Abstract
Höljeförsedda virus utnyttjar membranglykoproteiner på sin yta för att mediera inträde i värdceller. Tredimensionell strukturanalys av dessa glykoprotein "spikes" är ofta tekniskt utmanande men viktigt för att förstå viral patogenes och läkemedelsdesign. Här är ett protokoll presenteras för viral spik strukturbestämning genom beräkningsmedelvärdes av elektron Cryo-tomografi uppgifter. Elektron Cryo-tomografi är en teknik i elektronmikroskop används för att härleda tredimensionella tomografiska volym rekonstruktioner eller tomogram, av pleomorfa biologiska prover såsom membran virus i en nästan infödda, frysta hydrerad tillstånd. Dessa tomogram avslöjar strukturer av intresse i tre dimensioner, om än i låg upplösning. Beräkningsmedelvärdesunder volymerna eller under tomogram, krävs för att uppnå högre upplösning detalj av upprepande strukturella motiv, såsom virala glykoprotein spikar. En detaljerad beräkningsmetoden för aligning och genomsnitt under tomogram använder Jsubtomo programpaket skisseras. Detta tillvägagångssätt möjliggör visualisering av strukturen av virala glykoprotein spikar till en resolution i intervallet 20-40 Å och studier av studiet av högre ordning spike-to-spik interaktioner på virionens membranet. Typiska resultat presenteras för Bunyamwera virus, ett höljevirus från familjen Bunyaviridae. Denna familj är en strukturellt skiftande grupp av patogener som utgör ett hot mot människors och djurs hälsa.
Introduction
Elektron Cryo-tomografi är en elektron Cryo-mikroskopi bildteknik som gör det möjligt att beräkna ett tredimensionellt (3D) rekonstruktion av komplexa biologiska prover. Lämpliga prover varierar från renade makromolekylära komplex 1, filament 2, belagda vesiklar 3 och pleomorfa membranvirus fyra till hela prokaryota celler 5 och till och med tunna områden i hela eukaryota celler 6. Efter insamling av en lutning-serien, 3D tomografiska volymer eller tomogram uppgifter, kan beräknas med hjälp av flera etablerade programvarupaket, inklusive Bsoft 7 och IMOD 8.
Två aspekter inneboende för studier av biologiska prover genom elektron Cryo-tomografi gränsen den biologiska tolkningen av motsvarande tomografiska volymer. Först, på grund av den begränsade elektron dos som kan tillämpas på biologiska material innan man inför betydande skada strålning, signal-till-brus-förhållanden i tomografiska data som är typiskt mycket låg. För det andra, på grund av begränsat urval lutningsgeometrin under datainsamling, vissa vyer av objektet förblir frånvarande, vilket leder till ett så kallat "saknade wedge" artefakt i tomografisk volymen. Däremot kan båda dessa begränsningar övervinnas om tomografiska volymen innehåller upprepande identiska strukturer, såsom makromolekylära komplex, som kan vara framgångsrikt i genomsnitt 9-12.
Före medelvärdes strukturer från tomogram rekonstruktioner, måste objekt av intresse hittas och anpassas till samma orientering. Lokalisera sådana strukturer kan uppnås genom korskorrelation av en mallstruktur i det tomografiska volym med användning av ett tillvägagångssätt som ofta hänvisas till som mall matchning 13. Den mall som används i denna matchningsprocess kan härledas från elektron Cryo-mikroskopi eller elektron Cryo-tomografi kombination med 3D-rekonstruktion, eller det kan vara en täthet karta simuleras frånett atomstruktur. Flera beräknings paket har utvecklats för att utföra dessa uppgifter 11.
