Abstract
Umhüllte Viren nutzen Membranglykoproteine auf ihrer Oberfläche, um den Eintritt in die Wirtszellen zu vermitteln. Dreidimensionale Strukturanalyse dieser Glykoprotein 'Spikes' ist oft technisch anspruchsvoll, aber wichtig für das Verständnis der Pathogenese viraler und Wirkstoffdesign. Hier wird ein Protokoll für die virale Spike Strukturbestimmung durch rechnerische Mittelung der Kryo-Elektronentomographie-Daten dargestellt. Elektronen Kryo-Tomographie ist eine Technik, in der Elektronenmikroskopie verwendet, um dreidimensionale tomographische Rekonstruktionen Volumen oder Schichtaufnahmen, von pleomorphen biologischen Proben wie Viren-Membran in einer nahe der nativen, tiefgefrorenen Zustand abzuleiten. Diese Schnittbilder zeigen Strukturen von Interesse in drei Dimensionen, wenn auch in geringer Auflösung. Computational Mittelung der Teilvolumina, oder Unterschichtaufnahmen, ist notwendig, um eine höhere Auflösung Detail wiederholenden Strukturmotive, wie virale Glykoprotein Spikes erhalten. Eine detaillierte Berechnungsansatz für aligning und Mitteln Teilschnittbildern unter Verwendung des Softwarepakets Jsubtomo skizziert. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung der Struktur des viralen Glykoprotein Spikes mit einer Auflösung im Bereich von 20-40 Å und Studium der Studie höherer Ordnung Spitze-zu-Spitze-Interaktionen auf der Virion Membran. Typische Ergebnisse sind für Bunyamwera-Virus, ein umhülltes Virus aus der Familie Bunyaviridae vorgestellt. Diese Familie ist eine strukturell heterogene Gruppe von Krankheitserregern, die eine Bedrohung für die Gesundheit von Mensch und Tier.
Introduction
Elektronen Kryo-Tomographie ist ein Kryoelektronenmikroskopische Bildgebungsverfahren ermöglicht die Berechnung einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion von komplexen biologischen Proben. Geeignete Proben reichen von gereinigtem makromolekularen Komplexen 1, Fäden 2, Vesikel 3 und 4 pleomorphe Membran Viren, ganze prokaryotischen Zellen 5 und auch dünne Bereiche der gesamten eukaryotischen Zellen 6. Nach der Datensammlung, einer Tilt-Serie, 3D-tomographischen Volumes oder Schichtaufnahmen kann mit mehreren etablierten Software-Pakete, einschließlich bsoft 7 und 8 IMOD berechnet werden.
Zwei Aspekte inhärent auf die Untersuchung von biologischen Proben durch Elektronen Kryo-Tomographie begrenzen die biologische Interpretation der entsprechenden tomographischen Volumen. Erstens, aufgrund der begrenzten Elektronendosis, die biologischen Materialien vor der Einführung signifikanten Strahlenschäden angewendet werden kann, signal-zu-Rausch-Verhältnisse in tomographischen Daten sind typischerweise sehr gering. Zweitens, als Folge der begrenzten Stichprobenneigungsgeometrie während der Datensammlung, einige Ansichten des Objekts bleiben nicht vorhanden, was zu einer so genannten "fehlt Keil" Artefakt in der tomographischen Lautstärke. Allerdings können diese beiden Einschränkungen zu überwinden, wenn die tomographischen Volumen sich wiederholende identische Strukturen, wie beispielsweise makromolekularen Komplexen, die erfolgreich sein können gemittelt 9-12.
Vor der Mittelung Strukturen Tomogramm Rekonstruktionen müssen Objekte von Interesse zu finden und mit der gleichen Orientierung ausgerichtet werden. Anordnen Solche Strukturen können durch Kreuzkorrelation eines Schablonenstruktur in dem tomographischen Volumens mit einem Ansatz oft als Template pass 13 genannten erzielt werden. Das in diesem Vergleichsprozeß verwendete Vorlage aus Kryoelektronenmikroskopische oder Elektronen Kryo-Tomographie in Kombination mit 3D-Rekonstruktion abgeleitet werden, oder es kann ein Dichtekarte von simulierendeneine atomare Struktur. Mehrere Rechenpakete wurden entwickelt, um diese Aufgaben zu erfüllen 11.
Mittelung von Glycoprotein Spikes von Membran Viren, wie HIV-1, war ein besonders erfolgreicher Ansatz für die Untersuchung ihrer Struktur 14-16. Ein Verständnis der Struktur ist integraler für enthüllt sowohl die molekularen Grundlagen der Virus-Wirt-Interaktionen und Führungsantivirale und Impfstoff-Design-Entwicklung. Während makromolekulare Kristallographie ist die Technik der Wahl für hochauflösende (in der Regel besser als 4 Å) Strukturanalyse der einzelnen viralen Glykoproteinen und ihre Komplexe, die Röntgenkristallstrukturen von dieser Methode ergeben, sind von Proteinen aus der natürlichen Umgebung isoliert membranöse auf dem Virion . Somit wichtige Details wie die höherwertigen Architektur viraler Glykoproteine im Kontext des Virions, bleiben fehlen. Auf der anderen Seite, Kryoelektronenmikroskopische und Einzelpartikelrekonstruktionder gesamte umhüllte Viren zu Virionen mit Ikosaedersymmetrie 17,18 beschränkt. Elektronen cryotomography kombiniert mit Teilvolumen Ausrichtung ist damit mehr als eine Ergänzung, die die Untersuchung von Glycoprotein Spikes von unregelmäßig geformten, pleomorphen Viren in situ entstanden.
