Abstract
エンベロープウイルスは、宿主細胞への侵入を媒介するそれらの表面上に膜糖タンパク質を利用する。これらの糖タンパク質「スパイク」の三次元構造解析は、多くの場合、ウイルスの病原性を理解するための薬物設計における技術的に困難だが重要である。ここで、プロトコルは、電子クライオ断層撮影データの計算、平均化を介してウイルスのスパイク構造決定のために提示されている。クライオ電子断層撮影は、ネイティブに近い、凍結水和状態における膜ウイルスなど多形の生物学的標本の3次元断層ボリューム再構築、または断層像を導出するために使用される電子顕微鏡の技術である。これらの断層像は、低解像度ではあるが、三次元の関心の構造を明らかにする。サブボリューム、またはサブ断層像の計算平均、例えば、ウイルス糖タンパク質スパイクなどの構造モチーフを、繰り返しの高解像度の詳細を取得する必要がある。アリのための詳細な計算アプローチgningとJsubtomoソフトウェアパッケージを使用してサブ断層像を平均化することが概説されている。このアプローチは、ビリオン膜上の高次スパイク·ツー·スパイクの相互作用の研究の20〜40オングストロームの範囲の解像度と研究にウイルス糖タンパク質スパイクの構造の可視化を可能にします。典型的な結果をBunyamweraウイルス、 ブニヤウイルス科からのエンベロープウイルスのために提示されています。このファミリーは、ヒトおよび動物の健康に脅威を与え、病原体の構造的に多様なグループです。
Introduction
クライオ電子断層撮影法は、複雑な生物学的標本の3次元（3D）再構成の計算を可能にする電子低温顕微鏡イメージング技術である。適当な標本は、全体の原核細胞5および全真核細胞6のさえ薄い領域まで精製高分子複合体1、フィラメント2、被覆小3、および多形性膜ウイルス4の範囲である。傾斜シリーズ、3D断層撮影ボリューム、または断層像のデータ収集に続いて、Bsoft 7およびIMOD 8を含むいくつかの確立されたソフトウェアパッケージを用いて計算することができる。
クライオ電子断層撮影制限対応する断層ボリュームの生物学的解釈による生体試料の研究に固有の二つの側面。まず、有意な放射線損傷を導入する前に、生物学的材料に適用することができる限定された電子線量に起因し、シグナ断層データでlの対雑音比は、典型的には非常に低い。第二に、データ収集中に限られたサンプル傾斜ジオメトリの結果として、オブジェクトの一部のビューは、断層ボリューム内のいわゆる「欠落ウェッジ」アーチファクトにつながる、存在しないままである。断層ボリュームが正常9-12を平均化することができるような巨大分子複合体と同一の構造を、繰り返し含まれている場合は、これらの制限の両方を克服することができる。
断層像再構成の構造を平均する前に、目的のオブジェクトが発見され、同じ方向に揃えておく必要があります。そのような構造体を配置することをしばしば13テンプレートマッチングと呼ばれる手法を用いた断層ボリュームテンプレート構造の相互相関によって達成することができる。このマッチング処理で使用されるテンプレートは、クライオ電子顕微鏡または3D再構成と組み合わさクライオ電子断層撮影法から誘導され得るか、またはそれからシミュレートされた密度マップすることができ原子構造。いくつかの計算のパッケージは、これらのタスク11を実行するために開発されてきた。
例えば、HIV-1のような膜ウイルスの糖タンパク質スパイクの平均化、それらの構造14〜16を研究するための特に成功アプローチしている。構造の理解は、ウイルス - 宿主相互作用の分子基盤の両方を明らかにし、抗ウイルス剤およびワクチン設計の開発をガイドするための不可欠です。巨大分子結晶学は、個別のウイルス糖タンパク質およびそれらの複合体の構造解析（4Åよりも通常より良い）、高解像度のための選択の技術であるが、この方法から得られるX線構造は、ビリオンの自然膜状の環境から単離されたタンパク質である。したがって、例えば、ウイルス糖タンパク質の高次アーキテクチャなどの重要な詳細は、ビリオンの文脈において、欠けているままである。一方、電子低温顕微鏡法および単一粒子再建全体のエンベロープウイルスの正20面体対称17,18とビリオンに制限されています。サブボリュームの配置と組み合わせた電子cryotomographyは、このように、その場で不規則な形状、多形性ウイルスの糖タンパク質スパイクの研究を可能にする補完的な技術として浮上している。
