Abstract
Kappekledde virus utnytte membran glykoproteiner på overflaten å megle innreise til vertsceller. Tredimensjonal strukturell analyse av disse glykoprotein "pigger" er ofte teknisk utfordrende, men viktig for å forstå viral patogenese og i drug design. Her er en protokoll som presenteres for virale spike strukturbestemmelse gjennom beregnings snitt av elektron kryo-tomografi data. Electron cryo-tomografi er en teknikk i elektronmikroskopi brukes til å utlede tredimensjonale tomografiske volum rekonstruksjoner, eller tomograms, av pleomorphic biologiske prøver som membran virus i en tilnærmet opprinnelig, frossen-hydrert tilstand. Disse tomograms avdekke strukturer av interesse i tre dimensjoner, om enn på lav oppløsning. Beregnings midling av sub-volumer, eller under tomograms, er nødvendig for å oppnå høyere oppløsning detalj av gjentagende strukturelle motiver, slik som viral glykoprotein pigger. En detaljert beregnings tilnærming for aligning og snitt under tomograms bruker Jsubtomo programvarepakke er skissert. Denne tilnærmingen muliggjør visualisering av strukturen av viral glykoprotein pigger til en oppløsning i størrelsesorden 20-40 Å, og studiet av studiet av høyere ordens topp-til-topp vekselvirkninger på virusmembranen. Typiske resultater presenteres for Bunyamwera virus, en kappekledte viruset fra familien Bunyaviridae. Denne familien er et strukturelt sammensatt gruppe av patogener som truer menneskers og dyrs helse.
Introduction
Elektron kryo-tomografi er et elektron-mikroskopi kryo avbildningsteknikk som tillater beregning av en tre-dimensjonal (3D) rekonstruksjon av komplekse biologiske prøver. Egnede prøver spenner fra rene makromolekylære komplekser 1, filamenter 2, belagt vesikler 3 og pleomorphic membran virus fire til hele prokaryote celler 5 og selv tynne områder av hele eukaryote celler seks. Etter datainnsamlingen av en tilt-serien, 3D tomografiske volumer, eller tomograms, kan beregnes ved hjelp av flere etablerte programvarepakker, inkludert Bsoft 7 og imod åtte.
To aspekter forbundet med den for undersøkelse av biologiske prøver ved elektron kryo-tomografi grense den biologiske tolkning av de tilsvarende tomografiske volumer. Først, på grunn av den begrensede elektron dose som kan anvendes på biologiske materialer før innføring betydelig stråleskader, signal-til-støy-forhold i tomografiske data er vanligvis meget lav. For det andre, som et resultat av begrenset prøve tilt geometri under datainnsamlingen, noen utsikt av objektet være fraværende, noe som fører til en såkalt "missing kilen artefakt på tomografisk volum. Imidlertid kan begge disse begrensninger kan overvinnes hvis tomografisk volumet inneholder gjentatte, identiske strukturer, slik som makromolekylære komplekser, som kan være vellykket i gjennomsnitt 9-12.
Før gjennomsnitt strukturer fra tomogram rekonstruksjoner, må gjenstander av interesse bli funnet og justert til samme retning. Lokalisering av sådanne strukturer kan oppnås ved kryss-korrelasjon av en mal struktur i tomografisk volum ved bruk av en tilnærming ofte referert til som sjablon som passer 13. Malen som brukes i denne matchende prosessen kan være avledet fra elektronmikroskopi eller cryo-elektron kryo-tomografi i kombinasjon med 3D-rekonstruksjon, eller det kan være en tetthet fra kart simulertet atom-strukturen. Flere beregnings pakker har blitt utviklet for å utføre disse oppgavene 11.
Midling av glykoprotein pigger av membran virus, slik som HIV-1, har vært spesielt vellykket tilnærming for å studere deres struktur 14-16. En forståelse av strukturen er integrert for å avsløre både det molekylære grunnlaget for virus-vert interaksjoner og guiding viral og vaksine designutvikling. Mens makromolekylær krystallografi er teknikken med valg for høy oppløsning (vanligvis bedre enn 4 a) strukturanalyse av individuelle virale glykoproteiner og deres komplekser, røntgenstrukturer som følge av denne fremgangsmåte er av proteiner isolert fra det naturlige miljø membranøs på virus . Således viktige detaljer som høyere ordens arkitektur av virale glykoproteiner, i sammenheng med den virion, forblir mangler. På den annen side, kryo-elektronmikroskopi og enkelt partikkel rekonstruksjonav hele kappekledde virus er begrenset til virioner med icosahedral symmetri 17,18. Electron cryotomography kombinert med sub-volum justering har dermed dukket opp som en komplementær teknikk slik at studiet av glykoprotein pigger av uvanlig fasong, pleomorphic virus i situ.