Wir haben eine Software namens Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) zum Nachweis, Ausrichtung und Mittelung der tomographischen Teilmengen entwickelt. Jsubtomo in der Bestimmung der Struktur einer Reihe von zellulären und viralen Strukturen 19-26 verwendet worden. Hier skizzieren wir ein ausführliches Protokoll, das die Bestimmung des viralen Oberflächenstrukturen Spike ermöglicht. Durch Korrelation Lärm zu über-Verfeinerung der gemittelten Strukturen zu umgehen, wird der "Goldstandard" Verfeinerung Regelung verabschiedet 10,27. Schließlich Strategien zur Visualisierung und Interpretation der typische Ergebnisse werden diskutiert.
Protocol
Ein detailliertes Protokoll für die rechnerische Ausrichtung und anschließende Mittelung der viralen Glykoprotein Spikes skizziert. Das Protokoll folgt dem in Abbildung 1 veranschaulicht Workflow und verbindet eine automatische Suche nach den Spitzen mit Anfangs Vorlage Strukturen und eine Goldstandard-Strukturverfeinerung.
Eingangsdaten für dieses Protokoll ist ein Satz von tomographischen Rekonstruktionen der Virionen. Einem Tomogramm eines oder mehrere Virionen. Zunächst wird eine kleine Teilmenge der Spikes von Hand aufgenommen und verwendet, um zu mitteln und zu verfeinern zwei unabhängige Modelle. Diese Modelle werden verwendet, um automatisch zu lokalisieren Spikes auf allen Virionen. Schließlich werden zwei unabhängige Verfeinerungen führen und die daraus resultierenden Mittelwerte verglichen und kombiniert werden, um die endgültige Struktur zu erzeugen.
Die Verfeinerung Ansatz wird durch die Verwendung von Programmen aus dem Jsubtomo Paket demonstriert. Programme aus dem Paket bsoft 28 sind für allgemeine Bild p verwendetrocessing Aufgaben und molekularen Grafikpaket UCSF Chimera 29 wird verwendet, um Ergebnisse zu visualisieren. Die Namen der einzelnen Programme sind kursiv und Dateiformate gegeben werden mit Großbuchstaben Dateinamen-Erweiterungen bezeichnet.
Abbildung 1:.. Allgemeine Strategie für die Bestimmung von Strukturen Glykoprotein Spike-Komplexe aus pleomorphen Membran Viren Die Zahlen entsprechen den verschiedenen Abschnitten des Protokolls Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
1. Extrahieren Virus Teilmengen von Full-Size-Schnittbilder
- Wählen Sie manuell Viruspartikel in den Schnittbildern.
- Öffnen Sie eine Datei in Tomogramm bShow. Definieren das Zentrum Koordinate eines Virus insbesonle mit der Teilchen-Kommissionierung-Tool. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Virionen verarbeitet worden sind. Virus Speichern Koordinaten in einem STAR-Datei.
- Wiederholen Sie Schritt 1.1.1 bis alle Schnittbilder verarbeitet worden sind. Notieren Sie sich die Virion Durchmesser in Pixel.
HINWEIS: Wenn die Spikes sind schwer in den Schnittbildern zu sehen, verwenden bfilter zu Tiefpass-Filter die Schnittbilder auf 80-Å Auflösung (Parameter "-bandpass 80,10000").
- Führen jsubtomo.py in Abluftbetrieb (Parameter "--mode Extrakt"), um Virion Teilvolumina zu einzelnen Volumen Dateien zu extrahieren. Mit der Stern-Dateien in Schritt 1.1.1 als Eingabe-Dateien gespeichert.
- Geben Sie eine Größe (Parameter "--size") ~ 25% größer als der größte Virus in der Datenmenge. ZB wenn der Virion ist ~ 200 Pixel im Durchmesser, Verwendung Größe 250 x 250 x 250 Pixel.
- Ausgabedateien des Virions Bände werden in MAP-Format sein. Darüber hinaus erstellen Sie eine Begleit STAR-Datei für jedes Virion Volumen (Parater "--output").
- Normalisieren Virion Volumen in BiMg (Parameter "-rescale 0,1").
2. Erzeugung von zwei unabhängigen ersten Modelle
- Wählen Sie eine Teilmenge der Spitzen in den Virion Teilvolumina.
- Öffnen Sie ein Virion Teilvolumen MAP-Datei in bShow. Definieren das Zentrum koordinieren einer Spitze mit der Teilchen-Auswahlwerkzeug, über das Fenster Toolbox erreichbar. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle sich deutlich Spitzen verarbeitet worden sind. Spike speichern Koordinaten in einem STAR-Datei.
