Abstract
Les virus enveloppés utilisent des glycoprotéines membranaires sur leur surface d'entrée de médiation dans des cellules hôtes. Analyse la structure tridimensionnelle de ces glycoprotéine 'pointes' est souvent techniquement difficile, mais important pour la compréhension de la pathogenèse virale et dans la conception de médicaments. Ici, un protocole est présenté pour virale détermination de la structure de pointe par le biais de la moyenne de calcul de données cryo-tomographie électronique. Cryo-tomographie est une technique en microscopie électronique utilisée pour obtenir des reconstructions tridimensionnelles tomographiques de volume, ou des tomographies, des échantillons biologiques tels que les virus polymorphes de la membrane dans un état quasi-native, congelé-hydraté. Ces tomographies révèlent des structures d'intérêt en trois dimensions, mais à faible résolution. Moyenne de calcul de sous-volumes, ou sous-tomographies, est nécessaire pour obtenir plus de détails de la résolution de la répétition des motifs structuraux, tels que pointes de glycoprotéines virales. Une approche de calcul détaillé pour aligning et moyenne sous-tomographies à l'aide du logiciel Jsubtomo est décrite. Cette approche permet la visualisation de la structure de pointes de glycoprotéines virales à une résolution de l'ordre de 20-40 Å et l'étude de l'étude de la hausse des commandes pic-à-pic interactions sur la membrane du virion. Les résultats typiques sont présentés pour le virus Bunyamwera, un virus enveloppé de la famille des Bunyaviridae. Cette famille est un groupe structurellement divers agents pathogènes constituent une menace pour la santé humaine et animale.
Introduction
Electron cryo-tomographie est une technique d'imagerie cryo-microscopie électronique permettant le calcul d'un à trois dimensions (3D) de reconstruction des échantillons biologiques complexes. Spécimens appropriés vont de complexes macromoléculaires purifiés 1, 2 filaments, vésicules enrobées 3, et les virus polymorphes de la membrane 4 à 5 cellules procaryotes entiers et même des zones minces de cellules eucaryotes entiers 6. Après la collecte de données d'une inclinaison de la série, les volumes tomographiques 3D, ou des tomographies, peut être calculée en utilisant plusieurs logiciels, y compris celles bSoft 7 et 8 MID.
Deux aspects inhérents à l'étude d'échantillons biologiques par la limite d'électrons cryo-tomographie l'interprétation biologique des volumes tomographiques correspondant. Tout d'abord, en raison de la limitation de la dose d'électrons qui peut être appliquée à des matières biologiques avant d'introduire dégâts d'irradiation importante, signaratios l-bruit dans les données tomographiques sont généralement très faibles. Deuxièmement, à la suite d'un échantillonnage limité géométrie d'inclinaison lors de la collecte de données, des vues de l'objet restent absents, conduisant à une soi-disant «manque de coin 'artefact dans le volume tomographique. Cependant, ces deux limitations peuvent être surmontées si le volume tomographique contient répéter des structures identiques, tels que des complexes macromoléculaires, qui peuvent être avec succès moyennes 9-12.
Avant moyenne des structures de reconstructions de tomographie, les objets d'intérêt doivent être trouvés et alignés à la même orientation. La localisation de ces structures peut être réalisée par corrélation croisée d'une structure de matrice dans le volume tomographique utilisant une approche souvent dénommé modèle correspondant 13. Le modèle utilisé dans ce processus d'adaptation peut être dérivé de cryo-microscopie électronique ou électronique de cryo-tomographie par reconstruction 3D combiné, ou il peut être une carte de densité de simulationune structure atomique. Plusieurs forfaits de calcul ont été développés pour mener à bien ces tâches 11.
Calcul de la moyenne des pics de la glycoprotéine du virus de la membrane, comme le VIH-1, a été une approche particulièrement efficace pour l'étude de la structure 14 à 16. Une bonne compréhension de la structure fait partie intégrante de révéler à la fois les bases moléculaires des interactions virus-hôte et l'orientation du développement de la conception antiviral et un vaccin. Bien que la cristallographie macromoléculaire est la technique de choix pour la haute résolution (généralement mieux que 4 Å) Analyse structurale des glycoprotéines virales et de leurs complexes, les structures de rayons X résultant de cette méthode sont des protéines isolées de l'environnement membranaire naturel sur le virion . Ainsi, les détails importants tels que l'architecture d'ordre supérieur de glycoprotéines virales, dans le contexte du virion, demeurent insuffisantes. D'autre part, cryo-microscopie électronique et reconstruction de particule uniquedes virus enveloppés ensemble est limité à virions à symétrie icosaédrique 17,18. Cryotomography électronique associée à l'alignement de sous-volume est donc apparue comme une technique complémentaire qui permet l'étude des pics de la glycoprotéine de forme irrégulière, les virus polymorphes in situ.