Medelvärde av glykoprotein spikar av membran virus, såsom HIV-1, har varit en särskilt framgångsrik metod för att studera deras struktur 14-16. En förståelse av strukturen är i ett stycke för att avslöja både den molekylära grunden för virus-värdinteraktioner och leds antivirala och vaccin design utveckling. Även makromolekylära kristallografi är den teknik val för hög upplösning (oftast bättre än 4 Å) strukturell analys av enskilda virala glykoproteiner och deras komplex, röntgenstrukturer som följer av denna metod är av proteiner isolerade från den naturliga membranmiljön på virionens . Sålunda viktiga detaljer såsom den högre ordning arkitektur av virala glykoproteiner, inom ramen för virionen, förbli saknas. Å andra sidan, elektron kryo-mikroskopi och enda partikel återuppbyggnadav hela virus med hölje är begränsad till virioner med ikosahedra symmetri 17,18. Elektron cryotomography kombination med undervolym anpassning har alltså vuxit fram som en kompletterande teknik som gör det möjligt att studera glykoprotein spikar av oregelbundet formade, pleomorfa virus i situ.
Vi har utvecklat programvara som heter Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) för påvisande, justering och medelvärdesbildning av tomografiska under volymer. Jsubtomo har utnyttjats i strukturen bestämningen av ett antal cellulära och virala strukturerna 19-26. Här redogör vi för ett detaljerat protokoll som gör det möjligt för bestämning viral-yta spik strukturer. För att kringgå över förfining av medelvärdes strukturer genom att korrelera buller, är den "guldstandard" förfining som antogs 10,27. Slutligen strategier för visualisering och tolkning av typiska resultat diskuteras.
Protocol
Ett detaljerat protokoll för beräknings inriktning och efterföljande medelvärdes av virala glykoprotein spikar skisseras. Protokollet följer arbetsflödet som illustreras i figur 1 och kombinerar en automatisk sökning efter de spikar som använder initiala mallstrukturer och en guld-standardstruktur förfining.
Indata för detta protokoll är en uppsättning av tomografiska rekonstruktioner av virionema. En tomogram innehåller ett eller flera virioner. Initialt är en liten delmängd av spikar manuellt plockas och används i genomsnitt och förädla två oberoende modeller. Dessa modeller används för att automatiskt lokalisera spikar på samtliga virioner. Slutligen två oberoende förfiningar springa och de resulterande medelvärdena jämförs och kombineras för att producera den slutliga strukturen.
Förädlingen strategi visas genom att använda program från Jsubtomo paketet. Program från Bsoft paketet 28 används för allmän bild processing uppgifter och molekylära grafikpaket UCSF Chimera 29 används för att visualisera resultaten. Namnen på individuella program ges i kursiv stil och filformat betecknas med versaler filnamnstillägg.
Figur 1:.. Allmän strategi för att bestämma strukturer glykoprotein spik komplex från pleomorfa membran virus Siffrorna motsvarar olika avsnitt i protokollet Klicka här för att se en större version av denna siffra.
1 Extrahera Virusunder volymer från Full-size tomogram
- Plocka viruspartiklar manuellt i tomogram.
- Öppna en tomogram fil i bshow. Definiera centrum koordinaten för ett virus particle med hjälp av partikelplockverktyg. Upprepa detta tills alla virioner har behandlats. Spara virus koordinater i en STAR-fil.
- Upprepa steg 1.1.1 tills alla tomogram har behandlats. Anteckna virionets diameter i pixlar.
OBS: Om spikarna är svåra att se i tomogram, använd bfilter till lågpassfilter på tomogram till 80-Å upplösning (parameter "-bandpass 80,10000").
- Kör jsubtomo.py i extrakt läge (parameter "--mode extrakt") för att extrahera virion under volymer till individuella volymfiler. Använd STAR-filer sparade i steg 1.1.1 som indatafiler.
- Ge en storlek (parameter "--size") ~ 25% större än den största virus i datamängden. Om t.ex. virionen är ~ 200 pixlar i diameter, används storlek 250 x 250 x 250 pixlar.
- Utdatafiler virionets volymerna kommer att vara i MAP-format. Dessutom skapar en medföljande STAR-fil för varje virus volym (Parameter "--output").
- Normalisera virionens volymer bimg (parameter "-rescale 0,1").
2 Generation två oberoende Initial modeller
- Plocka en delmängd av spikar i virionet undervolymer.
- Öppna en virion undervolym MAP-fil i bshow. Definiera centrum koordinaten för en spik med hjälp av partikelplockverktyg, tillgängligt via Toolbox fönstret. Upprepa detta tills alla klart distinkta spikar har behandlats. Spara spik koordinater i en STAR-fil.