私たちは、Jsubtomo断層サブボリュームの検出、位置合わせ、および平均化（www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo）というソフトウェアを開発しました。 Jsubtomoは細胞およびウイルスの構造19-26数の構造決定に利用されている。ここでは、決定、ウイルス表面のスパイク構造を可能にする詳細なプロトコルを概説しています。ノイズを相関させることによって、過剰洗練平均した構造の回避するために、「ゴールドスタンダード」の改良方式が10,27を採用しています。最後に、典型的な結果の可視化と解釈のための戦略が議論されている。
Protocol
計算上のアライメントおよびウイルス糖タンパク質スパイクのその後の平均化のための詳細なプロトコルが概説されている。プロトコルは、 図1に示したワークフローに従っており、初期テンプレート構造を使用してスパイクとゴールドスタンダード構造精密化のための自動検索を兼ね備えています。
このプロトコルの入力データは、ビリオンの断層再構成のセットです。一つの断層は、1つまたはそれ以上のビリオンを含んでいます。最初に、スパイクの小さなサブセットを手動で採取し、二つの独立したモデルを平均化し、リファインするために使用される。これらのモデルは、自動的にビリオンのすべてのスパイクを検索するために使用されている。最後に、2つの独立した改良が実行され、得られた平均値を比較し、最終的な構造を生成するために結合される。
精密化アプローチはJsubtomoパッケージからのプログラムを使用することによって実証される。 Bsoftパッケージ28からのプログラムは、一般的な画像pのために使用されているrocessingタスクおよび分子グラフィックスパッケージUCSFキメラ29は、結果を視覚化するために使用される。イタリックやファイル形式で与えられる各プログラムの名前が大文字のファイル名の拡張子を付している。
図1：多形性メンブレンウイルスからスパイクの複合体糖タンパク質の構造を決定するための一般的な戦略の数字はプロトコルの異なるセクションに対応するこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
1フルサイズの断層像からウイルスサブボリュームの抽出
- 断層像で手動でウイルス粒子を選択してください。
- と（b）における断層像ファイルを開きます。ウイルスの粒子フィルタの中心座標を定義します。ルは、粒子ピッキングツールを使用して。すべてのビリオンが処理されるまで、この手順を繰り返します。スターファイルでウイルスの座標を保存します。
- 全ての断層像が処理されるまでステップ1.1.1を繰り返す。ピクセル単位でビリオン直径をメモしておきます。
注：スパイクは、断層像に見えにくい80オングストロームの分解能にローパスフィルタへの断層像をbfilterを使用します（パラメータ"-bandpass 80,10000」）である場合。
- 個別のボリューム·ファイルにビリオンサブボリュームを抽出するための抽出モード（パラメータ"--mode抽出物」）にjsubtomo.py実行します。入力ファイルとしてステップ1.1.1で保存されたSTARファイルを使用します。
- データセット内の最大ビリオンよりも25％大きいサイズ（パラメータが「--size」）〜を与えます。 たとえば 、ビリオンは直径〜200ピクセル、使用サイズ250×250×250ピクセルである場合。
- ビリオンボリュームの出力ファイルは、MAP-形式になります。加えて、各ビリオンボリュームの付随STAR-ファイルを作成します（パラメター "--output」）。
- BIMG（パラメータ"-rescale 0,1"）でビリオンボリュームを正規化します。
二つの独立した初期のモデルの2世代
- ビリオンサブボリューム内のスパイクのサブセットを選択してください。
- と（b）におけるビリオンサブボリュームMAPファイルを開きます。 [ツールボックス]ウィンドウを介してアクセス可能な粒子ピッキングツールを使用して、スパイクの中心座標を定義します。すべての明らかに異なるスパイクが処理されるまで、この手順を繰り返します。保存スパイクはSTARファイルで調整します。
- 必要に応じて、約200の糖タンパク質スパイクが処理されるまで、他のビリオンのためのステップ2.1.1を繰り返します。ピクセル単位でのスパイクの大きさに注意してください。