Nous avons développé un logiciel nommé Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) pour la détection, l'alignement et la moyenne des sous-volumes tomographiques. Jsubtomo a été utilisée dans la détermination de la structure d'un certain nombre de structures cellulaires et virales 19-26. Ici, nous présentons un protocole détaillé, qui permet de déterminer les structures de pic viral de la surface. Pour contourner excès de raffinement structures moyennes en corrélant le bruit, le schéma de raffinement «étalon-or» est adoptée 10,27. Enfin, les stratégies pour la visualisation et l'interprétation des résultats typiques sont discutés.
Protocol
Un protocole détaillé pour l'alignement de calcul et la moyenne ultérieure de pointes de glycoprotéines virales est décrite. Le protocole suit le flux de travail illustré à la figure 1 et combine une recherche automatique pour les pointes à l'aide de structures de matrice initiales et un affinement de la structure de l'étalon-or.
Les données d'entrée pour ce protocole est un ensemble de reconstructions tomographiques des virions. Une tomographie contient un ou plusieurs des virions. Au départ, un petit sous-ensemble de pointes est ramassé manuellement et utilisé en moyenne et affiner deux modèles indépendants. Ces modèles sont utilisés pour localiser automatiquement les pointes sur tous les virions. Enfin, deux raffinements indépendants sont exécutés et les moyennes obtenues sont comparées et combinées pour produire la structure finale.
L'approche de raffinement est démontré en utilisant des programmes de l'emballage Jsubtomo. Les programmes du paquet bSoft 28 sont utilisés pour l'image générale ptâches rocessing et graphiques moléculaires paquet UCSF Chimera 29 est utilisé pour visualiser les résultats. Les noms des différents programmes sont donnés en italique et les formats de fichiers sont désignés par les extensions de fichier en majuscules.
Figure 1:.. Stratégie générale pour la détermination des structures de la glycoprotéine complexes pic de virus polymorphes membrane Les numéros correspondent aux différentes sections du Protocole S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
1 Extraction Virus sous-volumes de pleine grandeur tomographies
- Choisissez particules virales manuellement dans les tomographies.
- Ouvrir un fichier de tomographie en bShow. Définir coordonnées du centre d'une partic de virusle en utilisant l'outil de particules-picking. Répétez cette étape jusqu'à ce que tous les virions ont été traitées. Coordonne Enregistrer virus dans un fichier STAR.
- Répétez l'étape 1.1.1 jusqu'à ce que tous les tomographies ont été traitées. Prenez note du diamètre du virion en pixels.
NOTE: Si les pointes sont difficiles à voir dans les tomographies, utilisez bfilter de filtre passe-bas du tomographies à 80 Å de résolution (paramètre "-bandpass 80,10000").
- Exécutez jsubtomo.py en mode extrait (paramètre "extrait --mode") pour extraire des sous-volumes de virions à des fichiers de volume individuels. Utilisez les fichiers enregistrés STAR à l'étape 1.1.1 sous forme de fichiers d'entrée.
- Donner une taille (paramètre "--size") ~ 25% plus grand que le plus grand virion dans l'ensemble de données. Par exemple, si le virion est ~ 200 pixels de diamètre, l'utilisation de taille 250 x 250 x 250 pixels.
- Fichiers de sortie des volumes de virions seront CARTE format. En outre, créer une STAR fichier d'accompagnement pour chaque volume de virion (Paraméter "--output").
- Normaliser les volumes de virions dans bimg (paramètre "0,1 -rescale").
2. génération de deux modèles initiaux indépendants
- Choisissez un sous-ensemble de pointes dans les sous-volumes de virions.
- Ouvrez un fichier MAP sous-volume du virion dans bShow. Définir coordonnées du centre d'une pointe à l'aide de l'outil de particules cueillette, accessible via la fenêtre Boîte à outils. Répétez cette étape jusqu'à ce que toutes les pointes bien distinctes ont été traitées. Coordonne Enregistrer pic dans un fichier STAR.