- Om nödvändigt, upprepa steg 2.1.1 för andra virioner till ca 200 glykoprotein spikar har behandlats. Observera spik mått i pixlar.
NOT: ~ 200 spikar är en grov riktlinje och mer kan krävas för vissa tillämpningar. Om möjligt, strävar efter att plocka spikar i olika riktningar. Undvik att plocka bara topp vyer.
- Tilldela en första uppfattning vektor till spikarna genom att köra jviews.py. Använd STAR-filer som genereras i steg 2.1.1 som indatafiler.
OBS: Denna uppfattning vektor approximerar riktningen på spiken med hänvisning till virionen.- Använd den centrala koordinat att tilldela vyerna för en sfärisk virion. Till exempel, om virionen är centrerad (efter steg 1.2) i en låda med en storlek på 250 x 250 x 250 pixlar, är den centrala koordinat 125.125.125 pixlar (option "--Radial 125.125.125").
- För att tilldela vyer för en fintrådiga virus, öppna varje virion under volym i bshow med hjälp av STAR-filen som definieras i steg 2.1.1 som ingångsfilen. Definiera två ändpunkter filamentet med hjälp av fila dyrkverktyg och spara STAR filen. Upprepa detta tills alla STAR-filer har uppdaterats och kör jviews.py använder de uppdaterade STAR-filer som indatafiler (--option Segment).
- Generera en riktig rymdmask med hjälp jsubtomo_create_mask.py. Se till att den verkliga rymd masken är av samma Dimensjoner som kommer att användas för den genomsnittliga strukturen (se 2.6.2) och är tillräckligt stort för att rymma både spik och en lapp av det underliggande membranet.
- Generera en ömsesidig rymdmask med hjälp jsubtomo_create_wedgemask.py. Den reciproka rymden mask används för att utesluta områden i "saknade kilen" region till följd av enskild axel insamlingen tomografisk data. Se till att det är av samma dimensioner som kommer att användas för den medelvärdes struktur (se 2.6.2).
- Skapa ett urval fil (SEL-fil) som definierar virioner tillhör set "1" och "2" med jsubtomo_evenodd.py och STAR-filer som genereras i steg 2.2.
- Generera två initiala medelvärden med hjälp jsubtomo_create_averages.py.
- Använd SEL fil som genereras i steg 2.5 som ingångsfilen.
- Ge en storlek (parameter "--size") minst 32 pixlar större än den största dimensionen i spetsen. T.ex. om spiken är ~ 40 pixlar långt, använd storlek 72 x 72 x 72 pixlar.
- Applicera en hög symmetri (t.ex. c100) på medelvärden (parameter "--symmetry c100"), för att approximera en cylindrisk genomsnitt runt långaxel spetsen. Använd symmetrization att minska bullret i de inledande snitten.
- Ge ett unikt namn för produktionen filer i projektet (parameter "--suffix").
- Använd den verkliga rymdmasken genereras i steg 2.3 för att maskera bort bakgrunden (parameter "--mask"). Använd den reciproka rymden masken genereras i steg 2.4 redogöra för signalförlust infördes genom närvaron av en saknad kil (parameter "--Mask").
3 Guld-standard Iterativ Alignment och medelvärde av de två ursprungliga Spike modeller
Iterativt anpassa och genomsnitt de två inledande modellerna som genererats i avsnitt 2 med jsubtomo_iterate_gold.py.
- Steg I. Målet med detta steg är att förfinariktning av vyn vektor. Ingångs filen är SEL fil som genereras i steg 2.5.
- Använd en 8-graders vinkel provtagning (parameter "--angles 8,8,8").
- Tillåt 16-graders förändringar i riktning mot piken vy vektorn (parametern "--thetaphilimit 16") men hålla vinkeln runt spik lång axel fast (parametern "--alphalimit 0").
- Låt små translation skift (t.ex. 5 pixlar) redogöra för felaktigheter i manuell plockning av spikar (parameter "--shiftlimit 5").
