Identifikation af protein-protein-interaktion websteder anvendelse af peptid Arrays

Abstract

Protein-protein interaktioner medierer de fleste processer i levende celler og kontrol homeostase af organismen. Forringede protein-interaktioner kan resultere i sygdom, hvilket protein interaktioner vigtige lægemiddelmål. Det er derfor meget vigtigt at forstå disse interaktioner ved det molekylære niveau. Protein-interaktioner studeres ved hjælp af en række teknikker, der spænder fra cellulære og biokemiske analyser til kvantitative biofysiske assays, og disse kan udføres enten med proteiner i fuld længde, med proteindomæner eller peptider. Peptider tjener som fremragende værktøjer til at studere protein-interaktioner, da peptider kan let syntetiseres og tillade at fokusere på specifikke interaktion sites. Peptid arrays muliggøre identifikation af de vekselvirkningssteder mellem to proteiner samt screening for peptider, som binder målproteinet til terapeutiske formål. De tillader også højt gennemløb SAR studier. Til identifikation af bindingssteder, et typical peptid matrix indeholder sædvanligvis delvis overlappende 10-20 rester peptider afledt fra de fuldstændige sekvenser af en eller flere partnere proteiner af det ønskede målprotein. Screening array for binding af målproteinet afslører bindende peptider, der svarer til de bindingssteder i partnerlandene proteiner, på en nem og hurtig metode anvender kun lille mængde af protein.

I denne artikel beskriver vi en protokol til screening peptid arrays til kortlægning af interaktion sites mellem et target protein og dets partnere. Peptidet array er designet baseret på sekvenserne i partnerlandene proteiner under hensyntagen til deres sekundære strukturer. De arrays benyttes i denne protokol var Celluspots arrays udarbejdet af INTAVIS Bioanalytiske Instruments. Arrayet er blokeret for at forhindre uspecifik binding og derefter inkuberet med det undersøgte protein. Påvisning under anvendelse af et antistof afslører bindende peptider svarende til den specifikke interaktion sites mellem proteinerne.

Introduction

Protein-protein interaktioner medierer de fleste af de processer i den levende celle. Forringede protein-interaktioner kan resultere i sygdom, hvilket protein interaktioner vigtige lægemiddelmål. Det er derfor meget vigtigt at forstå disse interaktioner ved det molekylære niveau. Protein-interaktioner studeres ved hjælp af en række teknikker, der spænder fra cellulære og biokemiske analyser til kvantitative biofysiske assays, og disse kan udføres enten med proteiner i fuld længde, med proteindomæner eller peptider. Peptider tjener som fremragende værktøjer til at studere protein-interaktioner. Dette er fordi peptider kan let syntetiseres og tillade fokusere på en bestemt interaktion sted på den ene side og på flere protein-targets i en high throughput måde på den anden side ^1,2. Peptid-array screening er en hurtig, let at udføre fremgangsmåde til opnåelse af en stor mængde data om samspillet mellem et målprotein med mange partnere i en kort tid ³. I modsætning til andre biokemiske eller biofysiske metoder til påvisning og analyse af protein-protein interaktioner, peptid-array screening kræver en meget lav koncentration af protein og kan detektere meget svag binding. Peptid-arrays kan anvendes til mange anvendelser på peptid-protein-interaktioner, såsom kortlægning af protein-protein eller receptor-ligand-interaktion sites ^4, homo- eller hetero-oligomerisering grænseflader, der kendetegner antistoffer epitoper ^5, studerer enzymaktiviteter ⁶ og high throughput struktur- aktivitet relationer (SAR) Undersøgelser ^7. For en grundig gennemgang om peptid-array screening se Katz et al. ⁴

Flere typer af peptid-arrays i øjeblikket eksisterer. Der er to store syntetiske strategier til fremstilling af peptid-arrays: syntese af peptiderne før knytter dem til den faste bærer, eller syntese af peptider direkte på den faste støtte, især via SPOT teknik ^4,8. Densyntetiseres peptider på den faste bærer sædvanligvis med 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) kemi ^8. Blandt de almindelige syntetiske ordninger er peptid-binding gennem N-terminalen (f.eks JPT pepstar arrays ⁹⁾ og peptid binding gennem C-terminalen (f.eks PEPSCAN pepchip arrays ^10, JPT pepspot arrays ⁹ og INTAVIS celluspot arrays ^{11) 4.} Den faste bærer kan variere, og det gør kemi peptidkobling til det. Cys-terminerede peptider kan bindes til objektglas via thiolgruppen ^12. N-terminalen af et peptid kan være kovalent bundet til en hydroxylgruppe på cellulosemembran gennem esterificering af aminosyren bundet ^8.