- Falls erforderlich, wiederholen Sie Schritt 2.1.1 für andere Virionen bis etwa 200 Glykoprotein Spitzen verarbeitet worden sind. Hinweis Spike Abmessungen in Pixel.
HINWEIS: ~ 200 Spikes sind eine grobe Richtlinie und für einige Anwendungen erforderlich. Wenn möglich, wollen Spikes in verschiedenen Ausrichtungen wählen. Vermeiden Sie Kommissionierung nur Top-Aussicht.
- Vergeben Sie einen ersten Blick auf die Vektor-Spikes, indem Sie jviews.py. Mit der Stern-Dateien in Schritt 2.1.1 als Eingabedateien erzeugt.
HINWEIS: Diese Ansicht Vektor in etwa der Richtung der Spitze in Bezug auf die Virion.- Verwenden Sie die zentrale koordinieren, um die Aussicht für eine sphärische Virion zuweisen. Zum Beispiel, wenn das Virion in einer Box mit einer Größe von 250 x 250 x 250 Pixel zentriert (nach Schritt 1.2), die zentrale Koordinate 125.125.125 Pixel (Option "--Radial 125125125").
- Um die Aussicht für ein Faden Virion zuzuweisen, öffnen jedes Virion Teilvolumen in bShow, indem Sie die in Schritt 2.1.1 als Eingabedatei definiert STAR-Datei. Definieren Sie die beiden Endpunkte mit dem Auswahlwerkzeug Faden den Faden und speichern Sie die Datei STAR. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle STAR Dateien aktualisiert wurden, und führen jviews.py mit den aktualisierten STAR Dateien als Eingabe-Dateien (--option Segment).
- Generieren Sie einen realen Raum Maske mit jsubtomo_create_mask.py. Sicherzustellen, dass der Realraum-Maske ist der gleiche MaßeIonen werden für die gemittelte Struktur verwendet werden (siehe 2.6.2) und ist groß genug, um sowohl die Spitze und ein Stück der darunterliegenden Membran enthalten.
- Generieren Sie einen reziproken Raum Maske mit jsubtomo_create_wedgemask.py. Die reziproken Raum Maske wird verwendet, um Regionen in der "fehlende Keil-Region von einzelnen Achse tomographischen Datenerhebung auszunehmen. Sicherzustellen, dass es die gleichen Abmessungen wie für die gemittelte Struktur verwendet werden (siehe 2.6.2).
- Generieren Sie eine Auswahldatei (SEL-Datei), die Zugehörigkeit zu Virionen Sätze "1" und "2" mit jsubtomo_evenodd.py und der Stern Dateien in Schritt 2.2 erzeugt.
- Erzeugen zwei Anfangsdurchschnittswerte mit jsubtomo_create_averages.py.
- Verwenden Sie die in Schritt 2.5 wie die Eingabedatei erzeugt SEL-Datei.
- Geben Sie eine Größe (Parameter "--size") mindestens 32 Pixel größer als die größte Dimension der Spitze. ZB wenn der Spike ist ~ 40 Pixel lang, Einsatz Größe 72 x 72 x 72 Pixel.
- Anwenden einer hohen Symmetrie (zB C100) auf den Durchschnittswerten (Parameter "--symmetry C100"), einen zylindrischen mittleren um die Langsachse des Dorns anzunähern. Verwenden Symmetrisierung Rausch in der Anfangsdurchschnittswerte zu reduzieren.
- Geben Sie einen eindeutigen Namen für die Ausgabedateien des Projekts (Parameter "--suffix").
- Verwenden Sie die in Schritt 2.3 erzeugt realen Raum Maske zu Maske entfernt Hintergrund (Parameter "--mask"). Verwenden des in Schritt 2.4 generiert reziproken Raum Maske, um den Verlust des Signals durch das Vorhandensein einer fehlenden Keil (Parameter "--Mask") eingeführt zu berücksichtigen.
3. Goldstandard Iterative Ausrichtung und Mittelung der beiden ersten Spike Modelle
Iterativ auszurichten und den Durchschnitt der beiden ersten Modelle in Abschnitt 2 mit jsubtomo_iterate_gold.py erzeugt.
- Stufe I. Das Ziel dieser Phase ist es, das zu verfeinernRichtung der Ansicht Vektor. Die Eingabedatei ist die in Schritt 2.5 erzeugt SEL-Datei.
- Verwenden Sie einen 8-Grad-Winkel Probenahme (Parameter "--angles 8,8,8").
- Erlauben 16-Grad-Änderung in der Richtung der Spitze Blickvektor (Parameter "--thetaphilimit 16"), aber der Winkel um den Dorn befestigt Längsachse (Parameter "--alphalimit 0") zu halten.
- Erlauben kleine translatorische Verschiebungen (beispielsweise 5 Bildpunkte), um Ungenauigkeiten in der manuellen Kommissionierung der Spitzen-Konto (Parameter "--shiftlimit 5").
- Anwenden einer hohen Symmetrie (zB C100) auf den Durchschnittswerten (Parameter "--symmetry C100"), einen zylindrischen mittleren um die Langsachse des Dorns anzunähern.