Vi har utviklet programvare kalt Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) for deteksjon, justering og gjennomsnitt av tomografiske under volumer. Jsubtomo har blitt benyttet i strukturbestemmelse av et antall cellulære og virale strukturer 19-26. Her skisserer vi en detaljert protokoll som muliggjør fastsettelse viral-overflate pigg strukturer. For å omgå over-foredling av gjennomsnitts strukturer ved å korrelere støy, er "gull-standard" raffinement ordningen vedtatt 10,27. Endelig er strategier for visualisering og tolkning av typiske resultater diskutert.
Protocol
En detaljert protokoll for beregnings justering og påfølgende gjennomsnitt av virale glykoprotein spikes er skissert. Protokollen følger arbeidsflyten vist i figur 1, og kombinerer en automatisert søk etter piggene ved hjelp av innledende mal strukturer og en gull-standarden struktur raffinement.
Inngangsdata for denne protokollen er et sett av tomografiske rekonstruksjoner av de virioner. En tomogram inneholder en eller flere virioner. I utgangspunktet er en liten undergruppe av pigger manuelt valgt og brukt til gjennomsnitt og avgrense to uavhengige modeller. Disse modellene brukes til å automatisk finne pigger på alle virioner. Endelig er to uavhengige forbedringer drevet og de resulterende gjennomsnitt sammenlignes og kombineres for å frembringe den endelige struktur.
Avgrensningen tilnærmingen er demonstrert ved hjelp av programmer fra Jsubtomo pakken. Programmer fra Bsoft pakke 28 brukes til generell bilde processing oppgaver og molekylær grafikk pakke UCSF Chimera 29 brukes til å visualisere resultater. Navnene på de enkelte programmene er gitt i kursiv og filformater er merket med store filendelser.
Figur 1:.. Generell strategi for å bestemme strukturer av glykoprotein pigg komplekser fra pleomorphic membran virus Tallene tilsvarer ulike seksjoner i protokollen Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1. Trekke Virus Under volumer fra Full-size Tomograms
- Plukk viruspartikler manuelt i tomograms.
- Åpne en tomogram fil i bshow. Definere midt koordinere av et virus particle ved hjelp av partikkel-plukking verktøyet. Gjenta dette trinnet til alle virions har blitt behandlet. Lagre virus koordinater i en STAR fil.
- Gjenta trinn 1.1.1 til alle tomograms har blitt behandlet. Noter diameter virus i piksler.
MERK: Hvis piggene er vanskelig å se i tomograms, bruker bfilter til low-pass filtrere tomograms til 80-en resolusjon (parameter "-bandpass 80,10000").
- Kjør jsubtomo.py i ekstrakt modus (parameteren "--mode ekstrakt") til å trekke virion under volumer til individuelle volum filer. Bruk STAR filer lagret i trinn 1.1.1 som input filer.
- Gi en størrelse (parameter "--size") ~ 25% større enn den største virion i datasettet. F.eks, hvis virion er ~ 200 piksler i diameter, bruker størrelse 250 x 250 x 250 piksler.
- Utdatafiler av virionet volumene vil være i MAP-format. I tillegg oppretter en medfølgende STAR-fil for hver virion volum (Parameter "Output").
- Normal virion volumer i bimg (parameter "-rescale 0,1").
2. Generering av to uavhengige første modellene
- Plukk en undergruppe av toppene i virionet under volumer.
- Åpne en virion sub-volum MAP fil i bshow. Definere midt koordinere av en pigg ved hjelp av partikkel-plukking verktøy, tilgjengelig via verktøykassa. Gjenta dette trinnet til alle klart distinkte pigger har blitt behandlet. Lagre spike koordinater i en STAR fil.