- Applicera en hög symmetri (t.ex. c100) på medelvärden (parameter "--symmetry c100"), för att approximera en cylindrisk genomsnitt runt långaxel spetsen.
OBS: Symmetrization används för att minska bullret i genomsnitt. - Använd den verkliga rymdmasken och reciproka rymden masken genereras i steg 2.3 och 2.4 för att maskera bort omgivande spikar och redogöra för de saknade kilen (parametrar "--mbe "och" --Mask ", respektive).
- Använd de två kartfiler som genereras i 2.6 (betecknas med taggar "till och med" och "udda" i filnamnet) som mallar (parametrar "--Template1" och "--Template2", respektive).
- Applicera ett lågpassfilter vid 50-Å-upplösning (parametern "--resolution") för att förhindra inriktnings bias.
- Applicera ett bin faktor på 2 för att påskynda förfining (parameter "--bin 2").
- Kör fem iterationer av anpassning och genomsnitt (parametrar "--firstiter 1 --lastiter 5").
- Steg II. Målet med detta steg är att förfina vinkel runt vy vektorn. Indatafilen är utsignalen SEL-filen från steg 3.1.9.
- Mät de exakta dimensionerna hos den spik genom att öppna lågpassfiltrerade MAP fil som genereras i den sista iterationen i steg 3.1.9 (betecknas med etiketten "_lp" i filnamnet) i bshow. Skapa en ny riktigspace mask på liknande till steg 2.3 som definierar spik men utesluter de flesta av membran och angränsande spikar.
OBS: Den optimala storleken på masken beror på storleken och funktioner i spik. - Använd 8-graders vinkel provtagning (parameter "--angles 8,8,8") som tidigare.
- Låt 180-graders förändringar i vinkel runt spik view vektorn (parameter "- alphalimit 180") men behålla theta och phi vinklar fast (parameter "--thetaphilimit 0").
- Låt inte några translation skift (parameter "--shiftlimit 0").
- Applicera inte någon symmetri på medelvärden (utelämnar parametern "--symmetry").
- Använd den reciproka rymden masken genereras i steg 2.4 redogöra för kilen saknas.
- Använd de två kartfiler som genererats i den senaste iteration av steg 3.1.9 utan symmetri (betecknas med tags "even_nosym" och "odd_nosym" i filnamnet) som mallar (parametrar R20; - Template1 "och" --Template2 ", respektive).
- Applicera ett lågpassfilter vid 50-Å upplösning (parameter "--resolution") i den första iterationen att förhindra anpassningen bias. Justera filterparametrarna i de efterföljande iterationer automatiskt (parameter "--adaptivefilter") baserad på guldstandard Fourier Shell Korrelation (FSC) mellan de två oberoende medelvärden. Använd 0,143-kriteriet (parameter "--fsccrit 0,143"). Låt inte förfining förbi den första nollan i kontrastöverföringsfunktionen (CTF) (parameter "--minhires"), om inte CTF korrigering har tillämpats på tomogram.
- Springa 5-10 iterationer av anpassning och i genomsnitt (t.ex. parametrar "--firstiter 6 --lastiter 15"). Övervaka förändringarna i rapporterade upplösningen. Då inga väsentliga förändringar observeras, kan processen stoppas.
- Mät de exakta dimensionerna hos den spik genom att öppna lågpassfiltrerade MAP fil som genereras i den sista iterationen i steg 3.1.9 (betecknas med etiketten "_lp" i filnamnet) i bshow. Skapa en ny riktigspace mask på liknande till steg 2.3 som definierar spik men utesluter de flesta av membran och angränsande spikar.
- Bedöm graden av symmetri i strukturen genom examining den resulte lågpassfiltrerade MAP-fil (betecknas med tag "_lp" i filnamnet) i chimär. T.ex. om spiken är en trimer komplex, bör 3-faldig symmetri vara uppenbart.
- Steg III. Målet med detta steg är att förfina vinkel runt vyn vektor ytterligare med rätt symmetri. Indatafilen är utsignalen SEL-filen från steg 3.2.9. Parametrarna är desamma som i steg 3,2 med några undantag:
- Tillåt lämpliga förändringar i vinkel runt spik view vektorn. Till exempel, om strukturen har 3-faldig symmetri, tillåta ändringar av 60 grader i alfavinkel (parameter "--alphalimit 60").