注：〜200スパイクは目安であり、よりいくつかのアプリケーションが必要な場合があります。可能であれば、異なる向きにスパイクを選ぶことを目指しています。トップのみのビューを選ぶことは避けてください。
- jviews.pを実行して、スパイクへの最初の視線ベクトルを割り当てyを。入力ファイルとしてステップ2.1.1で生成されたSTARファイルを使用します。
注：このビューベクトルは、ビリオンを参照して、スパイクの方向を近似する。- 中央が球状ビリオンのビューを割り当てることがコーディネートに使用します。ビリオンは250×250×250ピクセルの大きさのボックスに（ステップ1.2の後）、中央に配置された場合、中心座標が125125125ピクセル（オプション "--Radial 125125125」）である。
- 糸状ビリオンのためのビューを割り当てるには、入力ファイルとしてステップ2.1.1で定義されたSTARファイルを使用して、 と（b）の各ビリオンサブボリュームを開きます。フィラメントピッキングツールを使用して、フィラメントの両端点を定義し、STARファイルを保存します。オールスターのファイルが更新されるまで、この手順を繰り返して、入力ファイル（--optionセグメント）のように更新STARファイルを使用してjviews.py実行します。
- jsubtomo_create_mask.pyを使用して実空間マスクを生成します。実空間マスクは同じdimensであることを確認してください平均化された構造のために使用されるように、イオンは、（2.6.2を参照）、スパイクと下地膜のパッチの両方を含むのに十分な大きさである。
- jsubtomo_create_wedgemask.pyを使用して逆空間マスクを生成します。逆空間マスクは、単一の軸断層撮影データ収集から得られる「欠落ウェッジ '領域内の領域を除外するために使用される。 （2.6.2を参照）を平均構造のために使用されるように、同じ寸法のものであることを確認してください。
- jsubtomo_evenodd.pyステップ2.2で生成されたSTARファイルを使用して「1」と「2」のセットに属するウイルス粒子を定義する選択ファイル（SELファイル）を生成する。
- jsubtomo_create_averages.pyを使用した2つの初期の平均値を生成します。
- 入力ファイルとしてステップ2.5で生成されたSELファイルを使用します。
- サイズを与える（パラメータが「--size」）スパイクの最大寸法よりも大きく、少なくとも32ピクセル。 たとえば 、スパイク〜40ピクセルに長い場合、サイズは72×72×72ピクセルを使用しています。
- スパイクの長軸周りの円筒形の平均に近づけるために、高い平均値を上の対称性（ 例えば 、C100）（パラメータ「--symmetryのC100」）を適用します。初期の平均値にノイズを低減するために対称化を使用してください。
- プロジェクト（パラメータ "--suffix」）の出力ファイルの一意の名前を指定します。
- 背景（パラメータ "--mask」）を離れてマスクするステップ2.3で生成された実空間マスクを使用してください。不足しているウェッジ（パラメータ "--mask」）の存在によって導入された信号の損失を考慮するためのステップ2.4で生成された逆空間マスクを使用してください。
3ゴールドスタンダード反復アライメントと2つの初期スパイクモデルの平均化
反復的に整列し、jsubtomo_iterate_gold.pyのセクション2で生成された2つの初期のモデルを平均。
- ステージIで、この段階の目標は、洗練することです視線ベクトルの方向。入力ファイルは、ステップ2.5で生成されたSELファイルです。
- 8度の角度サンプリング（パラメータ "--angles 8,8,8」）を使用してください。
- （パラメータ「16 --thetaphilimit」）スパイク視線ベクトルの方向に16度の変更は許可するが、スパイクの長軸に固定（パラメータ「--alphalimit 0 "）周りの角度を保持します。
- （パラメータが「5 --shiftlimit」）スパイクのマニュアルピッキングの不正確さを考慮して、小型のトランスレーショナルシフト（ 例えば 5画素）を許可します。
- スパイクの長軸周りの円筒形の平均に近づけるために、高い平均値を上の対称性（ 例えば 、C100）（パラメータ「--symmetryのC100」）を適用します。