- Gjenta om nødvendig trinn 2.1.1 for andre virioner inntil ca 200 glykoprotein pigger har blitt behandlet. Note pigg dimensjoner i piksler.
MERK: ~ 200 pigger er en grov rettesnor, og mer kan være nødvendig for enkelte programmer. Hvis det er mulig, tar sikte på å plukke toppene i forskjellige retninger. Unngå å plukke bare topp utsikt.
- Tilordne en første visningen vektor til toppene ved å kjøre jviews.py. Bruk STAR filer generert i trinn 2.1.1 som input filer.
MERK: Dette synet vektor tilnærmet retning av spike med referanse til virionet.- Bruk den sentrale koordinere å tildele visninger for en sfærisk virion. For eksempel, hvis den virion er sentrert (etter trinn 1.2) i en boks med en størrelse på 250 x 250 x 250 piksler, den sentrale koordinat er 125 125 125 piksler (alternativet "--Radial 125 125 125").
- Slik tilordner du utsikt for en trådformede virus, med åpne hver virion sub-volum i bshow ved hjelp av STAR fil definert i trinn 2.1.1 som inngangs fil. Definer de to endepunktene på filament bruker filament plukking verktøyet og lagre STAR fil. Gjenta dette trinnet til alle STAR filer har blitt oppdatert og kjøre jviews.py å bruke de oppdaterte STAR filer som input filer (--option Segment).
- Generere en reell plass maske ved hjelp jsubtomo_create_mask.py. Pass på at den virkelige plass masken er av de samme DIMENSioner som vil bli benyttet for den gjennomsnittlige struktur (se 2.6.2) og er stor nok til å inneholde både pigg og en oppdatering av den underliggende membran.
- Generere en gjensidig plass maske ved hjelp jsubtomo_create_wedgemask.py. Den gjensidige mellomrom masken blir brukt til å utelukke regioner i 'mangler kilen' region som følge enkelt akse tomografisk datainnsamling. Påse at det er av samme dimensjoner som vil bli brukt for den gjennomsnittlige struktur (se 2.6.2).
- Generere et utvalg fil (SEL-fil) som definerer virionene tilhører sett "1" og "2" ved hjelp jsubtomo_evenodd.py og Star filer generert i trinn 2.2.
- Generere to innledende gjennomsnitt bruker jsubtomo_create_averages.py.
- Bruk SEL fil generert i trinn 2.5 som inngangs fil.
- Gi en størrelse (parameter "--size") minst 32 piksler større enn den største dimensjonen av pigg. Eg, hvis spike er ~ 40 piksler lang, bruker størrelse 72 x 72 x 72 piksler.
- Påfør en høy symmetri (f.eks c100) på gjennomsnitt (parameter "--symmetry c100"), for å tilnærme en sylindrisk gjennomsnitt rundt den lange aksen av piggen. Bruk symmetrization å redusere støy i de innledende gjennomsnitt.
- Gi et unikt navn for utdatafiler av prosjektet (parameter "suffix").
- Bruk den virkelige plass maske generert i trinn 2.3 til å maskere bort bakgrunnen (parameter "--mask"). Bruk gjensidige mellomrom maske generert i trinn 2.4 å ta hensyn til tap av signal introdusert ved tilstedeværelse av en manglende kile (parameter "--Mask").
3. Gold-standard iterativ Alignment og Averaging av de to første Spike modellene
Iterativt justere og snitt de to første modellene generert i § 2 med jsubtomo_iterate_gold.py.
- Stage I. Målet med denne fasen er å avgrenseretning av den oppfatning vektor. Inndatafilen er SEL fil generert i trinn 2.5.
- Bruk en 8-graders vinkel prøvetaking (parameter "--angles 8,8,8").
- Tillat 16-graders endring i retning av piggen vis vektor (parameter "--thetaphilimit 16"), men holde vinkelen rundt piggen lang akse fast (parameter "--alphalimit 0").
- Tillate små translasjonsforskning skift (f.eks 5 piksler) for å redegjøre for unøyaktigheter i manuell plukking av toppene (parameter "--shiftlimit 5").
- Påfør en høy symmetri (f.eks c100) på gjennomsnitt (parameter "--symmetry c100"), for å tilnærme en sylindrisk gjennomsnitt rundt den lange aksen av piggen.