- Applicera rätt symmetri (t.ex. c3) på medelvärden (parameter --symmetry c3 ").
- Använd de två kartfiler som genererats i den senaste iterationen i steg 3.2.9 (betecknas med tags "även" och "udda" i filnamnet) som ingång mallfiler (parametrar "--Template1" och --Template2).
- Springa 5-10 iterationer av anpassning och i genomsnitt (t.ex. parametrar "--firstiter 16 --lastiter 25"). Övervaka förändringarna i rapporterade upplösningen. Då inga väsentliga förändringar observeras, kan processen stoppas.
- Steg IV. Målet med detta steg är att noggrant förfina alla tre vinklar samtidigt. Indatafilen är utsignalen SEL-filen från steg 3.4.4. Parametrarna är desamma som i steg 3.4 med några undantag:
- Tillåt 8-graders förändringar i vinkel runt spik vy vektorn (parametern "- alphalimit 8") och 8-graders förändringar i riktning mot piken vy vektor (parameter "--thetaphilimit 8"). Förfina riktlinjerna till 4 graders noggrannhet (parametrar "--angles 8,8,8 --iterate 2").
- Tillåt små förskjutningar (t.ex. 5 pixlar) redogöra för felaktigheter i tidigare inriktningssteg (parameter "--shiftlimit 5").
- Usyns de två kartfiler som genererats i den senaste iterationen i steg 3.4.4 (betecknas med taggar "till och med" och "udda" i filnamnet) som ingång mallfiler (parametrar "--Template1" och --Template2).
- Springa 5-10 iterationer av anpassning och i genomsnitt (t.ex. parametrar "--firstiter 26 --lastiter 35"). Övervaka förändringarna i rapporterade upplösningen. Då inga väsentliga förändringar observeras, kan processen stoppas.
4 Generation och Anpassning av utsäde till Virus Yta för Mall Matching
- Generera frön som ligger jämnt på virionens yta för mallmatchning och tilldela en första uppfattning vektor till fröna genom att köra jviews.py. Använd STAR-filer som genereras i steg 1.2.2 som indatafiler. Generera cirka 1,5 gånger fler frön än det förväntade antalet spikar.
OBS: Denna uppfattning vektor approximerar riktning spetsen närmast varje frö punkt.- För att generera jämnt fördelade frön på ett ungefärligt sfäriskt virus (parameter "--Even"), ger radien (parameter "--radius"), vinkelseparation (t.ex., 20 grader) av fröna (parameter "--angle 20" ) och den centrala koordinat virionets. Om t.ex. virionen är centrerad (efter steg 1.2) i en låda med en storlek på 250 x 250 x 250 bildpunkter, den centrala koordinaten är 125.125.125 pixlar (option "--origin 125.125.125") .
- För att generera jämnt fördelade frön på en filamentös partikel, använda parametern "--Filament" och ange både radie och spiralformade symmetri parametrar (stigning och twist).
OBS: De spiralformade symmetri parametrar används här endast som ett bekvämt sätt att definiera jämnt fördelade utsäde positioner och de behöver inte återspegla det verkliga beställning av spikar på glödtråden.
- Generera två oberoende medelvärden av virusets yta som explained i avsnitt 2.
- Generera en SEL-fil som definierar virioner tillhör set "1" och "2" med jsubtomo_evenodd.py och STAR-filer som genereras i steg 4.1.
OBS: För att säkerställa oberoende datamängder, något tidigare uppdrag av virioner i grupper "1" och "2" skall fortsätta att gälla.
- Generera en SEL-fil som definierar virioner tillhör set "1" och "2" med jsubtomo_evenodd.py och STAR-filer som genereras i steg 4.1.
- Begränsa positionen av fröna.
- Följ anvisningarna i steg 3.1 om inte annat anges. Använd SEL fil som genereras i steg 4.2.1 som ingångsfilen.
- Tillåt fröna att förskjuta endast längs den normala till membranet (parameter "--zshiftlimit"). Justera den tillåtna mängden förskjutning beroende på hur mycket de virioner avvika från ideal sfärisk geometri (t.ex. --zshiftlimit parameter 25 ").