注：対称化は、平均値のノイズを減少させるために使用される。 - 不足しているウェッジ（パラメータ "--mのために周囲のスパイクやアカウントを離れてマスクする実空間マスクとステップ2.3および2.4で発生する逆空間マスクを使用して、）は、それぞれ、「--mask尋ねる」や「。
- 2.6で生成された2マップファイルを使用します（「偶数」のタグで示されると、ファイル名に「奇数」）（それぞれ、パラメータ「--Template1」と「--Template2」）をテンプレートとして。
- アライメント偏りを防ぐために、50オングストロームの分解能（パラメータ "--resolution」）にローパスフィルタを適用します。
- 洗練（「2 --bin」パラメータ）をスピードアップするために2のビン係数を適用します。
- アライメントと平均の5回の繰り返し（ "1 --lastiter 5 --firstiter"パラメータ）を実行します。
- ステージII。この段階の目標は、視線ベクトル周りの角度を調整することです。入力ファイルは、ステップ3.1.9からの出力SELファイルである。
- と（b）で（ファイル名にタグ「_lp」と表記）は、ステップ3.1.9の最後の反復で生成された低域通過フィルタ処理MAPファイルを開くことによって、スパイクの正確な寸法を測定します。新たな実を生成空間マスクは、同様にスパイクを定義するが、膜と隣接するスパイクの大半を除外2.3に進む。
注：マスクの最適サイズは、スパイクの大きさや機能に依存します。 - 8度の角度サンプリング（パラメータ "--angles 8,8,8」）は、以前のように使用してください。
- スパイクビューベクトル（ " - alphalimit 180"パラメータ）を中心角で180度の変更を可能にするが、シータを保つとphi角度が固定された（パラメータが "0 --thetaphilimit」）。
- いずれの並進シフト（パラメータが「0 --shiftlimit」）を許可しないでください。
- の平均値（パラメータ "--symmetry"は省略）上の任意の対称性を与えたりしないでください。
- 不足しているウェッジを考慮するためのステップ2.4で生成された逆空間マスクを使用してください。
- 対称性のないステップ3.1.9の最後の反復で生成された2マップファイルを使用したテンプレート（パラメータRと（タグ、ファイル名に「even_nosym」と「odd_nosym」と表記）20; - それぞれTemplate1を」と「--Template2」）。
- アライメント偏りを防ぐために、最初の反復で、50オングストロームの分解能（パラメータ "--resolution」）にローパスフィルタを適用します。二つの独立した平均値のゴールドスタンダードフーリエシェル相関（FSC）に基づいて自動的に後続の反復におけるフィルタパラメータ（パラメータ "--adaptivefilter」）を調整します。 0.143-基準（パラメータ "--fsccrit 0.143"）を使用してください。 CTF補正が断層像に適用されていない限り、コントラスト伝達関数（CTF）（パラメータ "--minhires」）の最初のゼロを越えて洗練させないでください。
- （ 例えば 、パラメータ「6 --lastiter 15 --firstiter」）アラインメントの5-10回の反復を実行し、平均する。報告された解像度の変化を監視します。有意な変化は観察されない場合、処理は停止することができる。
- と（b）で（ファイル名にタグ「_lp」と表記）は、ステップ3.1.9の最後の反復で生成された低域通過フィルタ処理MAPファイルを開くことによって、スパイクの正確な寸法を測定します。新たな実を生成空間マスクは、同様にスパイクを定義するが、膜と隣接するスパイクの大半を除外2.3に進む。
- examiniによって構造に対称性の程度を評価スパイクが三量体複合体である場合には、 キメラ 。 例：中（ファイル名でタグ「_lp」と表記）を得られた低域通過フィルタ処理MAPファイルngを、3回対称性は明らかである。
- ステージIII。この段階の目標は、正しい対称性をさらに視線ベクトル周りの角度を調整することです。入力ファイルは、ステップ3.2.9からの出力SELファイルである。パラメータは、いくつかの例外を除いてステップ3.2と同じです。