Her præsenteres en detaljeret protokol til screening peptid arrays som en fremgangsmåde til at studere protein-protein-interaktioner. Array vi brugte er Celluspots array, som er en mikro-array indeholdende store amoUNT af pletter (dubletter på op til 384 pletter) på en lille cellulose membran, der understøttes af en glasplade. Dette gør det muligt at arbejde med små mængder af protein og antistoffer og opnåelse betydelig mængde data pr enkelt eksperiment. Denne matrix indeholder også høj tæthed peptid, der tillader detektering af lav affinitetsbinding. Grupperingen blev anvendt til kortlægning af STIL-CHFR interaktion, der er meget vigtig for at styre normal celleproliferation ^13. Ukontrolleret interaktion mellem de to proteiner kan føre til udvikling af cancer. Ved at kortlægge denne interaktion fandt vi specifikt bindingssted og bindende resterne ^14. Dette baner vejen for at designe rationelle, som hæmmer denne protein-protein interaktion.

Protocol

1. Design af et peptid Array

1. Opdele sekvensen af ​​målproteinet i delvis overlappende 10-20 rester peptider. Varier mængden af ​​overlapning på konkrete eksperiment og ressourcerne i at udføre lab, men i princippet jo længere overlapper bedre. Ved udformningen af ​​peptiderne tage hensyn kendt sekundær struktur elementer i det protein, der kan være ansvarlig for interaktionen.
2. Bestil designet peptid-array gennem kommercielle leverandører. Her, brug peptider kovalent bundet til matrix via C-terminalen.

2. Blokering af ikke-specifik binding

1. Lav en 50 mM Tris eller phosphatpuffer indeholdende 0,05% Tween 20 (TBST / PBST) og juster til den ønskede pH-værdi med en afmålt mængde af HCI eller NaOH (for at kende den præcise ionstyrke) og den ønskede ionstyrke med NaCl . Her, brug en pH-værdi på 7,5 og en ionstyrke på 150 mM.
2. Lav en blokerende opløsning af2,5% (vægt / volumen) skummetmælkspulver i TBST / PBST.
3. At forhindre ikke-specifik binding, nedsænkes array i 5 ml blokerende opløsning. Inkubér array i 2-4 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C på et rysteapparat.

3. Inkubation med protein

1. Vask array først med 5 ml blokerende opløsning i 30 sekunder og derefter to gange med 5 ml TBST / PBST i 5 minutter på et rysteapparat ved stuetemperatur.
2. Inkubere vasket array med 5 ml His-mærket protein opløsning indeholdende 2,5% (vægt / volumen) skummetmælkspulver for at forhindre ikke-specifik binding. Her bruge 4,5 uM af protein-opløsning (STIL 500-650) opløst i den beskrevne blokerende opløsning.
   BEMÆRK: Normalt 5-10 pM protein anvendes til screening, men proteinkoncentrationen kan være endog så lavt som 2-3 uM, afhængigt af bindingsaffiniteten og de lokale koncentrationer af peptider, der er bundet på arrayet (effektiviteten af syntese). Pufferen, i hvilken proteinetopløses kan variere, men er almindeligt at fortynde protein ved samme blokerende opløsning beskrevet ovenfor.
3. Inkubér array i proteinopløsningen for 3-8 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 * C.

4. Inkubation med antistof

1. Vask array tre gange med 5 ml TBST / PBST. Den første vask er for 30 sec efterfulgt af to 5 minutters vaske på rysteapparat ved stuetemperatur.
2. Inkubere vasket array med 5 ml fortyndet HRP-konjugeret antistof (1: 1.500) i en inkubationspuffer, der indeholder de samme bestanddele ved de samme koncentrationer som blokerende opløsning i 1 time på et rysteapparat ved stuetemperatur. Antistoffet kan enten binde målproteinet eller tag.
3. Udføre kontrolforsøg test af interaktionen af antistoffet med peptider på arrayet, især hvis arrayet indeholder peptider fra målproteinet (fx for oligomerisering undersøgelser) ved at gentage den samme protokol uden step 3, inkubering med proteinet.
4. Vask array tre gange med 5 ml TBST / PBST. Den første vask er for 30 sec efterfulgt af to 5 minutters vaske på rysteapparat ved stuetemperatur.