- Si nécessaire, répétez l'étape 2.1.1 pour d'autres virions jusqu'à environ 200 pointes de glycoprotéines ont été traitées. Remarque dimensions de pointes en pixels.
NOTE: ~ 200 pointes sont une indication approximative et plus peuvent être nécessaires pour certaines applications. Si possible, viser à prendre pointes dans des orientations différentes. Évitez de ramasser seulement des vues de dessus.
- Attribuer une vue vecteur initial pour les pointes en exécutant jviews.py. Utilisez les fichiers STAR générés à l'étape 2.1.1 sous forme de fichiers d'entrée.
NOTE: Ce vecteur de vue se rapproche de la direction de la pointe par rapport à la virion.- Utilisez le central de coordonnées pour attribuer les points de vue pour un virion sphérique. Par exemple, si le virion est centré (après l'étape 1.2) dans une boîte de taille 250 x 250 x 250 pixels, le centre de coordonnées est 125.125.125 pixels (option "--Radial 125125125").
- Pour attribuer les points de vue pour un virion filamenteux, ouvrir chaque sous-volume du virion dans bShow en utilisant le fichier de STAR définie à l'étape 2.1.1 que le fichier d'entrée. Définir les deux points du filament en utilisant l'outil de cueillette de filaments de gamme et enregistrez le fichier STAR. Répétez cette étape jusqu'à ce que tous les fichiers de STAR ont été mis à jour et exécuter jviews.py en utilisant les fichiers de mises à jour STAR en tant que fichiers d'entrée (--option Segment).
- Générer un masque de l'espace réel à l'aide jsubtomo_create_mask.py. Assurez-vous que le masque de l'espace réel est de la même dimensions comme il sera utilisé pour la structure moyenne (voir 2.6.2) et est suffisamment grande pour contenir à la fois la pointe et un morceau de la membrane sous-jacente.
- Générer un masque de l'espace réciproque à l'aide jsubtomo_create_wedgemask.py. Le masque de l'espace réciproque est utilisé pour exclure les régions dans le «coin manquant" région résultant de la collecte de données tomographique à un seul axe. Assurez-vous qu'il est de la même dimension que celui utilisé pour la structure moyenne (voir 2.6.2).
- Générer un fichier de sélection (fichier SEL) définissant virions appartenant à des ensembles "1" et "2" à l'aide jsubtomo_evenodd.py et les fichiers STAR générés à l'étape 2.2.
- Générer deux moyennes initiaux à l'aide jsubtomo_create_averages.py.
- Utilisez le fichier de SEL généré à l'étape 2.5 que le fichier d'entrée.
- Donner une taille (paramètre "--size") d'au moins 32 pixels de plus de la plus grande dimension de la pointe. Par exemple, si la pointe est d'environ 40 pixels de long, l'utilisation de taille 72 x 72 x 72 pixels.
- Appliquer une symétrie élevée (par exemple, c100) sur les moyennes (paramètre "--symmetry c100"), à rapprocher d'une moyenne cylindrique autour de l'axe de long de la pointe. Utilisez symétrisation pour réduire le bruit dans les moyennes initiales.
- Donnez un nom unique pour les fichiers de sortie du projet (paramètre "--suffix").
- Utilisez le masque de l'espace réel généré à l'étape 2.3 pour masquer l'écart fond (paramètre "--mask"). Utilisation du masque de l'espace réciproque généré à l'étape 2.4 pour tenir compte de la perte du signal introduite par la présence d'un coin manquant (paramètre "--mask").
Alignement itératif 3 Gold-standard et calcul de la moyenne des deux modèles de pointe initiale
Itérative aligner et la moyenne des deux premiers modèles générés à l'article 2 de jsubtomo_iterate_gold.py.
- Stade I. L'objectif de cette étape est d'affiner ladirection du vecteur de visualisation. Le fichier d'entrée est le fichier de SEL généré à l'étape 2.5.
- Utilisez un échantillonnage angulaire de 8 degrés (paramètre "--angles 8,8,8").
- Autoriser les changements de 16 degrés dans la direction du vecteur de vue de pointe (paramètre "--thetaphilimit 16") mais garder l'angle autour de l'axe pointe longue (paramètre "--alphalimit 0").
- Permettre aux petits changements de translation (par exemple, 5 pixels) pour tenir compte des inexactitudes dans la cueillette manuelle des pointes (paramètre "--shiftlimit 5").