HINWEIS: Die Symmetrierung wird verwendet, um das Rauschen in den Durchschnittswerten zu reduzieren. - Verwenden Sie den realen Raum und die Maske in den Schritten 2.3 und 2.4 erzeugt reziproken Raum Maske, um das fehlende Keil (Parameter "--m Maske entfernt Umgebung Spikes und Kontofragen "und" --Mask ", beziehungsweise).
- Verwenden Sie die beiden Dateien in MAP 2.6 generiert (durch Tags "selbst" und "ungerade" im Dateinamen) als Vorlagen (Parameter "--Template1" und "--Template2", beziehungsweise).
- Tragen Sie einen Tiefpassfilter bei 50-Å Auflösung (Parameter "--resolution"), um die Ausrichtung Bias zu verhindern.
- Tragen Sie eine bin Faktor 2 zu beschleunigen, die Verfeinerung (Parameter "--bin 2").
- Führen 5 Iterationen der Ausrichtung und Mittelung (Parameter "--firstiter 1 --lastiter 5").
- Stadium II. Das Ziel dieser Stufe ist es, den Winkel um die Betrachtungsvektor verfeinern. Die Eingabedatei ist der Ausgang SEL-Datei aus Schritt 3.1.9.
- Messen Sie die genauen Abmessungen der Spitze durch das Öffnen der in der letzten Iteration in Schritt 3.1.9 erzeugt Tiefpass-gefilterte MAP-Datei (bezeichnet durch tag "_lp" im Dateinamen) in bShow. Erzeugen Sie eine neue EchtRaum Maske ähnlich wie in Schritt 2.3, der die Spitze definiert, schließt aber die meisten der Membran und den benachbarten Spitzen.
HINWEIS: Die optimale Größe der Maske hängt von der Größe und Merkmale der Spitze. - Verwenden Sie 8-Grad-Winkel Probenahme (Parameter "--angles 8,8,8") wie zuvor.
- Lassen Sie 180-Grad-Veränderungen im Winkel um die Spitze Sichtvektor (Parameter "- alphalimit 180"), aber halten das Theta und Phi Winkel fixiert (Parameter "--thetaphilimit 0").
- Sie alle translationale Verschiebungen erlauben nicht (Parameter "--shiftlimit 0").
- Keine Symmetrie auf die Durchschnittswerte (weglassen Parameter "--symmetry") gelten.
- Verwenden Sie die in Schritt 2.4 erzeugt reziproken Raum Maske, um das fehlende Keil ausmachen.
- Verwenden Sie die beiden Map-Dateien in der letzten Iteration von Schritt 3.1.9 ohne Symmetrie erzeugt als Vorlagen (Parameter R (durch Tags "even_nosym" und "odd_nosym" im Dateinamen bezeichnet)20; - Template1 "und" --Template2 "bezeichnet).
- Tragen Sie einen Tiefpassfilter bei 50-Å Auflösung (Parameter "--resolution") in der ersten Iteration, um die Ausrichtung Bias zu verhindern. Passen Sie die Filterparameter in den nachfolgenden Iterationen automatisch (Parameter "--adaptivefilter"), basierend auf Goldstandard Fourier Shell Correlation (FSC) zwischen den zwei unabhängigen Durchschnittswerte. Verwenden 0.143-Kriterium (Parameter "--fsccrit 0,143"). Keine Verfeinerung ermöglichen nicht über die erste Null der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) (Parameter "--minhires"), es sei denn, CTF Korrektur auf die Schnittbilder angewendet.
- Führen Sie 5-10 Wiederholungen der Ausrichtung und Mittelung (zB Parameter "--firstiter 6 --lastiter 15"). Überwachen Sie die Änderungen in der berichtet Auflösung. Wenn keine signifikanten Veränderungen beobachtet werden, kann der Prozess angehalten werden.
- Messen Sie die genauen Abmessungen der Spitze durch das Öffnen der in der letzten Iteration in Schritt 3.1.9 erzeugt Tiefpass-gefilterte MAP-Datei (bezeichnet durch tag "_lp" im Dateinamen) in bShow. Erzeugen Sie eine neue EchtRaum Maske ähnlich wie in Schritt 2.3, der die Spitze definiert, schließt aber die meisten der Membran und den benachbarten Spitzen.
- Beurteilen Sie den Grad der Symmetrie in der Struktur durch examining der resultierenden Tiefpass-gefilterte MAP-Datei (nach Tag "_lp" bezeichnet im Dateinamen) in Chimäre. zB wenn der Spike ist ein trimeren Komplex, sollte das 3-fache Symmetrie offensichtlich.
- Stadium III. Das Ziel dieser Phase ist es, den Winkel um die Ansicht Vektor weiterhin mit der richtigen Symmetrie zu verfeinern. Die Eingabedatei ist der Ausgang SEL-Datei aus Schritt 3.2.9. Die Parameter sind die gleichen wie in Schritt 3.2 mit wenigen Ausnahmen:
- Können die entsprechenden Änderungen in der Winkel um die Spitze Sichtvektor. Zum Beispiel, wenn die Struktur 3-fach Symmetrie ermöglichen Änderungen von 60 Grad im Winkel Alpha (Parameter "--alphalimit 60").