5. Læsning af Array

1. Udføre kemiluminescens udvikling med ECL western blotting substrat kit.
2. Udføre detektion med et luminescerende billede analysatoren.
3. Analysere resultaterne. Kontroller, at begge dubletter på arrayet viser de samme signaler, så resultaterne er pålidelige. Hvis strukturen af ​​proteinet partner er kendt, søg på strukturen for de bindende peptider og se efter bindingssteder. Selv peptider, der er langt i sekvensen kan være tæt sammen i den tertiære struktur og skabe et bindingssted.

Representative Results

STIL er et særdeles vigtigt centrosomal protein. Det styrer normal celledeling og celleproliferation ^{13,15 - 19.} STIL interagerer med adskillige proteiner ^18,20,21, og de ​​fleste af interaktioner forekommer gennem sin centrale del, som er en iboende uordnet region (IDR) ^14. Vi har designet et array bestående af peptider afledt fra STIL bindende protein CHFR. CHFR er en tumor suppressor, der induceres som reaktion på stress mitotiske ^22. Da strukturen af ​​STIL bindende domæne af CHFR var ukendt på det tidspunkt, vi delte proteindomæne til 15 rester lange peptider med overlap på 7 rester, som beskrevet i trin 1.1 i protokollen. Vi udførte et peptid-array screening for at identificere de CHFR-STIL bindingssteder, som beskrevet i ovenstående protokol og illustreret i figur 1. Vi brugte en INTAVIS Celluspot vifte bestående af 384 peptider i dubletter, som kan give en enorm mængde information som vist i figur 2. Brug af dette peptid matrix vi fandt bindingsstederne for STIL i dets bindingsprotein CHFR (figur 3). Hver sort plet i arrayet repræsenterer en CHFR afledt peptid, der bandt STIL. Bemærk, at hvert peptid vises to gange siden det findes i to eksemplarer, som kontrollerer pålideligheden af ​​resultaterne. Samspillet mellem STIL og CHFR blev tidligere vist på proteinniveau ^13,14. Peptidet matrix screening viste 7 CHFR-afledte peptider, der bandt STIL IDR, resterne 500-650 (Figur 3, Amartely ¹⁴ et al.). Disse resultater tilladt os at kortlægge bindingssted STIL på CHFR. På trods af afstanden af disse syv peptider på CHFR primære sekvens de skaber en veldefineret bindingssted for STIL i CHFR (figur 4) ^14.

7 / 52097fig1highres.jpg "/>
Figur 1: En ordning af peptid-array screening A- Design af et peptid array, der består af delvis overlappende peptider afledt af en eller flere partnerorganisationer proteiner, under hensyntagen til deres sekundære strukturer;. B- Inkubering med målproteinet; C- Inkubering med et antistof til detektion; D- Detection (kan gøres ved kemiluminescens, fluorescens, etc.); E- analysere resultaterne for at afsløre det protein binding sites. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2:. Et eksempel på peptid-array screening Detection opnås ved anvendelse af kemiluminescens Slæden indeholder to identiske arrays som dubletter..es / ftp_upload / 52.097 / 52097fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3: Screening et peptid matrix til binding af STIL IDR til CHFR protein: 4,5 uM His-mærkede STIL 500-650 blev screenet for binding af array. Hver sort plet indikerer binding mellem STIL fragmentet og CHFR peptid ^14. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4: STIL bindende websted i CHFR vist på strukturen af CHFR Cys rige domæne (resterne 424-661, FBF ID: 2XPO) De syv.peptider, der er bundet STIL i peptidet matrix screening kan opdeles til tre regioner farvede pink, orange og rød, som er fjernt i den primære sekvens, men tæt sammen i 3D-struktur skaber et bindingssted. Denne fulde region danner en bindende lomme for STIL i dimer CHFR ^14. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Discussion

Peptid-array screening er et fremragende redskab til at identificere de bindende steder af et target protein i dets partnere. Denne analyse er hurtig og let at udføre, og resultaterne kan opnås i en eller to arbejdsdage. Peptid matrix screening er alsidig og kan bruges til mange formål. Det kan bruges til karakterisering af post-translationelle modifikationer såsom phosphorylering og identificere substrater af kinaser. For eksempel: FLT3 kinase, der er relateret til akut myeloid leukæmi, phosphorylerer Tyr-indeholdende substratpeptider fundet af et peptid-array screening ^6. De inhiberende egenskaber af tyrosinkinaseinhibitorer pazopanib og lapatinib blev testet under anvendelse af peptid-array screening ^23. Peptider array kan anvendes til at identificere de steder, der medierer protein-protein interaktioner. Eksempler på sådanne proteiner undersøgt i vores laboratorium ved hjælp af denne metode: interaktionen mellem HIV-1 Vif protein og cellulær A3G protein blev karakteriseret osing et peptid matrix ^24; peptid-array screening blev anvendt til at undersøge samspillet af anti-apoptotiske Bcl-2-familien med pro-apoptotisk protein ASPP2 ²⁵ og til at undersøge bindingen af tBID, et medlem af BCL-2-familien, med mitokondrieprotein MTCH2 ^26; intra-molekylær interaktion mellem Myosin IIC domæner blev analyseret under anvendelse af peptid-array screening ^27. Her præsenterer vi et eksempel på, hvordan vi brugte peptid-array screening for at identificere de steder, som medierer STIL-CHFR interaktion, en protein-protein interaktion vigtig i proliferation og cancer ^14. Afslører nøjagtige bindingssted kan tjene som grundlag for en rationel udformning af inhibitorer af den undersøgte interaktion.