MERK: Symmetrization brukes til å redusere støy i gjennomsnitt. - Bruk den virkelige plass maske og den gjensidige plass maske generert i trinn 2.3 og 2.4 for å maskere bort omkringliggende toppene og står for den manglende kile (parametre "--mspør "og" --Mask ", henholdsvis).
- Bruk de to MAP filer generert 2.6 (angitt av tags "selv" og "rart" i filnavnet) som maler (parametre "--Template1" og "--Template2", henholdsvis).
- Påfør et lavpassfilter ved 50-en oppløsning (parameter "--resolution") for å hindre justering bias.
- Påfør en bin faktor på 2 for å fremskynde raffinement (parameter "--bin 2").
- Kjør fem gjentakelser av justering og snitt (parametre "--firstiter en --lastiter 5").
- Stage II. Målet med denne fasen er å avgrense vinkel rundt visningen vektor. Inndatafilen er utgangs SEL-filen fra trinn 3.1.9.
- Mål nøyaktige målene på pigg ved å åpne lavpassfiltrert MAP fil generert i den siste iterasjon i trinn 3.1.9 (merket med tag "_lp" i filnavnet) i bshow. Generere et nytt sannplass maske på samme måte til trinn 2.3 som definerer pigg men utelukker de fleste av membranen og nærliggende toppene.
NB: Den optimale størrelsen av masken er avhengig av størrelsen og trekk ved pigg. - Bruk 8-graders vinkel prøvetaking (parameter "--angles 8,8,8") som før.
- Tillat 180-graders endringer i vinkelen om pigg utsikt vektor (parameteren "- alphalimit 180"), men holde theta og Phi vinkler fast (parameter "--thetaphilimit 0").
- Ikke la noen translasjonsforskning skift (parameter "--shiftlimit 0").
- Ikke bruk noen symmetri på gjennomsnitt (utelate parameter "--symmetry").
- Bruk den gjensidige plass maske generert i trinn 2.4 til å gjøre rede for den savnede kile.
- Bruk de to kartfiler som genereres i siste iterasjon av trinn 3.1.9 uten symmetri (angitt av tags "even_nosym" og "odd_nosym" i filnavnet) som maler (parametere R20; - Template1 "og" --Template2 ", henholdsvis).
- Påfør et lavpassfilter ved 50-en oppløsning (parameter "--resolution") i første iterasjon for å hindre justering bias. Juster filterparametrene i de etterfølgende iterasjoner automatisk (parameter "--adaptivefilter") basert på gull-standard Fourier Shell korrelasjon (FSC) mellom de to uavhengige gjennomsnitt. Bruk 0.143-kriteriet (parameter "--fsccrit 0.143"). Ikke la raffinement forbi den første null av kontrastoverføringsfunksjonen (CTF) (parameter "--minhires"), med mindre CTF korreksjon har blitt brukt til tomograms.
- Kjør 5-10 gjentakelser av justering og snitt (f.eks parametre "--firstiter 6 --lastiter 15"). Overvåke endringer i rapporterte oppløsning. Når ingen vesentlige endringer er observert, kan prosessen stoppes.
- Mål nøyaktige målene på pigg ved å åpne lavpassfiltrert MAP fil generert i den siste iterasjon i trinn 3.1.9 (merket med tag "_lp" i filnavnet) i bshow. Generere et nytt sannplass maske på samme måte til trinn 2.3 som definerer pigg men utelukker de fleste av membranen og nærliggende toppene.
- Vurdere graden av symmetrien i strukturen ved examining den resulterende lavpassfiltrert MAP filen (merket med tag "_lp" i filnavnet) i chimera. Eg, hvis spike er en trimeric kompleks, bør 3-lags symmetri være tydelig.
- Stage III. Målet med denne fasen er å avgrense vinkel rundt visningen vektor videre med riktig symmetri. Inndatafilen er utgangs SEL-filen fra trinn 3.2.9. Parametrene er de samme som i trinn 3.2 med noen få unntak:
- Tillat egnede endringer i vinkel rundt piggen vis vektor. For eksempel, hvis konstruksjonen har tre gangers symmetri, tillater endring av 60 grader i vinkel alfa (parameter "--alphalimit 60").