- Tragen Sie die richtige Symmetrie (zB C3) auf die Durchschnittswerte (Parameter --symmetry c3 ").
- Verwenden Sie die beiden Map-Dateien in der letzten Iteration erzeugt in Schritt 3.2.9 (durch Tags gekennzeichnet "gerade" und "ungerade" im Dateinamen) als Eingangs Template-Dateien (Parameter "--Template1" und --Template2).
- Führen Sie 5-10 Wiederholungen der Ausrichtung und Mittelung (zB Parameter "--firstiter 16 --lastiter 25"). Überwachen Sie die Änderungen in der berichtet Auflösung. Wenn keine signifikanten Veränderungen beobachtet werden, kann der Prozess angehalten werden.
- Stadium IV. Das Ziel dieser Phase ist es, alle drei Winkel genau verfeinern gleichzeitig. Die Eingabedatei ist der Ausgang SEL-Datei aus Schritt 3.4.4. Die Parameter sind die gleichen wie in Schritt 3.4 mit wenigen Ausnahmen:
- Innerhalb von 8 Grad Veränderungen im Winkel um die Spitze Blickvektor (Parameter "- alphalimit 8") und 8-Grad-Änderungen in der Richtung des Dorns Blickvektor (Parameter "--thetaphilimit 8"). Verfeinern Sie die Orientierungen zu 4-Grad-Genauigkeit (Parameter "--angles 8,8,8 --iterate 2").
- Erlauben kleine Verschiebungen (zum Beispiel 5 Pixel), um Ungenauigkeiten in früheren Ausrichtungsschritte entfallen (Parameter "--shiftlimit 5").
- Use die beiden Map-Dateien in der letzten Iteration in Schritt 3.4.4 erzeugt (durch Tags "selbst" und "ungerade" im Dateinamen) als Eingangs Template-Dateien (Parameter "--Template1" und --Template2).
- Führen Sie 5-10 Wiederholungen der Ausrichtung und Mittelung (zB Parameter "--firstiter 26 --lastiter 35"). Überwachen Sie die Änderungen in der berichtet Auflösung. Wenn keine signifikanten Veränderungen beobachtet werden, kann der Prozess angehalten werden.
4. Erzeugung und Ausrichtung der Samen auf der Virusoberfläche für Template Matching
- Erzeugen Samen gleichmäßig auf der Oberfläche des Virions für Template-Matching liegt, und weisen eine erste Sichtvektor auf die Samen, indem Sie jviews.py. Mit der Stern-Dateien in Schritt 1.2.2 als Eingabedateien erzeugt. Erzeugen ungefähr 1,5 mal mehr Samen als die erwartete Anzahl von Spikes.
HINWEIS: Diese Ansicht Vektor in etwa der Richtung der Spitze am nächsten zu jedem Startpunkt.- Gleichmäßig verteilt Samen auf einem annähernd kugelförmigen Virion (Parameter "--Even") erzielt werden, geben den Radius (Parameter "--radius") Winkelabstand (zB 20 Grad) der Samen (Parameter "--angle 20" ) und die zentrale Koordinate des Virions. zB wenn der Virion zentriert ist (nach Schritt 1.2) in einem Feld mit einer Größe von 250 x 250 x 250 Pixeln, die zentrale Koordinate 125.125.125 Pixel (Option "--origin 125125125") .
- Gleichmäßig verteilt Samen auf einem fadenförmigen Teilchen zu erzeugen, verwenden Sie den Parameter "--Filament" und geben sowohl den Radius und die spiralförmige Symmetrie-Parameter (Aufstieg und Twist).
HINWEIS: Die spiralförmigen Symmetrie Parameter werden nur als eine bequeme Art der Definition gleichmäßig verteilt Setzpositionen verwendet und sie nicht brauchen, um die tatsächliche Anordnung der Spikes auf den Faden zu reflektieren.
- Erzeugen zwei unabhängige Durchschnittswerte von der Virusoberfläche als explained in Abschnitt 2.
- Erzeugen Sie eine Datei definieren SEL Virionen, die zu Sätzen "1" und "2" mit jsubtomo_evenodd.py und der Stern Dateien in Schritt 4.1 erzeugt.
HINWEIS: Um die Unabhängigkeit von Datensätzen, eine frühere Zuordnung der Virionen in Gruppen zu gewährleisten "1" und "2" muss der gleiche bleiben.
- Erzeugen Sie eine Datei definieren SEL Virionen, die zu Sätzen "1" und "2" mit jsubtomo_evenodd.py und der Stern Dateien in Schritt 4.1 erzeugt.
- Verfeinern Sie die Position der Samen.
- Folgen Sie den Anweisungen in Schritt 3.1, sofern nicht anders angegeben. Verwenden Sie die in Schritt 4.2.1 als Eingabedatei erzeugt SEL-Datei.
