. Een vertegenwoordiger tomogram weergegeven in figuur 2.
| Parameter (unit) | Waarde |
| Het verzamelen van gegevens | |
| Spanning (kV) | 300 |
| Gekalibreerd vergroting (X) | 111.000 |
| Pixelgrootte (A) | 5.4 |
| Geschatte dosis (e - / A 2) | 100 |
| Underfocus (pm) | 4,0-4,5 |
| Eerste CTF nul (a) een | 26-30 |
| Tilt bereik (°) | -60-60 |
| Tilt bemonstering (°) | 3 |
| Data en verfijning | |
| Tomogrammen | 11 |
| Virionen | 29 |
| Zaden per virion | 106 |
| Totaal aantal zaden | 3.074 |
| Spikes gedetecteerd | 1.346 |
| Spikes na het verwijderen van overlappingen | 1.401 |
| Spikes na cross-correlatie gebaseerde selectie | 1.022 |
| Spikes in de definitieve gemiddelde | 1.022 |
| Symmetrie | C3 |
| Hoek sampling (°) | 8 |
| Resolutiewaaier gebruikt in de verfijning (A) | 42-334 |
| Uiteindelijke schatting resolutie (a) b | 35 |
Tabel 1: Bunyamwera dataverzameling en verfijning statistieken.
een CTF, contrast transfer functie.
b Berekend met behulp van Fourier-shell correlatie tussen twee onafhankelijk verfijnde structuren op een drempel van 0,143.
Figuur 2:. Plak door een tomogram van Bunyamwera virions Verschillende spike zijaanzichten zichtbaar in de omtrek van elk virion zijn aangegeven met pijlpunten. De tomogram is low-pass gefilterd tot 60 Å. Schaalbalk 100 nm.
Ten eerste hebben we verfijnd een eerste model met 205 handmatig geplukt spikes (
Figuur 3: Verfijning van de uitgangstemplate structuur. (A) cilindrisch gemiddeld (C100) sjabloon gemaakt van handmatig gedefinieerde posities van spikes. (B) Averaged dichtheid na vijf rondes van verfijning zonder symmetrie (C1) opgelegd toont een piek met drie-voudigesymmetrische functies. De resolutie van het model is 48 Å. (C) Gemiddelde van de piek werd besloten op 41 Å na vijf rondes van verfijning met drie-voudige symmetrie.
Figuur 4:. Verfijning van de zaden AB) Een subgroep van zaden voor (A) en na (B) verfijning zijn vertegenwoordigd op een virion dichtheid van figuur 2 Zaden (B) zijn kleurgecodeerd op basis van de respectieve cross. correlatiecoëfficiënten (blauw, lage correlatie, rood, hoge correlatie).
De beste correleren spike glycoproteïne pleisters (boven 75% na verwijderen overlappingen; ~ 1000 spikes) werden gebruikt om de uiteindelijke gemiddelde berekenen. Het gemiddelde werd besloten 35-Å resolutie (figuur 5). Het bleek een trimeric piek structuur in het midden, inNaast een bijdrage uit zes naburige pieken. Composiet modellen van de virions, berekend door het plaatsen van de constructie in de bekende posities, onthulde plaatsing van de spikes op het virionoppervlak (figuur 6A). Af en toe, ter plaatse te reserveren flarden van spikes waren duidelijk (figuur 6B).
Figuur 5: Geraffineerde structuur van een patch van het glycoproteïne piek laag na template matching. (AB) Two maps "even" en "oneven", gereconstrueerd uit twee helften van de gegevens worden getoond. De twee kaarten tonen een opmerkelijke mate van overeenstemming, het verifiëren van de validness van de aanpak. De oriëntatie rond de piek lange as anders als de twee kaarten volledig onafhankelijk gereconstrueerd van elkaar. (C) Het gemiddelde van de twee kaarten is te zien opde uiteindelijke resolutie van 35 Å.
Figuur 6: Plaatsing van de spikes op de Bunyamwera virion. (A) Samengestelde model van een virion. Bekijk vectoren (stokken) geven de oriëntaties van de spikes. Kleuren geven de cross-correlatie tussen elke spike en de template structuur (blauw, lage correlatie, rood, hoge correlatie). (B) Een close-up van een geordende patch van spikes.