- Påfør riktig symmetri (f.eks c3) på gjennomsnitt (parameter --symmetry c3 ").
- Bruk de to kartfiler som genereres i siste iterasjon i trinn 3.2.9 (angitt av tags "selv" og "rart" i filnavnet) som input malfiler (parametre "--Template1" og --Template2).
- Kjør 5-10 gjentakelser av justering og snitt (f.eks parametre "--firstiter 16 --lastiter 25"). Overvåke endringer i rapporterte oppløsning. Når ingen vesentlige endringer er observert, kan prosessen stoppes.
- Stage IV. Målet med denne fasen er å nøyaktig avgrense alle tre vinkler samtidig. Inndatafilen er utgangs SEL-filen fra trinn 3.4.4. Parametrene er de samme som i trinn 3.4 med noen få unntak:
- Tillat 8-graders endring i vinkelen rundt piggen vis vektor (parameter "- alphalimit 8"), og 8-graders endring i retning av piggen vis vektor (parameter "--thetaphilimit 8"). Avgrense orienteringer til 4-graders nøyaktighet (parametre "--angles 8,8,8 --iterate 2").
- Tillate små skift (f.eks 5 piksler) for å redegjøre for unøyaktigheter i tidligere trinnene for innretning (parameter "--shiftlimit 5").
- USE de to kart filer generert i den siste iterasjon i trinn 3.4.4 (angitt av tags "selv" og "rart" i filnavnet) som input malfiler (parametre "--Template1" og --Template2).
- Kjør 5-10 gjentakelser av justering og snitt (f.eks parametre "--firstiter 26 --lastiter 35"). Overvåke endringer i rapporterte oppløsning. Når ingen vesentlige endringer er observert, kan prosessen stoppes.
4. generasjon og oppretting av frø til Virus overflate for Mal Matching
- Generere frø ligger jevnt på virusoverflaten for mal matching og tilordne en første visningen vektor til frøene ved å kjøre jviews.py. Bruk STAR filer generert i trinn 1.2.2 som input filer. Generere ca 1,5 ganger mer frø enn forventet antall pigger.
MERK: Dette synet vektor tilnærmet retning av spike nærmest hvert frø punkt.- For å generere jevnt fordelt frø på en omtrent sfærisk virion (parameter "--Even"), gi radius (parameter "--radius"), kantete separasjon (f.eks, 20 grader) av frøene (parameter "--angle 20" ) og den sentrale koordinere av virionet. Eg, hvis virionet er sentrert (etter trinn 1.2) i en boks med en størrelse på 250 x 250 x 250 piksler, den sentrale koordinere er 125.125.125 piksler (alternativet "--origin 125125125") .
- For å generere jevnt fordelt frø på en trådformede partikkel, bruke parameteren "--Filament" og oppgi både radius og spiralformede symmetri parametere (økning og vri).
MERK: Den spiralformede symmetri parametrene er her bare brukes som en praktisk måte å definere jevnt fordelt frø posisjoner, og de trenger ikke å gjenspeile den faktiske bestilling av piggene på filament.
- Generere to uavhengige gjennomsnitt av viruset overflaten som explained i § 2.
- Generere en SEL fil definere virionene tilhører sett "1" og "2" ved hjelp jsubtomo_evenodd.py og Star filer generert i trinn 4.1.
MERK: For å sikre uavhengighet datasett, eventuelt tidligere tildeling av virioner i grupper "1" og "2" må være den samme.
- Generere en SEL fil definere virionene tilhører sett "1" og "2" ved hjelp jsubtomo_evenodd.py og Star filer generert i trinn 4.1.
- Finjuster plasseringen av frøene.
- Følg instruksjonene i trinn 3.1 med mindre annet er oppgitt. Bruk SEL fil generert i trinn 4.2.1 som inngangs fil.
- Tillate frøene å skifte bare langs normalen til membranen (parameter "--zshiftlimit"). Juster tillatt mengde skift avhengig av hvor mye de virionene avvike fra ideelt sfærisk geometri (f.eks parameter --zshiftlimit 25 ").
- Bruk de to MAP filer generert i trinn 4.2 (angitt av tags "selv" og "rart" i filnavnet) som input template filer (parametre "--TemPlate1 "og --Template2).