- Ermöglichen die Samen nur entlang der Normalen zu der Membran (Parameter "--zshiftlimit") zu verlagern. Einstellen der Größe der Verschiebung erlaubt, je nachdem wie stark die Virionen abweichen idealen Kugelgeometrie (beispielsweise Parameter --zshiftlimit 25 ").
- Verwenden Sie die beiden Map-Dateien in Schritt 4.2 erzeugt als Eingangs Template-Dateien (Parameter "--Tem (durch Tags" selbst "und" ungerade "im Dateinamen bezeichnet)plate1 "und --Template2).
- Verwenden Sie einen eindeutigen Suffix zu vermeiden Überschreiben der Original-Eingabe STAR-Dateien (zB Parameter "--suffix _seeds").
- Verwenden Binning 4 zur Beschleunigung der Berechnung (Parameter "--bin 4") und einen Tiefpassfilter (zum Beispiel Parameter "--resolution 50").
- Erzeugen Chimera Marker Dateien (CMM) der raffinierten Samen STAR-Dateien mit jviews.py (Parameter "--cmm"). Untersuchen Sie die Samen von in Chimäre Öffnen der CMM-Dateien (und die damit verbundenen Virion MAP-Dateien). Stellen Sie sicher, dass die Samen verfeinert werden korrekt in Bezug auf die Virusmembran ausgerichtet.
HINWEIS: Verschiedene Farben können verwendet werden, um verschiedene Sätze von Markern (Parameter "--color") zu unterscheiden. Alternativ können die raffinierte Marker können auf der Grundlage ihrer Kreuzkorrelationskoeffizienten (beispielsweise Parameter "--fomcolor 0.1,0.3 ') eingefärbt werden.
5. GoldständerARD Iterative Ausrichtung und Mittelung des Spike-Struktur
Automatisch lokalisieren alle Spitzen in den Virion Teilvolumina mit lokalen Template-Matching um die raffinierten Samen und ausrichten und den Durchschnitt der befindet Spikes. Verwenden Sie die aus einer Teilmenge manuell abgeholt Spikes als Anfangs Vorlagen erzeugt Durchschnittswerte.
- Führen Sie eine lokale Template-Matching um die Samen zu mitteln alle Spikes mit dem Programm jsubtomo_iterate_gold.py. Folgen Sie den Anweisungen in Schritt 3.5, sofern nicht anders angegeben.
- Die Eingabedatei ist die SEL-Datei für den verfeinerten Samen in Schritt 4.3 erzeugt.
- Verwenden Sie eine ausreichend große Grenze für die Ansicht Vektorwinkel. ZB wenn Samen wurden alle 20 Grad (Schritt 4.1) erzeugt, verwenden Sie einen Winkel, der etwas größer ist als die Hälfte dieses Wertes (Parameter "--thetaphilimit 12"). Können die entsprechenden Änderungen in der Winkel um die Spitze Sichtvektor.
- Lassen Sie Samen in der Ebene der Membran verschieben (Parameter"--xyshiftlimit"). ZB wenn der Samen zu Samen Entfernung beträgt 25 Pixel, verwenden Gesamtschalt etwas mehr als die Hälfte davon (zB Parameter "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
HINWEIS: Weitere translationale Verschiebungen erforderlich sein, wenn die Karte Dateien in Schritt 3.5 erzeugt werden in einem anderen Abstand von der Mitte Virion als die Samen zentriert werden. - Verwenden Sie die beiden Map-Dateien in Schritt 3.5 erzeugt (durch Tags "selbst" und "ungerade" im Dateinamen) als Eingangs Template-Dateien (Parameter "--Template1" und --Template2).
- Verwenden Sie die aktuelle Auflösung der Karte Dateien in Schritt 3.5 (Parameter --resolution) erzeugt.
- Führen Sie 5-10 Wiederholungen der Template-Matching, Ausrichtung und Mittelwertbildung (zB Parameter "--firstiter 1 --lastiter 10"). Überwachen Sie die Änderungen in der berichtet Auflösung. Wenn keine signifikanten Veränderungen beobachtet werden, kann der Prozess angehalten werden.
- Nach jeder IterationAusschließen überlappende Zugriffe. ZB, wenn die Breite des Dorns 30 Pixel ausschließen Hits, die näher als 30 Pixel für andere Zugriffe (Parameter "--mindist 30") sind.
- Hits mit einem niedrigen Kreuzkorrelationskoeffizient auszuschließen. Zum Beispiel schließen die besten 75% Spitzen für jedes Virion (Parameter "--topp 75").
HINWEIS: Hits mit einem niedrigen Kreuzkorrelationskoeffizienten sind wahrscheinlich falsch positiven Treffern zu vertreten.
6. Darstellung der Ergebnisse
- Öffnen Sie die raffinierte Struktur des Spike in Chimäre für die Visualisierung und den Einbau von atomaren Strukturen.
- Verwenden Sie die Tiefpass-gefilterte MAP-Datei (nach Tag "lp" bezeichnet) in der letzten Iteration erstellt in Schritt 5.1.6 als Eingabedatei.