Discussion
Kennis van virale spike glycoproteïne structuur het virion membraan essentieel voor het begrijpen van virusreplicatie en ontwikkeling van therapeutica voor de behandeling en preventie van infectie. Elektron cryo-microscopie gecombineerd met enkel deeltje middeling heeft ontpopt als de meest gebruikte methode om de structuren van de omhulde virusdeeltjes, met inbegrip van het glycoproteïne spikes op te lossen. Echter, deze werkwijze beperkt tot symmetrische virussen icosahedrally. Hier, door de toepassing van elektronen cryo-tomografie en subtomogram middeling in Jsubtomo, we hebben een algemeen protocol voor het bepalen van glycoproteïne spikes op pleomorfe omhulde virussen die niet vatbaar zijn voor andere lopende structurele biologie methoden zijn beschreven. De representatieve resultaten tonen aan dat de oplossing van deze werkwijze voldoende is om inzicht in domeinarchitectuur, oligomerisatie en hogere orde ordening glycoproteïne spikes op intacte virions onthullen.
jove_content "> De meest kritische stap in dit protocol is de bouw van twee betrouwbare start modellen die zijn statistisch onafhankelijk van elkaar. Succesvolle uitvoering van deze stap gaat ervan uit dat glycoproteïne spikes zijn voldoende groot en niet gepakt tegen elkaar te strak, zodat de individuele pieken kunnen visueel herkend en handmatig kozen in het tomogram, en twee onafhankelijke modellen gemiddeld. Als dit niet mogelijk, twee wijzigingen aan het protocol kan worden geprobeerd. eerste twee onafhankelijke stochastische modellen kunnen worden geconstrueerd door eerst definiëren twee deelverzamelingen van subtomograms en het middelen van de subtomograms binnen deze subgroepen 30. tweede, als een structuur van de geïsoleerde piek is afgeleid door andere middelen, bijvoorbeeld door röntgenkristallografie, kan het worden gebruikt als uitgangspunt model. Wel moet erop worden genomen lage- pass filter dit model met een lage resolutie cut-off (50-70 Å), als de twee resulterende modellen in de volgende ronde van verfijning zalzijn statistisch onafhankelijk alleen buiten deze resolutie. Vanwege dit voorbehoud, is de vroegere aanpak aanbevolen.De verkrijgbare resolutie van dit protocol is afhankelijk van vier belangrijke factoren: i. gegevensverzameling strategie en de kwaliteit van de invoergegevens, ii. nummer van de subtomograms, iii. uitlijnnauwkeurigheid van de subtomograms en iv. heterogeniteit van de structuur. Terwijl de eerste en tweede begrenzing kan grotendeels worden ondervangen door een hoge signaal-ruis direct electron detectors gecombineerd met CTF gecorrigeerde tomography en geautomatiseerde gegevensverzameling, wordt de nauwkeurigheid uitlijning verder beïnvloed door de grootte en vorm van de structuur plaats zelf. Bij toepassing van dit protocol kleine pieken ontbreken opvallende kenmerken, kan het voordelig zijn om Fab fragmenten binden aan de nagel om de uitlijning nauwkeurigheid en resolutie dus 31 verbeteren. Ten slotte, als de structuren moeten worden gemiddeld vertonen meerdere conformaties, sub-Tomografieam classificatie methoden kunnen worden gebruikt om verschillende conformaties gemiddeld afzonderlijk. Daartoe Jsubtomo integreert met de Dynamo-pakket, die een krachtige subtomogram classificatie 9.
Het bovenstaande protocol is een aanvulling op de X-ray kristallografie van geïsoleerde virale glycoproteïnen. Kristallografische structuren kunnen worden aangebracht in gemiddelden sub-tomogram de precieze oriëntatie van het glycoproteïne te verkrijgen met betrekking tot het virion membraan. Toepassing van deze methode zal ongetwijfeld blijven licht te werpen op omhuld virus structuur en pathobiology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).