- Bruk en unik endelse for å unngå å overskrive de opprinnelige inngangs STAR-filer (for eksempel parameter "suffix _seeds").
- Bruk binning av fire å fremskynde beregning (parameter "--bin 4") og en low-pass filter (f.eks parameter "--resolution 50").
- Generere Chimera markør filer (CMM) av de raffinerte frø STAR filer ved hjelp jviews.py (parameter "--cmm"). Undersøke frøene ved å åpne CMM filer (og de tilhørende virion kartfiler) i chimera. Kontroller at raffinerte frø er riktig justert i forhold til viruset membran.
MERK: Ulike farger kan brukes til å skille separate sett av markører (parameter "--color"). Alternativt de raffinerte markører kan være farget basert på sitt kors korrelasjonskoeffisient (f.eks parameter "--fomcolor 0.1,0.3").
5. Gold-stativard iterativ Alignment og Averaging av Spike Struktur
Automatisk finne alle toppene i virionet under volumer ved hjelp av lokale mal matching rundt de raffinerte frø og justere og snitt de ligger toppene. Bruk gjennomsnitt generert fra en undergruppe av manuelt plukket pigger som innledende maler.
- Utfør lokal mal matching rundt frøene til gjennomsnittlig alle piggene bruker programmet jsubtomo_iterate_gold.py. Følg instruksjonene i trinn 3.5 med mindre annet er oppgitt.
- Inndatafilen er SEL-fil for de raffinerte frø generert i trinn 4.3.
- Bruk en tilstrekkelig stor grense for visning vektorvinkelen. Eg, hvis frø ble generert hver 20 grader (trinn 4.1), bruk en vinkel litt større enn halvparten av denne verdien (parameter "--thetaphilimit 12"). Tillat egnede endringer i vinkel rundt piggen vis vektor.
- Tillate frøene å skifte i planet til membranen (parameter"--xyshiftlimit"). Eg, hvis frø-til-frø avstanden er 25 piksler, bruker total shift litt mer enn halvparten av dette (f.eks parametre "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
MERK: Ytterligere translasjonsforskning skift kan være nødvendig hvis kartet filer generert i trinn 3.5 er sentrert på en annen avstand fra virion sentrum enn frøene. - Bruk de to MAP filer generert i trinn 3.5 (angitt av tags "selv" og "rart" i filnavnet) som input malfiler (parametre "--Template1" og --Template2).
- Bruk gjeldende oppløsning av kartet filer generert i trinn 3.5 (parameter --resolution).
- Kjør 5-10 gjentakelser av mal matching, justering og gjennomsnitt (f.eks parametre "--firstiter en --lastiter 10"). Overvåke endringer i rapporterte oppløsning. Når ingen vesentlige endringer er observert, kan prosessen stoppes.
- Etter hver iterasjonUtelukke overlappende treff. Eg, hvis bredden på spike er 30 piksler, ikke hits som er nærmere enn 30 piksler til andre treff (parameter "--mindist 30").
- Ekskluder treff med et lavt innlegg korrelasjon co-effektiv. For eksempel, inkluderer de beste 75% pigger for hver virus (parameter "--topp 75").
MERK: treff med et lavt innlegg korrelasjon co-effektiv er sannsynlig å representere falske positive treff.
6. Visualisering av resultatene
- Åpne den raffinerte strukturen i topp i chimera for visualisering og montering av atomstrukturer.
- Bruk lavpassfiltrert MAP filen (merket med tag "lp") opprettet i den endelige iterasjon i trinn 5.1.6 som inngangs fil.
- Bruk oppløsningen angitt i trinn 5.1.6 for kryss-korrelasjon basert montering i chimera "Fit in Map" verktøyet.
- Lage en sammensatt modell av virion bruker jsubtomo_create_model.py.
- Bruk lavpassfiltrert MAP filen (merket med tag "lp") opprettet i den endelige iterasjon i trinn 5.1.6 som inngangs MAP filen til (parameter "--Template").
- Bruk en STAR fil generert i den endelige iterasjon i trinn 5.1.6 som inngangs STAR fil.
- Bruk maske fil generert i trinn 3.2.1 å gjøre rede for overlappende tettheter i den sammensatte modellen (parameter "--mask").