- Verwenden Sie die in Schritt 5.1.6 für Kreuzkorrelation basierend Einbau in Chimäre angegeben Auflösung "Fit in der Karte"-Tool.
- Erstellen Sie eine zusammengesetzte Modell der VIRIOn mit jsubtomo_create_model.py.
- Verwenden Sie die Tiefpass-gefilterte MAP-Datei (nach Tag "lp" bezeichnet) in der letzten Iteration erstellt in Schritt 5.1.6 als Eingangs MAP-Datei zu (Parameter "--template").
- Verwenden Sie einen in der letzten Iteration erzeugt STAR-Datei in Schritt 5.1.6 als Eingangs STAR-Datei.
- Verwenden Sie die in Schritt 3.2.1 erzeugte Maske Datei für überlappende Dichten im Verbundmodell (Parameter "--mask") Rechnung zu tragen.
- Die Größe des Virions MAP-Datei, um eine zusammengesetzte Modell der gleichen Größe (Parameter "--size") zu erzeugen.
- Öffnen Sie die Verbundmodell für die Visualisierung in Chimäre.
Representative Results
Wir demonstrieren die Anwendung des Teillung Tomogramm Workflow oben für die Hüllglycoprotein Komplex von Bunyamwera Virus (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) mit einem zuvor veröffentlichten Daten skizzierten 24. Datensammlung und Verfeinerungsparameter sind in Tabelle 1 aufgeführt. Ein Vertreter Tomogramm wird in 2 gezeigt.
| Parameter (Einheit) | Wert |
| Datensammlung | |
| Spannung (kV) | 300 |
| Kalibriert Vergrößerung (X) | 111.000 |
| Pixelgröße (Å) | 5.4 |
| Geschätzte Dosis (E - / A 2) | 100 |
| Unterfokus (um) | 4,0-4,5 |
| Erste CTF Null (A) ein | 26-30 |
| Neigebereich (°) | -60-60 |
| Tilt Probenahme (°) | 3 |
| Daten und Raffinesse | |
| Schnittbilder | 11 |
| Virionen | 29 |
| Samen pro Virion | 106 |
| Gesamtzahl Samen | 3.074 |
| Spikes erkannt | 1.346 |
| Spikes nach dem Entfernen Überschneidungen | 1.401 |
| Spikes nach Kreuzkorrelationsbasierte Auswahl | 1.022 |
| Spikes in der letzten Durchschnitt ein, | 1.022 |
| Symmetrie | C3 |
| Winkel Probenahme (°) | 8 |
| AuflösungBereich in der Verfeinerung (a) | 42-334 |
| Endgültige Auflösung Schätzung (a) b | 35 |
Tabelle 1: Bunyamwera Datensammlung und Verfeinerung Statistik.
ein CTF, Kontrastübertragungsfunktion.
b Berechnet mit Fourier-Shell Korrelation zwischen zwei unabhängig raffinierten Strukturen bei einer Schwelle von 0.143.
Figur 2:. Scheibe durch ein Tomogramm Bunyamwera Virionen Mehrere Spike Seitenansichten zeigt sich in der Peripherie jedes Virion sind mit Pfeilspitzen markiert. Das Schnittbild ist Low-Pass bis 60 Å gefiltert. Maßstab 100 nm auf.
Zunächst wird ein erstes Modell mit 205 manuell abgeholt Spikes (raffiniertes wir
Abbildung 3: Verfeinerung der ursprünglichen Template-Struktur. (A) Zylindrisch gemittelt (C100) Vorlage aus manuell definierten Positionen von Spitzen gebaut. (B), gemittelt Dichte nach fünf Runden der Verfeinerung ohne Symmetrie (C1) auferlegt zeigt eine Spitze mit drei-fachsymmetrische Funktionen. Die Auflösung des Modells ist 48 Å. (C) Durchschnittliche der Spitze wurde bei 41 A nach fünf Runden der Verfeinerung mit Dreifach-Symmetrie gelöst.
Abbildung 4:. Verfeinerung der Samen AB) Eine Teilmenge der Samen vor (A) und nach (B) sind auf einer Verfeinerung Virion Dichte von 2 gezeigt Seeds in (B) wurden farbcodiert auf der Grundlage der jeweiligen Quer. Korrelationskoeffizienten (blau, geringe Korrelation, rot, hohe Korrelation).
Die besten korrelierende Glykoprotein Spike Patches (Top 75% nach dem Entfernen Überschneidungen; ~ 1.000 Spikes) wurden verwendet, um die endgültige Durchschnitt zu berechnen. Die durchschnittliche wurde auf 35-Å Auflösung (Abbildung 5) gelöst. Es zeigte eine trimere Struktur Dorn in der Mitte, inNeben einigen Beitrag aus sechs Nachbar Spikes. Verbund Modelle der Virionen, indem die Struktur in den bekannten Positionen berechnet wird, offenbart die Anordnung der Spikes auf der Oberfläche des Virions (6A). Gelegentlich waren vor Ort bestellt Patches von Spikes deutlich (Abbildung 6B).