- Appliquer une symétrie élevée (par exemple, c100) sur les moyennes (paramètre "--symmetry c100"), à rapprocher d'une moyenne cylindrique autour de l'axe de long de la pointe.
NOTE: La symétrisation est utilisé pour réduire le bruit dans les moyennes. - Utilisez le masque réel de l'espace et le masque de l'espace réciproque généré dans les étapes 2.3 et 2.4 pour masquer l'écart des pointes et compte environnantes pour le coin manquant (paramètres "--mdemander "et" --mask ", respectivement).
- Les deux fichiers de carte générée en 2.6 (désigné par tags "même" et "bizarre" dans le nom de fichier) comme modèles (paramètres "--Template1" et "--Template2", respectivement).
- Appliquer un filtre passe-bas à 50 Å de résolution (paramètre "--resolution") afin d'éviter un biais de l'alignement.
- Appliquer un facteur de bin de 2 à accélérer le raffinement (paramètre "--bin 2").
- Exécutez 5 itérations de l'alignement et la moyenne (paramètre "--firstiter 1 --lastiter 5").
- Phase II. Le but de cette étape est d'affiner l'angle autour du vecteur de vue. Le fichier d'entrée est le fichier de sortie SEL de l'étape 3.1.9.
- Mesurer les dimensions précises de la pointe en ouvrant le fichier MAP filtré passe-bas généré dans la dernière itération à l'étape 3.1.9 (désigné par tag "_lp" dans le nom du fichier) dans bShow. Générer un nouveau réelle masque de l'espace de manière similaire à l'étape 2.3, qui définit la pointe, mais exclut la plupart des membranes voisines et les pointes.
REMARQUE: La taille optimale du masque dépend de la taille et les caractéristiques de la pointe. - Utilisez 8 degrés échantillonnage angulaire (paramètre "--angles 8,8,8") comme avant.
- Permettre des changements à 180 degrés de l'angle autour du vecteur de vue de pic (paramètre "- alphalimit 180") mais garder le thêta et angles phi fixe (paramètre "--thetaphilimit 0").
- Ne laissez pas les changements de translation (paramètre "--shiftlimit 0").
- Ne pas appliquer de symétrie sur les moyennes (omettre le paramètre "--symmetry").
- Utilisation du masque de l'espace réciproque généré à l'étape 2.4 pour tenir compte du coin manquant.
- Utilisez les deux fichiers de carte générée lors de la dernière itération de l'étape 3.1.9 sans symétrie (noté par tags "even_nosym" et "odd_nosym" dans le nom du fichier) que des modèles (paramètres R20; - Template1 "et" --Template2 ", respectivement).
- Appliquer un filtre passe-bas à 50 Å de résolution (paramètre "--resolution") dans la première itération de prévenir biais d'alignement. Réglez les paramètres de filtre dans les itérations suivantes automatiquement (paramètre "--adaptivefilter") basé sur l'étalon-or de Fourier Shell Correlation (FSC) entre les deux moyennes indépendantes. Utilisez 0,143-critère (paramètre "--fsccrit 0,143"). Ne pas laisser le raffinement passé le premier zéro de la fonction de transfert de contraste (CTF) (paramètre "--minhires»), à moins que la correction de la FCE a été appliquée à des tomographies.
- Exécutez 5-10 itérations de l'alignement et en moyenne (par exemple, les paramètres "--firstiter 6 --lastiter 15"). Surveiller les changements de la résolution rapporté. En l'absence de changements significatifs sont observés, le processus peut être arrêté.
- Mesurer les dimensions précises de la pointe en ouvrant le fichier MAP filtré passe-bas généré dans la dernière itération à l'étape 3.1.9 (désigné par tag "_lp" dans le nom du fichier) dans bShow. Générer un nouveau réelle masque de l'espace de manière similaire à l'étape 2.3, qui définit la pointe, mais exclut la plupart des membranes voisines et les pointes.
- Évaluer le degré de symétrie dans la structure par examining le fichier résultant de passe-bas CARTE filtré (notée par tag "_lp" dans le nom du fichier) dans la chimère. Par exemple, si le pic est un complexe trimérique, 3 symétrie devrait être évident.
- Stade III. Le but de cette étape est d'affiner l'angle autour du vecteur de vue plus loin avec symétrie correcte. Le fichier d'entrée est le fichier de sortie SEL de l'étape 3.2.9. Les paramètres sont les mêmes que dans l'étape 3.2 à quelques exceptions près:
- Autoriser les changements appropriés dans l'angle autour du vecteur de vue de pointe. Par exemple, si la structure a 3 symétrie, permettre des changements de 60 degrés dans l'angle alpha (paramètre "--alphalimit 60").