- Indiker størrelsen av virion MAP-filen for å generere et sammensatt modell av samme størrelse (parameter "--size").
- Åpne kompositt modell for visualisering i chimera.
Representative Results
Vi demonstrerer anvendelsen av sub-tomogram snitt arbeidsflyten beskrevet ovenfor for konvolutten glykoprotein kompleks av Bunyamwera virus (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) ved hjelp av en tidligere publiserte data satt 24. Innhenting og utvikling av data parametere er oppført i Tabell 1. En representant tomogram er vist i figur 2.
| Parameter (enhet) | Verdi |
| Datainnsamling | |
| Spenning (kV) | 300 |
| Kalibrert forstørrelse (X) | 111,000 |
| Pikselstørrelse (Å) | 5.4 |
| Beregnet dose (e - / A 2) | 100 |
| Underfocus (mikrometer) | 4,0 til 4,5 |
| Først CTF null (A) En | 26-30 |
| Vippområde (°) | -60 Til 60 |
| Tilt sampling (°) | 3 |
| Data og raffinement | |
| Tomograms | 11 |
| Virioner | 29 |
| Frø per virus | 106 |
| Totalt antall frø | 3074 |
| Spikes oppdaget | 1346 |
| Spikes etter fjerning overlappinger | 1401 |
| Spikes etter kryss-korrelasjon basert utvalg | 1022 |
| Spikes inkludert i den endelige gjennomsnittet | 1022 |
| Symmetri | C3 |
| Vinkel prøvetaking (°) | 8 |
| Oppløsningområdet som brukes i avgrensningen (Å) | 42-334 |
| Endelig vedtak estimat (a) b | 35 |
Tabell 1: Bunyamwera datainnsamling og raffinement statistikk.
en CTF, kontrast overføringsfunksjon.
b Beregnet ved hjelp av Fourier shell korrelasjon mellom to uavhengig raffinerte strukturer på en terskel på 0.143.
Figur 2:. Slice gjennom en tomogram av Bunyamwera virions Flere spike sidevisninger tydelig i periferien av hver virus, er angitt med pilspisser. Den tomogram har vært lav-pass-filtrerte til 60 Å. Scale bar 100 nm.
Først må vi videreutviklet en første modell med 205 manuelt plukket spikes (
Figur 3: Videreutvikling av den første mal struktur. (A) cylindrically gjennomsnitt (C100) mal konstruert fra manuelt definerte posisjoner av toppene. (B) i gjennomsnitt tetthet etter fem runder med raffinement uten symmetri (C1) pålagt viser en topp med tre-foldsymmetriske funksjoner. Oppløsningen i modellen er 48 A. (C) Gjennomsnitt av piggen ble vedtatt på 41 A etter fem runder med raffinement med tre-lags symmetri.
Figur 4:. Avgrensning av frøene AB) En undergruppe av frø før (A) og etter (B) raffinement er vist på den ene virion tetthet fra figur 2 Frø i (b) er fargekodet basert på den respektive tverr. korrelasjonskoeffisienter (blå, lav korrelasjon, rød, høy korrelasjon).
De beste korrelere glykoprotein pigg patcher (topp 75% etter fjerning av overlappinger, ~ 1000 pigger) ble brukt til å beregne den endelige gjennomsnittet. Den gjennomsnittlige ble løst til 35-en oppløsning (figur 5). Det avdekket en trimeric pigg struktur i midten, itillegg til noen bidrag fra seks nabo toppene. Kompositt-modeller av virioner, beregnet ved å plassere strukturen i de kjente posisjoner, avslørte plassering av piggene på virusoverflaten (figur 6A). Av og til, lokalt bestilt flekker av toppene var tydelig (figur 6B).
Figur 5: Raffinert strukturen av en lapp av glykoproteinet pigg lag på malen tilpasning. (AB) To maps 'selv' og 'odde', rekonstruert fra to halvdelene av data vises. De to kartene viser en bemerkelsesverdig grad av likhet, verifisere validness av innflygingen. Orienteringen rundt piggen lange aksen er forskjellig når de to baner er blitt rekonstruert fullstendig uavhengig av hverandre. (C) Gjennomsnitt av de to kartene er vist påden endelige løsningen på 35 A.