- スパイク視線ベクトル周りの角度を適切に変更を許可します。例えば、構造が3回対称性を有する場合に、（パラメータ「60 --alphalimit」）、α角60度の変化を可能にする。
- 平均化する（パラメータ--symmetry c3を」）の正しい対称性（ 例えば 、C3）を適用します。
- 入力されたテンプレートファイル（パラメータ「--Template1」と、ステップ3.2.9（ファイル名に「偶数」タグで示され、「奇数」）の最後の反復で生成された2マップファイルを使用してください --Template2）。
- （ 例えば 、パラメータ「16 --lastiter 25 --firstiter」）アラインメントの5-10回の反復を実行し、平均する。報告された解像度の変化を監視します。有意な変化は観察されない場合、処理は停止することができる。
- IV期。この段階の目標は、正確に同時に3つのすべての角度を調整することです。入力ファイルは、ステップ3.4.4からの出力SELファイルです。パラメータは、いくつかの例外を除いてステップ3.4の場合と同様である。
- スパイクビューベクトル（ " - alphalimit 8"パラメータ）周りの角度は8度の変更を許可するとスパイク視線ベクトルの方向に8度の変化（パラメータが「8 --thetaphilimit」）。 4度の精度（パラメータ "--angles 8,8,8 --iterate 2」）に向きを絞り込む。
- （パラメータが「5 --shiftlimit」）小さな変化（ 例えば 、5画素）前の位置合わせの手順の不正確さを考慮することを許可する。
- Uステップ3.4.4の最後の反復で生成された2 MAPファイル（「偶数」のタグで示されると、ファイル名に「奇数 "）入力テンプレートファイル（パラメータ「--Template1」と--Template2）などのSE。
- （ 例えば 、パラメータ「26 --lastiter 35 --firstiter」）アラインメントの5-10回の反復を実行し、平均する。報告された解像度の変化を監視します。有意な変化は観察されない場合、処理は停止することができる。
テンプレートマッチングのためのウイルス表面への種子の4世代とアライメント
- テンプレートマッチングのためのビリオン表面上に均等に配置さの種を生成し、jviews.pyを実行することにより、種子への初期ビューベクトルを割り当てる。入力ファイルとしてステップ1.2.2で生成されたSTARファイルを使用します。スパイクの予想される数よりも約1.5倍の種を生成します。
注：このビューベクトルは各シード点に最も近いスパイクの方向を近似する。- 種子の、ほぼ球形のビリオン（パラメータ"--Even」）上に均一に分布した種子を生成する半径を（パラメータ" --radius」）を与えるために、分離角（ 例えば 20度） "20 --angle"（パラメータ）と中央がビリオンの座標。 たとえば 、ビリオンは250×250×250ピクセルの大きさのボックスのステップ1.2）の後に（中央に配置されている場合、中央の座標）が「125125125 --origin "125125125ピクセル（オプションです。
- 繊維状粒子上に均一に分布し、種子を生成するには、「--Filament "パラメータを使用して、半径ヘリカル対称性パラメータ（上昇とツイスト）の両方を指定します。
注：ヘリカル対称パラメータは、均等に分布し、シード位置を定義する便利な方法として、ここで使用され、それらは、フィラメント上のスパイクの実際の順序付けを反映する必要はありません。
- explaineなどのウイルス表面の二つの独立した平均値を生成するセクション2中のd。
- jsubtomo_evenodd.pyステップ4.1で生成されたSTARファイルを使用して「1」と「2」のセットに属するウイルス粒子を定義するSELファイルを生成する。
注：グループに、ビリオンの以前の割り当てをデータセットの独立性を確保するために「1」と「2」は、同じ滞在する必要があります。
- jsubtomo_evenodd.pyステップ4.1で生成されたSTARファイルを使用して「1」と「2」のセットに属するウイルス粒子を定義するSELファイルを生成する。
- 種子の位置を絞り込む。
- 特に明記しない限り、ステップ3.1の指示に従ってください。入力ファイルとしてステップ4.2.1で生成されたSELファイルを使用します。