- Använd de två MAP-filer som genereras i steg 4.2 (betecknas med taggar "till och med" och "udda" i filnamnet) som indata mallfiler (parametrar "--Template1 "och --Template2).
- Använd ett unikt suffix för att undvika att skriva över den ursprungliga ingången STAR-filer (t.ex. parameter "--suffix _seeds").
- Använd binning av 4 för att påskynda beräkningen (parameter "--bin 4") och ett lågpassfilter (t.ex. parametern "--resolution 50").
- Generera Chimera markör filer (CMM) av de raffinerade utsädes STAR filer med jviews.py (parameter "--cmm"). Undersök frön av öppna CMM filer (och tillhörande virus MAP-filer) i chimär. Se till att raffinerade fröna hamnar rätt i förhållande till virusmembranet.
OBSERVERA: Olika färger kan användas för att differentiera separata uppsättningar markörer (parametern "--color"). Alternativt de raffinerade markörer kan färgas baserat på deras korskorrelationskoefficienten (t.ex. parametern "--fomcolor 0.1,0.3").
5. Guld-stativard Iterativ Inriktning och medelvärde av Spike Struktur
Lokalisera automatiskt alla spikar i virionens under volymer med hjälp av lokala mallmatchning runt raffinerade fröna och rikta och genomsnittet i placerade spikar. Använd medel genereras från en delmängd av manuellt plockade spikar som initiala mallar.
- Utför lokal mall matchning runt fröna i genomsnitt alla spikar med program jsubtomo_iterate_gold.py. Följ anvisningarna i steg 3.5 om inte annat anges.
- Ingångs filen är SEL-filen för raffinerade frön som genereras i steg 4.3.
- Använd en tillräckligt stor begränsning för vyn vektorvinkeln. Om t.ex. frön genererades var 20 grader (steg 4.1), använd en vinkel något större än hälften av detta värde (parameter "--thetaphilimit 12"). Tillåt lämpliga förändringar i vinkel runt spik view vektorn.
- Tillåt frön att skifta i planet för membranet (parameter"--xyshiftlimit"). T.ex., om utsädet till säd avståndet är 25 pixlar, använd total övergång drygt hälften av detta (t.ex. parametrar "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
OBS: Ytterligare translation skift kan behövas om MAP-filer som genereras i steg 3,5 är centrerade på ett annat avstånd från virus centrum än fröna. - Använd de två MAP-filer som genereras i steg 3,5 (betecknas med taggar "till och med" och "udda" i filnamnet) som ingång mallfiler (parametrar "--Template1" och --Template2).
- Använd den aktuella upplösningen av MAP-filer som genereras i steg 3,5 (parameter --resolution).
- Springa 5-10 iterationer av mallmatchning, anpassning och medelvärdes (t.ex. parametrar "--firstiter 1 --lastiter 10"). Övervaka förändringarna i rapporterade upplösningen. Då inga väsentliga förändringar observeras, kan processen stoppas.
- Efter varje iteration, Utesluta överlapp träffar. T.ex., om bredden på spiken är 30 pixlar, utesluta hits som är närmare än 30 bildpunkter till andra hits (parameter "--mindist 30").
- Uteslut hits med en låg korskorrelationskoefficient. Till exempel innefattar de bästa 75% spikar för varje virus (parameter "--topp 75").
OBS: Träffar med låg korskorrelationskoefficient sannolikt att representera falska positiva träffar.
6 Visualisering av resultat
- Öppna raffinerade struktur spik i chimären för visualisering och montering av atomstrukturer.
- Använd lågpassfiltrerade MAP-fil (betecknas med tag "lp") skapas i den sista iterationen i steg 5.1.6 som ingångsfilen.
- Använd upplösningen anges i steg 5.1.6 för korskorrelation baserat montering i chimär "Fit in Map" verktyg.
- Skapa en sammansatt modell av virion använder jsubtomo_create_model.py.
- Använd lågpassfiltrerade MAP-fil (betecknas med tag "lp") skapas i den sista iterationen i steg 5.1.6 som ingångs MAP filen till (parameter "--Template").