- Appliquer la symétrie correcte (par exemple, c3) sur les moyennes (paramètre --symmetry c3 ").
- Utilisez les deux fichiers de carte générée dans la dernière itération à l'étape 3.2.9 (désigné par tags "même" et "bizarre" dans le nom du fichier) que les fichiers de modèle d'entrée (paramètres "--Template1" et --Template2).
- Exécutez 5-10 itérations de l'alignement et en moyenne (par exemple, les paramètres "--firstiter 16 --lastiter 25"). Surveiller les changements de la résolution rapporté. En l'absence de changements significatifs sont observés, le processus peut être arrêté.
- Stade IV. Le but de cette étape est d'affiner avec précision tous les trois angles simultanément. Le fichier d'entrée est le fichier de sortie SEL de l'étape 3.4.4. Les paramètres sont les mêmes que dans l'étape 3.4 à quelques exceptions près:
- Autoriser les changements de 8 degrés dans l'angle autour du vecteur de vue de pic (paramètre "- alphalimit 8") et les changements de 8 degrés dans la direction du vecteur de vue de pic (paramètre "--thetaphilimit 8"). Affiner les orientations à l'exactitude 4 degrés (paramètres "--angles 8,8,8 --iterate 2").
- Permettre aux petits changements (par exemple, 5 pixels) pour tenir compte des imprécisions dans les mesures d'alignement précédentes (paramètre "--shiftlimit 5").
- USE les deux fichiers de carte générée dans la dernière itération à l'étape 3.4.4 (indiqués par des étiquettes «même» et «bizarre» dans le nom de fichier) comme les fichiers de modèle d'entrée (paramètres "--Template1" et --Template2).
- Exécutez 5-10 itérations de l'alignement et en moyenne (par exemple, les paramètres "--firstiter 26 --lastiter 35"). Surveiller les changements de la résolution rapporté. En l'absence de changements significatifs sont observés, le processus peut être arrêté.
4. génération et l'alignement des semences à la surface du virus de Template Matching
- Générer graines situées de façon uniforme sur la surface du virion pour modèle correspondant et affecter une vue vecteur initial pour les graines en exécutant jviews.py. Utilisez les fichiers STAR générés à l'étape 1.2.2 sous forme de fichiers d'entrée. Générer environ 1,5 fois plus de graines que le nombre prévu de pointes.
NOTE: Ce vecteur de vue se rapproche de la direction de la pointe la plus proche de chaque point de semences.- Pour générer semences distribuées uniformément sur un virion à peu près sphérique (paramètre "--Même»), donne le rayon (paramètre "--radius"), la séparation angulaire (par exemple, 20 degrés) des graines (paramètre "--angle 20" ) et la centrale coordonnées du virion. Par exemple, si le virion est centré (après l'étape 1.2) dans une boîte avec une taille de 250 x 250 x 250 pixels, la centrale de coordonnées est 125 125 125 pixels (option "--origin 125125125") .
- Pour générer semences distribuées uniformément sur une particule filamenteuse, utilisez le paramètre "--Filament" et spécifier à la fois le rayon et les paramètres de symétrie hélicoïdale (montée et torsion).
REMARQUE: Les paramètres de symétrie hélicoïdaux sont utilisés ici seulement comme un moyen commode de définir des positions de semences distribuées de manière uniforme et qu'ils n'ont pas besoin de tenir compte de l'ordre réel des pointes sur le filament.
- Générer deux moyennes indépendantes de la surface du virus en tant que explained de l'article 2.
- Générer un fichier de définition SEL virions appartenant à des ensembles "1" et "2" à l'aide jsubtomo_evenodd.py et les fichiers STAR générés à l'étape 4.1.
REMARQUE: Pour assurer l'indépendance des ensembles de données, toute cession antérieure des virions en groupes "1" et "2" doit rester le même.
- Générer un fichier de définition SEL virions appartenant à des ensembles "1" et "2" à l'aide jsubtomo_evenodd.py et les fichiers STAR générés à l'étape 4.1.
- Affiner la position des graines.
- Suivez les instructions de l'étape 3.1, sauf indication contraire. Utilisez le fichier de SEL généré à l'étape 4.2.1, le fichier d'entrée.