- 種子がメンブレン（パラメータ "--zshiftlimit」）にのみ正常に沿ってシフトすることを許可します。ビリオンは理想球面ジオメトリから外れるどの程度に応じて、シフトの許容量を調整します（ 例えば 、パラメータが「25 --zshiftlimit）。
- ステップ4.2で生成された2のMAPファイルを使用--Tem「入力テンプレートファイル（パラメータとして（「偶数」タグと、ファイル名に「奇数」と表記）板1 "と--Template2）。
- （ 例えば 、パラメータ"--suffix _seeds」）元の入力STARのファイルが上書きされないように、一意のサフィックスを使用してください。
- 計算（「4 --bin」パラメータ）とローパスフィルタをスピードアップするために4のビニングを使用する（ 例えば 、パラメータ「--resolution 50」）。
- jviews.py（パラメータ"--cmm」）を使用して洗練されたシードSTARファイルのキメラマーカーファイル（CMM）は生成します。 キメラでCMMファイル（および関連するビリオンのMAPファイル）を開くことによって、種子を調べます。洗練された種子が正しくウイルス膜と比較して整列していることを確認してください。
注：別の色はマーカーの別個のセット（パラメータ "--color」）を区別するために使用することができます。代替的に洗練されたマーカーは、それらの相互相関係数（ 例えば 、パラメータ「--fomcolor 0.1,0.3」）に基づいて着色することができる。
5。ゴールドスタンドARD反復アライメントやスパイク構造の平均化
自動的に洗練された種子の周りにローカルテンプレートマッチングを用いてビリオンサブボリューム内のすべてのスパイクを見つけて位置してスパイクを合わせ、平均する。初期テンプレートとして手動で拾っスパイクのサブセットから生成された平均値を使用してください。
- プログラムjsubtomo_iterate_gold.pyを使用して、すべてのスパイクを平均化するために、種子の周りに地元のテンプレートマッチングを実行します。特に明記しない限り、ステップ3.5の指示に従ってください。
- 入力ファイルは、ステップ4.3で生成された洗練された種子のSELファイルです。
- 視線ベクトル角について十分に大きな制限を使用します。 例えば、種子が20度ごと（ステップ4.1）が発生した場合には、（パラメータが「12 --thetaphilimit」）は、この値の半分よりわずかに大きい角度を使用しています。スパイク視線ベクトル周りの角度を適切に変更を許可します。
- （パラメータの種が膜の平面にシフトすることを許可する「--xyshiftlimit」）。 たとえば 、種子から種子の距離が25ピクセルである場合に、これの半分よりわずかに合計シフト（ 例えばを使用し、パラメータ）が「6 --xyshiflimit 10 --shiftlimit」。
注：ステップ3.5で生成されたMAPファイルは、種子よりビリオン中心から異なる距離を中心としている場合は、追加の並進シフトが必要になることがあります。 - ステップ3.5で生成された2マップファイルを使用します（「偶数」のタグで示されると、ファイル名に「奇数 "）入力テンプレートファイル（パラメータ「--Template1」と--Template2）など。
- ステップ3.5（パラメータ--resolution）で生成されたマップ·ファイルの現在の解像度を使用してください。
- テンプレートマッチング、アライメントと平均の5〜10回の繰り返し（ "1 --lastiter 10 --firstiter」 などのパラメータ）を実行します。報告された解像度の変化を監視します。有意な変化は観察されない場合、処理は停止することができる。
- 各繰り返しの後重複ヒットが除外されています。 たとえば 、スパイクの幅が30ピクセルであれば、他のヒット（パラメータ"--mindist 30"）に30ピクセルよりも近いヒットを除外する。
- 共同効率的な低相互相関を持つヒットを除外します。たとえば、各ビリオン（パラメータ "--topp 75」）のための最高の75％のスパイクが含まれています。
注：低い相互相関の共同効率的で安打偽陽性ヒットを表す可能性が高い。
結果の可視化6。
- 可視化のためのキメラにスパイクの洗練された構造を開き、原子構造のフィッティング。