- Använd en STAR fil som genereras på den slutliga iterationen i steg 5.1.6 som ingångs STAR filen.
- Använd masken fil som genereras i steg 3.2.1 redogöra för överlappande tätheter i den sammansatta modellen (parameter "--mask").
- Indikera storleken på virionet MAP-fil för att alstra en sammansatt modell av samma storlek (parameter "--size").
- Öppna den sammansatta modellen för visualisering i chimär.
Representative Results
Vi visar tillämpningen av under tomogram medelvärdes arbetsflöde beskrivs ovan för kuvertet glykoprotein komplex av Bunyamwera virus (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) med hjälp av en tidigare publicerade data set 24. Datainsamling och förfining parametrar är listade i tabell 1. En representativ tomogram visas i figur 2.
| Parameter (enhet) | Värde |
| Datainsamling | |
| Spänning (kV) | 300 |
| Kalibrerad förstoring (X) | 111.000 |
| Pixelstorlek (Å) | 5,4 |
| Beräknad dos (e - / Å 2) | 100 |
| Underfocus (| im) | 4,0-4,5 |
| Första CTF noll (Å) en | 26-30 |
| Lutning (°) | -60-60 |
| Tilt provtagning (°) | 3 |
| Data och förfining | |
| Tomogram | 11 |
| Virioner | 29 |
| Frön per virion | 106 |
| Totalt antal frön | 3074 |
| Spikes detekteras | 1346 |
| Spikes efter borttagning lappningar | 1401 |
| Spikes efter korskorrelering baserade urval | 1022 |
| Spikes ingår i slut genomsnittet | 1022 |
| Symmetri | C3 |
| Vinkel provtagning (°) | 8 |
| Upplösningintervall som används i förfining (Å) | 42-334 |
| Slutlig upplösning uppskattning (Å) miljarder | 35 |
Tabell 1: Bunyamwera datainsamling och förfining statistik.
en CTF, kontrastöverföringsfunktion.
b Beräknat med Fourier skal korrelation mellan två oberoende raffinerade strukturer på ett tröskelvärde på 0,143.
Figur 2:. Skiva genom ett tomogram av Bunyamwera virioner Flera spik sidovyer uppenbara i periferin på varje virion indikeras med pilhuvuden. Den tomogram har varit låg-pass filtrerad till 60 Å. Scale bar 100 nm.
Först vi förfinat en första modell med 205 manuellt plockade spikar (
Figur 3: Förädling av den initiala mallstruktur. (A) Cylindrisk genomsnitt (C100) mall konstruerad av manuellt definierade positioner för spikar. (B) Genomsnittlig täthet efter fem omgångar av förfining utan symmetri (C1) infördes visar en spik med trefaldigtsymmetriska funktioner. Upplösningen på modellen är 48 Å. (C) Genomsnitt av spiken löstes vid 41 Å efter fem omgångar av förfining med trefaldig symmetri.
Figur 4:. Förädling av fröna AB) En undergrupp av utsäde före (A) och efter (B) förfining visas på en virus densitet från figur 2 Seeds i (B) har färgkodade utifrån respektive tvär. korrelationskoefficienter (blå, låg korrelation, röd, hög korrelation).
De bästa korre glykoprotein spik plåster (topp 75% efter att ta bort överlappningar, ~ 1.000 spikar) användes för att beräkna det slutliga genomsnitts. Den genomsnittliga beslutades att 35-Å upplösning (Figur 5). Den avslöjade en trimer spik struktur i mitten, iFörutom vissa bidrag från sex grann spikar. Komposit modeller av virionerna, beräknade genom att placera strukturen i de kända positionerna avslöjade placering av spikar på virionens yta (figur 6A). Ibland lokalt ordnade fläckar av spikar var tydliga (figur 6B).
Figur 5: Raffinerad strukturen av ett plåster av glykoprotein spik skiktet efter mallmatchning. (AB) Två kartor "med" och "udda", rekonstruerade från två halvorna av data visas. De två kartorna visar en anmärkningsvärd grad av likhet, verifiera validness av inflygningen. Orienteringen runt spik långa axeln är olika som de två kartorna har rekonstruerats helt oberoende av varandra. (C) Genomsnitt för de två kartorna visas viden slutlig lösning av 35 Å.