- Laisser les graines se déplacent seulement le long de la normale à la membrane (paramètre "--zshiftlimit"). Ajustez la quantité autorisée de déplacement en fonction de combien les virions s'écartent de la géométrie sphérique idéale (par exemple, le paramètre --zshiftlimit 25 ").
- Utilisez les deux fichiers de carte générée à l'étape 4.2 (désigné par tags "même" et "bizarre" dans le nom du fichier) que des fichiers de modèle d'entrée (paramètres "--TemPlate1 "et --Template2).
- Utilisez un suffixe unique pour éviter d'écraser les fichiers STAR d'entrée d'origine (par exemple, le paramètre "--suffix _seeds").
- Utilisation de 4 binning pour accélérer le calcul (paramètre "--bin 4") et un filtre passe-bas (par exemple, le paramètre "--resolution 50").
- Générer des fichiers de marqueurs Chimera (CMM) des fichiers raffinés STAR de semences en utilisant jviews.py (paramètre "--cmm"). Examinez les graines en ouvrant les fichiers CMM (et les fichiers associés virion MAP) en chimère. Assurez-vous que les graines raffinées sont correctement alignés par rapport à la membrane du virus.
REMARQUE: Les différentes couleurs peuvent être utilisées pour différencier des ensembles distincts de marqueurs (paramètre "--color"). Alternativement, les marqueurs raffinés peuvent être colorés en fonction de leur coefficient de corrélation croisée (par exemple, le paramètre "--fomcolor 0.1,0.3").
5. or-piedard itératif alignement et calcul de la moyenne de la structure Spike
Localiser automatiquement toutes les pointes dans les sous-volumes de virions à l'aide de correspondance de gabarit locale autour des graines raffinées et aligner et la moyenne des pics situés. Utilisez les moyennes générées à partir d'un sous-ensemble de pointes, récolté manuellement que les modèles initiaux.
- Effectuer correspondance de gabarit locale autour des graines à la moyenne de toutes les pointes à l'aide de programme jsubtomo_iterate_gold.py. Suivez les instructions de l'étape 3.5, sauf indication contraire.
- Le fichier d'entrée est le fichier de SEL pour les graines raffinées générés à l'étape 4.3.
- Utilisez une assez grande limite de l'angle vecteur vue. Par exemple, si les semences ont été générées toutes les 20 degrés (étape 4.1), utiliser un angle légèrement plus grand que la moitié de cette valeur (paramètre "--thetaphilimit 12"). Autoriser les changements appropriés dans l'angle autour du vecteur de vue de pointe.
- Permettre aux graines pour décaler dans le plan de la membrane (paramètre"--xyshiftlimit"). Par exemple, si la distance entre les graines et semences est de 25 pixels, utilisez changement total un peu plus de la moitié (par exemple, les paramètres "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
NOTE: Plus d'équipes de traduction peuvent être nécessaires si les fichiers de carte générée à l'étape 3.5 sont centrés à une distance différente du centre de virion que les graines. - Les deux fichiers de carte générée à l'étape 3.5 (désigné par tags "même" et "bizarre" dans le nom du fichier) que les fichiers de modèle d'entrée (paramètres "--Template1" et --Template2).
- Utilisez la résolution actuelle des fichiers de carte générée à l'étape 3.5 (paramètre --resolution).
- Exécutez 5-10 itérations de template matching, l'alignement et la moyenne (par exemple, les paramètres "--firstiter 1 --lastiter 10"). Surveiller les changements de la résolution rapporté. En l'absence de changements significatifs sont observés, le processus peut être arrêté.
- Après chaque itération, Exclure les hits qui se chevauchent. Par exemple, si la largeur de la pointe est de 30 pixels, d'exclure les hits qui sont plus proches de 30 pixels à d'autres résultats (paramètre "--mindist 30").
- Exclure les hits avec une faible corrélation croisée co-efficace. Par exemple, inclure les meilleurs 75% des pics pour chaque virion (paramètre "--topp 75").
NOTE: Hits avec une faible corrélation croisée coefficient sont susceptibles de représenter des résultats faussement positifs.
6 Visualisation des résultats
- Ouvrez la structure raffinée de la flambée des chimères pour la visualisation et le montage de structures atomiques.
- Utilisez le fichier MAP filtré passe-bas (noté par tag "lp") créé dans la dernière itération à l'étape 5.1.6 que le fichier d'entrée.