Peptidet matrix screening er ikke en kvantitativ analyse. Det er semikvantitative, idet mængden af ​​peptid i hver plet på arrayet varierer på grund af forskel i syntesen udbytte og peptidrenhed. Dette afhænger igen Peptide sekvens, længde, etc. Variationen i udbytte og renhed kan også føre undertiden falske negative eller falsk positive resultater. Kan foretages en sammenligning mellem intensiteterne i samme matrix, hvilket resulterer i semi-kvantitativ ranking. Men en sådan sammenligning mellem forskellige arrays eller forskellige eksperimenter med samme array ikke er pålidelig. At kvantificere binding bør peptider fundet i peptid-array screening syntetiseres og testet for binding af målproteinet ved hjælp af biofysiske metoder såsom fluorescensanisotropi, isotermiske titrering kalorimetri (ITC), overfladeplasmonresonans (SPR), etc. Sådanne assays er ikke altid følsomme over for svag binding, da de kræver en høj koncentration af protein til at påvise en sådan binding. Peptidet matrix screening, på den anden side, er meget følsom over for svag binding. Således er nogle af de observerede interaktioner i array screening kunne ikke observeres eller kvantificeres ved hjælp af fremgangsmåder, såsom fluorescens anisot ropy ^14. Det faktum, at peptid-array screening kræver meget lave koncentrationer af protein kombineret med den høje følsomhed af assayet gør peptidet matrix en nyttig metode til screening af protein-peptid-interaktioner i en bred vifte af tilhørsforhold.

Falske negative resultater kan også skyldes det faktum, at lineære peptider ikke korrekt repræsentere 3D-strukturen af ​​bindingsstedet i proteinet. Dette er dog ikke et problem med uløseligt uordnede proteiner, som er godt repræsenteret af peptider. Falske positive resultater kan også være forårsaget af binding af antistoffet til arrayet. Disse kan detekteres ved at udføre et kontrolforsøg som beskrevet i protokollen afsnit 4.3. Falske negative resultater kan også opnås, hvis det protein-epitop, der genkendes af antistoffet blive eksponerede ved binding til peptidet array. Dette problem er ikke almindelige, men kan løses ved anvendelse af et polyklonalt antistof mod proteinet.

jove_content "> Peptid-array screening kan også anvendes til at forbedre bly peptider, herunder alanin scanning og SAR studies ^7. Når bindingsstedet af målet er kendt, kan en matrix baseret på dens sekvens være udformet med flere modifikationer inklusive udskiftning af hver rest til alanin (Ala-scanning) for at identificere vigtige rester for interaktionen. På lignende måde kan SAR undersøgelser udføres ved at ændre forskellige egenskaber for bindende peptider. Disse indbefatter at variere længden af ​​peptidet, der erstatter rester af tilsvarende D aminosyrer og andre modifikationer, såsom methylering, glycosylering og erstatning med ikke-naturlige aminosyrer. Sådanne modificerede peptider, alle baseret på en målsekvens, kan syntetiseres på en række og screenet for binding af målprotein i en hurtig og nem eksperiment , giver et væld af information til at forbedre en potentiel inhibitor og forståelsen af ​​den molekylære mekanisme for interaktionen.

4. Peptidet vifte beskrevet heri er kun til engangsbrug og kan ikke genbruges.

Protokollen præsenteres her viser den brede anvendelighed af peptid arrays. Ved hjælp af et korrekt konstrueret array, kan identificeres bindingssteder mellem to proteiner i detaljer. Når bindingsstedet er velkarakteriseret det kan anvendes som et lægemiddel målsted for at inhibere relevante protein-protein-interaktion. Baseret på de bindende peptider fundet i array screening kan inhibitoriske små molekyler konstrueres og screenes som lægemiddelkandidater.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptide array	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Antibody (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Biological industries	20-500-120
Skim Milk	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	FUJI film