- 入力ファイルとしてステップ5.1.6で最後の繰り返しで作成された（タグ「LP」と表記）は、低域通過フィルタ処理MAPファイルを使用します。
- ツール「Mapに合わせる」 キメラで相互相関ベースのフィッティングのためのステップ5.1.6に示された解像度を使用してください。
- virioの複合モデルを作成します。nはjsubtomo_create_model.py使って。
- 入力MAPファイルとしてステップ5.1.6で最後の繰り返しで作成された（タグ「LP」と表記）は、低域通過フィルタ処理MAPファイルを使用します（パラメータ "--template」）。
- 入力STARのファイルとしてステップ5.1.6で最後の反復で生成されたSTARファイルを使用します。
- 複合モデル（パラメータ "--mask"）で密度の重複を考慮して、ステップ3.2.1で生成されたマスクファイルを使用します。
- 同じサイズの複合モデル（パラメータ "--size」）を生成するためにビリオンMAPファイルのサイズを指定します。
- キメラで可視化のための複合モデルを開きます。
Representative Results
私たちは、24セット 、以前に公開されたデータを使用してBunyamweraウイルス（Orthobunyavirus、 ブニヤウイルス科 ）のエンベロープ糖タンパク質複合体について上記に概説されたサブ断層アベレージングワークフローの適用を実証する。データ収集および精密化パラメーターを表1に示す。一つの代表的断層像は、 図2に示されている。
| パラメータ（単位） | 値 |
| データ収集 | |
| 電圧（kVの） | 300 |
| キャリブレーション済みの倍率（X） | 111000 |
| 画素サイズ（Å） | 5.4 |
| 推定線量（E - /Å2） | 100 |
| Underfocus（μm）と | 4.0〜4.5 |
| まずCTFゼロ（Å）A | 26-30 |
| チルト範囲（°） | -60-60 |
| チルトサンプリング（°） | 3 |
| データと洗練 | |
| 断層像 | 11 |
| ビリオン | 29 |
| ビリオンあたり種子 | 106 |
| 種子の総数 | 3074 |
| 検出されたスパイク | 1,346 |
| 重複を除去した後スパイク | 1,401 |
| 相互相関に基づく選択後にスパイク | 1022 |
| 最終的な平均に含まスパイク | 1022 |
| 対称性 | C3 |
| 角度サンプリング（°） | 8 |
| 解像度洗練で使用範囲（Å） | 42から334 |
| 最終的な解像度の見積もり（Å）B | 35 |
表1：Bunyamweraデータ収集及び精密化統計。
CTF、コントラスト伝達関数。
B 0.143の閾値で2つの独立して洗練された構造の間のフーリエシェル相関を用いて算出。
図2：Bunyamweraビリオンの断層を通じてスライス各ビリオンの周辺で明らかにいくつかのスパイクサイドビューは矢印で示されている。断層像は、低域60オングストローム濾過された。スケールバーは100nm。
まず、205手動で選んだスパイクを使用して初期モデルを（精製
図3：初期テンプレート構造の改良。 （A）は円筒はスパイクの手動で定義された位置から構築（C100）のテンプレートを平均した。（B）いずれかの対称性（C1）のない洗練された5回の三倍を付けて表示しスパイクを課した後の濃度を平均化対称特徴。モデルの解像度は48オングストロームである。スパイクの（C）の平均は、3回対称性を持つ洗練された5ラウンド後に41Åで決議した。
図4：種子の改良 （A）と（b）の後に洗練前の種子のAB）のサブセットは、図2から1ビリオン密度に示されている（B）中の種子は、それぞれのクロスに基づいて色分けされています相関係数（青、低い相関;赤、高い相関）。
（重複を除去した後、トップ75％;〜千スパイク）最高の相関糖タンパク質スパイクパッチは、最終的な平均を計算するために使用した。平均値は、35オングストロームの分解能（ 図5）に解決されました。それは、途中で三量体スパイク構造を明らかにした6近隣のスパイクからいくつかの貢献に加えて。既知の位置に構造を配置することによって計算されたビリオンの複合モデルは、（ 図6A）、ビリオン表面上のスパイクの配置を明らかにした。時折、スパイクのローカルに順序付けられたパッチは、（ 図6B）明らかであった。