- Utilisez la résolution indiqué à l'étape 5.1.6 pour le cross-corrélation montage en chimère base "Monter en carte" outil.
- Créer un modèle composite de la VIRIOn en utilisant jsubtomo_create_model.py.
- Utilisez le fichier MAP filtré passe-bas (noté par tag "lp") créé dans la dernière itération à l'étape 5.1.6 que le fichier d'entrée de MAP pour (paramètre "--template").
- Utilisez un fichier de STAR généré dans la dernière itération à l'étape 5.1.6 que le fichier d'entrée STAR.
- Utilisez le fichier de masque généré à l'étape 3.2.1 pour tenir compte des densités qui se chevauchent dans le modèle composite (paramètre "--mask").
- Indiquer la taille du fichier virion MAP pour produire un modèle composite de la même taille (paramètre "--size").
- Ouvrir le modèle composite pour la visualisation dans la chimère.
Representative Results
Nous démontrons l'application de la moyenne flux de travail sous-tomographie décrit ci-dessus pour le complexe de la glycoprotéine d'enveloppe du virus Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) en utilisant un ensemble de données publiées antérieurement mis 24. paramètres de collecte de données et le raffinement sont listés dans le Tableau 1. Une tomographie représentatif est montré à la figure 2.
| Paramètre (unité) | Valeur |
| La collecte des données | |
| Tension (kV) | 300 |
| Grossissement calibré (X) | 111000 |
| La taille du pixel (A) | 5.4 |
| Dose estimée (e - / Å 2) | 100 |
| Underfocus (pm) | 4,0-4,5 |
| Zéro FCE (A) une | 26-30 |
| Plage d'inclinaison (°) | -60 À 60 |
| Tilt échantillonnage (°) | 3 |
| Données et raffinement | |
| Tomographies | 11 |
| Virions | 29 |
| Graines par virion | 106 |
| Nombre total de graines | 3074 |
| Spikes détectés | 1346 |
| Spikes après de supprimer les chevauchements | 1401 |
| Spikes après sélection sur la base de corrélation croisée | 1022 |
| Spikes inclus dans la moyenne finale | 1022 |
| Symétrie | C3 |
| Échantillonnage angulaire (°) | 8 |
| Résolutiongamme utilisée dans le raffinement (Å) | 42-334 |
| Résolution estimation finale (A) b | 35 |
Tableau 1: la collecte des données et statistiques Bunyamwera de raffinement.
un FCT, la fonction de transfert de contraste.
b Calculé à l'aide de Fourier coque corrélation entre deux structures indépendamment raffinés au seuil de 0,143.
Figure 2:. Slice par une tomographie de virions Bunyamwera Plusieurs vues de côté pic évident dans la périphérie de chaque virion sont indiqués par des flèches. La tomographie a été filtré passe-bas à 60 Å. Barre d'échelle de 100 nm.
Tout d'abord, nous avons affiné un modèle initial en utilisant 205 pointes, récolté manuellement (
Figure 3: Le raffinement de la structure de la matrice initiale. (A) cylindrique en moyenne (C100) modèle construit à partir des positions définies manuellement de pointes. (B) En moyenne densité après cinq tours de raffinement sans symétrie (C1) a imposé affiche une hausse de trois foiscaractéristiques symétriques. La résolution du modèle est de 48 Å. (C) moyenne de la pointe a été résolu à 41 Å après cinq tours de raffinement avec triple symétrie.
Figure 4:. Raffinement des graines AB) Un sous-ensemble de graines avant (A) et après (B) raffinement sont présentés sur une densite de virion de la figure 2 Graines à (B) ont été codés par couleur en fonction de la transversale respective. coefficients de corrélation (bleu, faible corrélation, le rouge, haute corrélation).
Les meilleurs corrélation glycoprotéine correctifs de pointes (top 75% après la suppression des chevauchements; ~ 1000 pointes) ont été utilisés pour calculer la moyenne finale. La moyenne a été résolu à 35 Å de résolution (Figure 5). Il a révélé une structure de pointe trimérique dans le milieu, enOutre une contribution de six crampons voisins. Modèles composites des virions, calculés en plaçant la structure en des positions connues, ont révélé placement des pointes sur la surface du virion (Figure 6A). De temps en temps, des taches commandés localement des pointes étaient évidents (figure 6B).