Figur 6: Placering av spikar på Bunyamwera virionen. (A) Sammansatt modell av en virion. Se vektorer (pinnar) anger riktlinjerna i spikar. Färgerna indikerar korskorrelationen mellan varje spik och mallstrukturen (blå, låg korrelation, röd, hög korrelation). (B) En närbild av en ordnad korrigering av spikar.
Discussion
Kunskap om viral glykoprotein spik struktur på virionens membranet är nödvändig för att förstå virusreplikation och utveckla läkemedel för att behandla och förebygga infektioner. Elektron Cryo-mikroskopi kombinerat med enda partikel medelvärdes har blivit den mest använda metoden för att lösa strukturer omhöljda viruspartiklar, inklusive glykoprotein spikar. Dock är denna metod begränsad till icosahedrally symmetriska virus. Här, genom tillämpning av elektron Cryo-tomografi och subtomogram medelvärdes i Jsubtomo, har vi sammanställt ett allmänt protokoll för bestämning glykoprotein spikar på pleomorfa virus med hölje som inte är mottagliga för andra aktuella strukturbiologiska metoder. Våra representativa resultat visar att utgången av denna metod är tillräcklig för att avslöja insikter domänarkitektur, oligomerisering och högre ordningens organisation glykoprotein spikar på intakta virioner.
jove_content "> Det mest kritiska steget i detta protokoll är att konstruera två modeller tillförlitliga utgångs som statistiskt oberoende av varandra. Framgångsrikt genomförande av detta steg förutsätter att glykoprotein spikar är tillräckligt stora och inte packas mot varandra för hårt, så att enskilda spikar kan visuellt erkännas och manuellt plockas i tomogram, och två oberoende modeller genomsnitt. Om detta inte är möjligt, två ändringar i protokollet kan försök. Först två oberoende slumpmodeller kan konstrueras genom att först definiera två slump delmängder av subtomograms och sedan medelvärdes subtomograms inom dessa undergrupper 30. det andra, om en struktur av den isolerade spik har härletts med andra medel, till exempel genom röntgenkristallografi, kan den användas som en startmodell. Emellertid måste försiktighet iakttas för att låg- lågpassfilter denna modell med en lågupplöst cut-off (50-70 Å), eftersom de två resulterande modellerna i nästa omgång av förfining kommervara statistiskt oberoende endast bortom denna resolution. På grund av detta förbehåll är det tidigare tillvägagångssätt rekommenderas.Den kan erhållas upplösning från detta protokoll beror på fyra viktiga faktorer: i. datainsamling strategi och kvaliteten på indata, ii. antal av de subtomograms, iii. inriktnings noggrannhet subtomograms, och iv. heterogenitet av strukturerna. Medan den första och andra begränsningar kan till stor del övervinnas genom användning av höga signal-till-brus direkt elektrondetektorer i kombination med CTF korrigerade tomografi och insamling automatiserade uppgifter, är inriktnings noggrannheten ytterligare påverkas av storleken och formen på strukturen av intresse i sig. Vid tillämpning av detta protokoll om små spikar som saknar framträdande, kan det vara fördelaktigt att binda Fab-fragment i spetsen för att förbättra anpassningen noggrannhet och därmed upplösning 31. Slutligen, om de strukturer som medelvärdet uppvisar flera konformationer, under tomogram klassificeringsmetoder får användas för att i genomsnitt olika konformationer för sig. För detta ändamål Jsubtomo integrerar med Dynamo paket, som erbjuder effektiv subtomogram klassificering 9.
Det ovanstående protokollet är komplementär till röntgenkristallografi av isolerade virala glykoproteiner. Kristallografiska strukturer kan passas in medelvärden under tomogram för att erhålla den exakta orienteringen av glykoproteinet med avseende på virionet membranet. Tillämpningen av denna metod kommer utan tvekan att fortsätta att kasta ljus på insvept virus struktur och patobiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).