図5：テンプレートマッチング後の糖タンパク質スパイク層のパッチの洗練された構造。 「偶数」および「奇数」（AB）2マップデータの両半分からの再構成が示されている。 2マップは、アプローチの妥当性を検証する、注目すべき程度の類似性を示している。 2マップは、互いに完全に独立して再構築されてきたように、スパイク長軸周りの向きが異なっている。 （C）は、2つのマップの平均はで示されている35オングストロームの最終的な解決。
図6：Bunyamweraビリオン上のスパイクの配置。 （A）ビリオンの複合モデル。ビューベクトル（スティック）がスパイクの向きを示している。色は各スパイクやテンプレート構造間の相互相関を示している。（青、低い相関;赤、高い相関を）、（B）のスパイクの順序付きパッチのクローズアップ。
Discussion
ビリオン膜上のウイルス糖タンパク質スパイク構造の知識は、ウイルス複製を理解し、治療し、感染を防ぐために治療薬を開発するために不可欠である。単一粒子の平均と組み合わさ電子低温顕微鏡法は、糖タンパク質スパイクを含むエンベロープウイルス粒子の構造を解決するために最も利用される方法として出現した。しかし、この方法は、対称ウイルスicosahedrallyに制限される。ここでは、Jsubtomoの電子クライオトモグラフィーとsubtomogram平均を適用することにより、私たちは他の現在の構造生物法に適さない多形性エンベロープウイルスに糖タンパク質スパイクを決定するための一般的なプロトコルを概説している。当社の代表的な結果は、この方法の解像度はドメイン構造、オリゴマー化、および無傷のビリオン上の糖タンパク質スパイクのより高次の組織への洞察を明らかにするのに十分であることを示している。
jove_contentは ">このプロトコルの中で最も重要なステップは、互いに統計的に独立した2つの信頼性の出発モデルを構築し、このステップが正常に実行は個人のスパイクができるように、糖タンパク質スパイクが、きつくお互いに詰め十分に大きくしていないことを前提としてい視覚的に認識され、手動で断層像で撮像し、2つの独立したモデルが平均化される。これが不可能な場合は、プロトコルの2つの修正を図ることができる。まず、二つの独立したランダムなモデルが最初にsubtomogramsの2つのランダムなサブセットを定義し、構築することができるこれらのサブセット30内subtomogramsを平均化する。第二 に、孤立したスパイクの構造はX線結晶学により、例えば、他の手段によって導出された場合には、開始モデルとして用いることができるが、注意が低·に注意しなければならない洗練された次のラウンドに2つの結果のモデルが意志としてこのモデルは、低解像度のカットオフ（50〜70オングストローム）を使用して、フィルタを通過これだけの解像度を超えて統計的に独立している。この警告のために、前者のアプローチをお勧めします。このプロトコルから得られる分解能は四大要因に依存して、i。データ収集の戦略と入力データの品質こと、ii。 subtomograms数、III。アライメントsubtomogramsの正確性、およびiv。構造の不均一性。第一及び第二の制限は、主に高い信号対雑音直接電子CTFと組み合わせた検出器断層撮影法を修正し、自動データ収集を使用することによって克服することができるが、位置合わせ精度がさらに関心自体の構造のサイズおよび形状に影響される。顕著な特徴を欠いている小さなスパイクでこのプロトコルを適用する場合は、アライメント精度、したがって、分解能31を改善するためにスパイクにFabフラグメントを結合することが有利で あり得る。最後に、構造体は、平均化される場合は、出品物の複数の立体配座、サブtomogr午前分類方法は、個別に異なるコンホメーションを平均化するために使用することができる。そのために、Jsubtomoは強力subtomogram分類9を提供し、ディナモ·パッケージに統合されています。
上記のプロトコルは、単離されたウイルス糖タンパク質のX線結晶学に相補的である。結晶構造は、ビリオン膜に対する糖タンパク質の正確な配向を得るために、サブ断層像の平均に嵌合することができる。この方法論の適用は、間違いなくエンベロープウイルスの構造と病理生物学に光を当てるしていきます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
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