Figure 5: Structure raffinée d'un patch de la couche de pointes de glycoprotéines après template matching. (AB) Deux cartes «même» et «bizarre», reconstruites à partir de deux moitiés des données sont présentées. Les deux cartes montrent un degré remarquable de similitude, la vérification de l'valable jusqu'au de l'approche. L'orientation autour de l'axe de temps est différente de la pointe que les deux cartes ont été reconstruits entièrement indépendamment l'un de l'autre. (C) moyenne des deux cartes est indiqué enla résolution finale de 35 Å.
Figure 6: Placement des pointes sur le virion Bunyamwera. (A) du modèle composite d'un virion. Voir vecteurs (bâtons) indiquent les orientations des pointes. Les couleurs indiquent la corrélation entre chaque pic et la structure du modèle (bleu, une faible corrélation, le rouge, forte corrélation). (B) Un gros plan d'une pièce ordonnée de pointes.
Discussion
Connaissance de la structure virale de pointes de glycoprotéines de la membrane du virion est essentielle pour comprendre la réplication du virus et le développement de thérapies pour traiter et prévenir l'infection. Cryo-microscopie électronique combinée avec une moyenne de particule est apparue comme la méthode la plus utilisée pour résoudre les structures de particules virales enveloppées, y compris les pointes de glycoprotéines. Cependant, cette méthode est limitée aux virus icosahedrally symétriques. Ici, grâce à l'application de cryo-tomographie et subtomogram moyenne dans Jsubtomo, nous avons défini un protocole général pour la détermination de pointes de glycoprotéines sur pléomorphique virus enveloppés qui ne se prêtent pas à d'autres méthodes structurelles en cours de biologie. Nos résultats représentatifs montrent que la résolution de cette méthode est suffisante pour révéler un aperçu de l'architecture de domaine, oligomérisation, et plus l'organisation de l'ordre de pointes de glycoprotéines sur des virions intacts.
jove_content "> L'étape la plus critique dans le protocole construit deux modèles de départ fiables qui sont statistiquement indépendantes l'une de l'autre. exécution réussie de cette étape suppose que les pointes de glycoprotéine sont suffisamment importants et non emballés contre l'autre trop serré, de sorte que les pics individuels peuvent visuellement reconnus et repris manuellement dans le tomographies, et deux modèles indépendants moyenne. Si cela n'est pas possible, deux modifications du protocole peuvent être tentées. Tout d'abord, deux modèles aléatoires indépendantes peuvent être construits en définissant d'abord deux sous-ensembles aléatoires de subtomograms puis la moyenne des subtomograms 30 à l'intérieur de ces sous-ensembles. D'autre part, si la structure de la pointe isolée a été extraite par d'autres moyens, par exemple par cristallographie aux rayons X, il peut être utilisé en tant que modèle de départ. Cependant, il faut veiller à faible ou filtre passe-bas ce modèle en utilisant un seuil de faible résolution (50-70 Å), que les deux modèles qui en résultent dans la prochaine ronde de raffinement serastatistiquement indépendantes qu'au-delà de cette résolution. En raison de cette mise en garde, la première approche est recommandée.La résolution obtenue à partir de ce protocole dépend de quatre facteurs principaux: i. stratégie de collecte de données et de la qualité des données d'entrée, ii. nombre des subtomograms, iii. la précision de l'alignement des subtomograms, et iv. hétérogénéité des structures. Alors que la première et deuxième limitation peut être en grande partie résolu par l'aide de détecteurs de haute signal-bruit directs électroniques combinés avec la FCE corrigé la tomographie et la collecte de données automatisée, la précision de l'alignement est en outre affectée par la taille et la forme de la structure d'intérêt lui-même. Lors de l'application de ce protocole sur les petites pointes qui n'ont pas traits saillants, il peut être avantageux de lier des fragments Fab à la pointe pour améliorer la précision d'alignement et donc la résolution 31. Enfin, si les structures de calcul de la moyenne présentent des conformations multiples, sous-tomogrh méthodes de classification peuvent être utilisés pour différentes conformations moyenne séparément. À cette fin, Jsubtomo s'intègre avec le paquet Dynamo, offrant classification de subtomogram puissant 9.
Le protocole ci-dessus est complémentaire de la cristallographie aux rayons X des glycoprotéines virales isolées. Structures cristallographiques peuvent être montés dans des moyennes de sous-tomogramme d'obtenir l'orientation précise de la glycoprotéine par rapport à la membrane du virion. L'application de cette méthode sera sans aucun doute continuer à faire la lumière sur la structure du virus enveloppés et physiopathologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).