Figur 6: Plassering av piggene på Bunyamwera virus. (A) sammensatt modell av et virion. Vis vektorer (stokk) indikerer orienteringer av piggene. Fargene indikerer kryss-korrelasjon mellom hver pigg og malen struktur (blå, lav korrelasjon, rød, høy korrelasjon). (B) Et nærbilde av en ordnet lapp av toppene.
Discussion
Kjennskap til viral glykoprotein pigg struktur på virusmembranen er avgjørende for forståelsen av virusreplikasjon, og å utvikle terapeutiske midler for å behandle og forebygge infeksjoner. Elektron kryo-mikroskopi i kombinasjon med enkelt partikkel i snitt har dukket opp som de mest brukt metode for å løse strukturer av omhyllede virus partikler, inkludert glykoproteinet pigger. Imidlertid er denne fremgangsmåte begrenset til icosahedrally symmetriske virus. Her, gjennom anvendelse av elektron cryo-tomografi og subtomogram snitt i Jsubtomo, har vi skissert en generell protokoll for å bestemme glykoprotein spikes på pleomorphic kappekledde virus som ikke er mottagelig for andre aktuelle strukturelle biologiske metoder. Våre representative resultatene viser at oppløsningen på denne metoden er tilstrekkelig til å avsløre innsikt i domene arkitektur, oligomerisering, og høyere orden organisering av glykoprotein pigger på intakte virioner.
jove_content "> Den mest kritiske trinn i denne protokollen er å konstruere to pålitelige utgangsmodeller som er statistisk uavhengige av hverandre. Vellykket utførelse av dette trinn går ut på at glykoprotein pigger er tilstrekkelig stor og ikke pakket mot hverandre for tett, slik at de enkelte pigger kan være visuelt gjenkjent og manuelt tatt i tomograms, og to uavhengige modeller i gjennomsnitt. Hvis dette ikke er mulig, to modifikasjoner av protokollen kan bli forsøkt. første to uavhengige tilfeldige modeller kan konstrueres ved først å definere to tilfeldige undergrupper av subtomograms og deretter ta gjennomsnittet av de subtomograms innenfor disse undergrupper 30. andre, hvis en struktur av den isolerte pigg har blitt utledet på annen måte, for eksempel ved røntgenkrystallografi, kan den brukes som et utgangsmodell. Imidlertid må det utvises forsiktighet for å stillegå- pass filter denne modellen ved hjelp av en lav oppløsning cut-off (50-70 Å), som de to resulterende modeller i neste runde av raffinement vilvære statistisk uavhengige bare utover denne oppløsningen. På grunn av denne forbeholdet, blir den tidligere tilnærming anbefalt.Oppnåelig oppløsning fra denne protokollen avhenger av fire viktige faktorer: i. datainnsamling formasjonen, og kvaliteten av inngangsdata, ii. antall av subtomograms, iii. justeringsnøyaktighet av de subtomograms, og iv. heterogenitet av strukturene. Mens den første og andre begrensninger i stor utstrekning kan overvinnes ved å bruke høye signal-til-støy direkte elektron detektorer kombinert med CTF korrigert tomografi og automatisert innsamling av data, blir justeringsnøyaktighet ytterligere påvirkes av størrelsen og formen på strukturen av interesse i seg selv. Ved anvendelse av denne protokollen på små pigger mangler fremtredende egenskaper, kan det være fordelaktig å binde til Fab fragmenter piggen for å forbedre justeringsnøyaktighet og dermed oppløsning 31. Til slutt, hvis strukturer som skal gjennomsnitt oppviser flere konformasjoner, sub-tomogram klassifiseringsmetoder kan benyttes til gjennomsnittlig forskjellige konformasjoner separat. For å nå dette målet, integrerer Jsubtomo med Dynamo-pakken som gir kraftig subtomogram klassifisering ni.
Den ovennevnte protokoll er komplementær til røntgen-krystallografi av isolerte virale glykoproteiner. Krystallografiske strukturer kan monteres inn i sub-tomogram gjennomsnitt for å oppnå en nøyaktig orientering av glykoproteinet med hensyn til virusmembranen. Anvendelse av denne metodikken vil utvilsomt fortsette å kaste lys på innhyllet virus struktur og patobiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).