Abbildung 5: raffinierte Struktur eines Patches von dem Glykoprotein Spike Schicht nach Template-Matching. (AB) Zwei Karten "auch" und "ungerade", aus zwei Hälften der Daten rekonstruiert werden angezeigt. Die beiden Karten zeigen einen bemerkenswerten Grad der Ähnlichkeit, die Überprüfung der Ihrer Gültigkeit des Ansatzes. Die Ausrichtung um die Längsachse Spitze unterscheidet, als die beiden Karten sind vollständig unabhängig voneinander rekonstruiert. (C) Durchschnitt der beiden Karten an gezeigtdie endgültige Auflösung von 35 Å.
Abbildung 6: Platzierung der Spikes auf der Bunyamwera Virus. (A) Composite-Modell eines Virions. Ansicht Vektoren (Sticks) zeigen die Orientierung der Spikes. Farben zeigen die Kreuzkorrelation zwischen jedem Spike und der Template-Struktur (blau, geringe Korrelation, rot, hohe Korrelation). (B) A close-up von einer geordneten Patch von Spikes.
Discussion
Wissen von viralen Glykoprotein Spike-Struktur auf der Membran Virus ist von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis der Virus-Replikation und die Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung und Prävention der Infektion. Kryoelektronenmikroskopische kombiniert mit Einzelpartikellung wurde als die am häufigsten verwendete Methode, um die Strukturen der umhüllten Viruspartikel, einschließlich der Spitzen-Glykoprotein lösen entstanden. Jedoch ist dieses Verfahren beschränkt auf die symmetrische Viren ikosaedrisch. Hier durch die Anwendung der Elektronen Kryo-Tomographie und subtomogram Mittelung in Jsubtomo, haben wir ein allgemeines Protokoll zur Bestimmung Glykoprotein-Spikes auf pleomorphen umhüllte Viren, die nicht zugänglich für andere aktuelle Methoden der Strukturbiologie werden skizziert. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen, dass die Auflösung dieser Methode ist ausreichend, um Einblicke in die Domänenarchitektur, Oligomerisierung und höherer Ordnung Organisation des Glykoprotein-Spikes auf intakte Virionen offenbaren.
jove_content "> Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll baut zwei zuverlässige Ausgangsmodelle, die statistisch unabhängig voneinander. erfolgreiche Ausführung dieser Schritt setzt voraus, dass Glykoprotein Spikes sind ausreichend groß und nicht gegeneinander zu fest gepackt, so dass einzelne Spikes visuell erkannt werden, und manuell in der Schichtbilder aufgenommen und zwei unabhängige Modelle gemittelt. Wenn dies nicht möglich ist, zwei Änderungen an dem Protokoll versucht werden kann. Zuerst werden zwei unabhängige Zufalls Modelle können durch erste, die zwei Untergruppen von Zufalls subtomograms und dann konstruiert werden Mittelung der subtomograms innerhalb dieser Untergruppen 30. Zweitens, wenn eine Struktur des isolierten Spitze durch andere Mittel, durch Röntgenkristallographie abgeleitet, beispielsweise können sie als Ausgangsmodell verwendet werden. Allerdings muss darauf geachtet werden, werden im niedrigen Pass-Filter dieses Modell mit einem Low-Cut-off-Auflösung (50-70 Å), wie die beiden resultierenden Modelle in der nächsten Runde der Verfeinerung wirdstatistisch unabhängigen erst jenseits dieser Auflösung. Aufgrund dieser Einschränkung ist der erste Ansatz empfohlen.Die erzielbare Auflösung von diesem Protokoll hängt von vier Hauptfaktoren: i. Datensammlungsstrategie und die Qualität der Eingabedaten, ii. Anzahl der subtomograms, iii. Ausrichtungsgenauigkeit der subtomograms und iv. Heterogenität der Strukturen. Während die ersten und zweiten Begrenzungs weitgehend durch hoch Signal-Rausch direkten Elektronendetektoren kombiniert mit CTF korrigiert Tomographie und automatisierte Datenerfassung zu überwinden, wird die Ausrichtungsgenauigkeit weiter durch die Größe und Form der Struktur von Interesse selbst beeinflusst. Bei der Anwendung dieses Protokolls auf kleine Spitzen ohne hervorstechende Merkmale, kann es vorteilhaft sein, um Fab-Fragmente zu binden, um den Dorn, um die Ausrichtungsgenauigkeit und damit Auflösung 31 zu verbessern. Schließlich, wenn die Strukturen, die gemittelt werden, weisen mehrere Konformationen Unter tomogrUhr Klassifikationsmethoden verwendet werden, um im Durchschnitt unterschiedlichen Konformationen getrennt werden. Zu diesem Zweck integriert Jsubtomo mit dem Dynamo-Paket und bietet leistungsstarke subtomogram Klassifizierung 9.
Das obige Protokoll komplementär zu Röntgenkristallographie von isolierten viralen Glycoproteine. Kristallographischen Strukturen in Teilschnittbild Schnittswerte eingesetzt, um die genaue Ausrichtung des Glykoproteins bezüglich des Virions Membran zu erhalten. Anwendung dieser Methode wird zweifellos auch Licht auf umhüllte Virus Struktur und Pathobiologie vergießen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
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