Identifiera protein-proteininteraktion webbplatser Använda peptid Arrays

Abstract

Protein-proteininteraktioner förmedlar de flesta processer i levande celler och kontroll homeostas av organismen. Osäkra proteininteraktioner kan leda till sjukdom, vilket gör proteininteraktioner viktiga målproteiner. Det är därför mycket viktigt att förstå dessa interaktioner på molekylär nivå. Protein interaktioner studeras med hjälp av olika tekniker, från cellulära och biokemiska analyser av kvantitativa biofysiska analyser, och dessa kan utföras antingen med fullängdsproteiner, med proteindomäner eller med peptider. Peptider fungerar som utmärkta verktyg för att studera proteininteraktioner eftersom peptider lätt kan syntetiseras och låta fokus på specifika interaktionsplatser. Peptid arrayer möjliggör identifiering av interaktionsställen mellan två proteiner samt screening för peptider som binder målproteinet i terapeutiskt syfte. De gör det också hög kapacitet SAR studier. För identifiering av bindningsställen, en typical peptiduppställningen innehåller vanligtvis delvis överlappande 10 till 20 rester peptider härledda från de fullständiga sekvenserna för ett eller flera partnerproteiner av den önskade målproteinet. Screening arrayen för bindning målproteinet avslöjar bindande peptider, som motsvarar bindningsställena i partnerproteiner, i en enkel och snabb metod med användning av endast små mängder av protein.

I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för screening peptid arrayer för att kartlägga interaktionsställen mellan ett målprotein och dess partners. Peptiduppställningen är utformad baserat på sekvenserna för de partnerproteiner med beaktande av deras sekundära strukturer. De arrayer används i detta protokoll var Celluspots matriser utarbetats av INTAVIS Bioanalytiska Instruments. Matrisen är blockerad för att förhindra ospecifik bindning och inkuberades därefter med det studerade proteinet. Detektering med användning av en antikropp avslöjar bindande peptider som motsvarar de specifika interaktionsställen mellan proteinerna.

Introduction

Protein-proteininteraktioner förmedlar de flesta av de processer i den levande cellen. Osäkra proteininteraktioner kan leda till sjukdom, vilket gör proteininteraktioner viktiga målproteiner. Det är därför mycket viktigt att förstå dessa interaktioner på molekylär nivå. Protein interaktioner studeras med hjälp av olika tekniker, från cellulära och biokemiska analyser av kvantitativa biofysiska analyser, och dessa kan utföras antingen med fullängdsproteiner, med proteindomäner eller med peptider. Peptider fungerar som utmärkta verktyg för att studera proteininteraktioner. Detta beror på att peptider kan lätt syntetiseras och tillåta den att fokusera på en specifik interaktionsstället på ena sidan och på flera proteinmål i en hög genomströmning sätt å andra sidan ^1,2. Peptid array screening är en snabb, enkel att utföra metoden för att erhålla en stor mängd data om samspelet mellan ett målprotein med många partners på kort tid ³. Till skillnad från andra biokemiska eller biofysikaliska förfaranden för detektion och analys av protein-proteininteraktioner, kräver peptiduppställningen screening en mycket låg koncentration av protein och kan detektera mycket svag bindning. Peptid matriser kan användas för många tillämpningar inom peptid-protein-interaktioner, såsom kartläggning av protein-protein eller receptor-ligand interaktionsställen ^4, homo- eller hetero-oligomerisering gränssnitten, kännetecknande antikroppar epitoper ^5, studerade enzymaktiviteter ⁶ och hög genomströmning struktur- aktivitetssamband (SAR) studerar ^7. För en fördjupad översyn om peptid array screening se Katz et al. ⁴

Flera typer av peptid arrayer existerar idag. Det finns två stora syntetiska strategier för att göra peptid arrayer: syntes av peptiderna innan de kopplas till det fasta underlaget, eller syntes av peptider direkt på det fasta underlaget, främst med hjälp av SPOT-teknik ^4,8. DenPeptiderna syntetiseras på den fasta bäraren vanligtvis med 9-fluorenylmetyloxikarbonyl (Fmoc) -kemi ^8. Bland de gemensamma syntesscheman är peptid fastsättning med N-terminalen (t.ex. JPT Pepstar arrayer ⁹⁾ och peptid fastsättning med C-terminalen (t.ex. PEPSCAN pepchip arrayer ^10, JPT pepspot arrayer ⁹ och INTAVIS celluspot arrayer ^{11) 4.} Den fasta bäraren kan variera och så gör kemin i peptidkoppling till den. Cys-terminerade peptider kan bindas till objektglas via tiolgruppen ^12. N-terminalen av en peptid kan vara kovalent bunden till en hydroxylgrupp på cellulosamembran genom förestring av aminosyran fäst ^8.

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för screening av peptiduppsättningar som en metod för att studera protein-proteininteraktioner. Arrayen vi använde är Celluspots array, som är en mikro-array som innehåller stor amount av fläckar (dubbletter på upp till 384 punkter) på en liten cellulosamembran som stöds av en glasskiva. Detta gör det möjligt att arbeta med låga volymer av protein och antikroppar och få betydande mängd data per enda experiment. Denna samling innehåller också hög peptiddensitet som möjliggör detektion av låg affinitetsbindning. Matrisen användes för att kartlägga den STIL-CHFR växelverkan, som är mycket viktig för att reglera normal cellproliferation ^13. Okontrollerad interaktion mellan de två proteinerna kan leda till utveckling av cancer. Genom att kartlägga denna interaktion fann vi det specifika bindningsstället och bindande resterna ^14. Detta banar väg för att utforma rationella hämmare som hämmar detta protein-proteininteraktion.

Protocol

1. Utforma en peptid Array

1. Dela upp sekvensen av målprotein i delvis överlapp 10-20 rester peptider. Variera mängden överlappning på den specifika experimentet och de resurser som utför lab, men i princip längre överlappn desto bättre. Vid utformningen av peptiderna tar hänsyn till kända sekundärstrukturelement i proteinet som kan vara ansvarig för interaktionen.
2. Beordra utformade peptiduppställningen via kommersiella leverantörer. Här använder peptider som är kovalent bunden till matrisen genom C-terminalen.

2. Blockering Icke-specifik bindning

1. Gör en 50 mM Tris eller fosfatbuffertlösning innehållande 0,05% Tween 20 (TBST / PBST) och justera till önskat pH med en uppmätt mängd av HCl eller NaOH (för att veta den exakta jonstyrka) och den önskade jonstyrkan med NaCl . Här använder ett pH av 7,5 och en jonstyrka av 150 mM.
2. Gör en blockeringslösning av2,5% (vikt / volym) skummjölkspulver i TBST / PBST.
3. För att förhindra icke-specifik bindning, doppa matrisen i 5 ml av blockeringslösning. Inkubera arrayen för 2-4 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C på en skakare.

3. Inkubation med protein

1. Tvätta arrayen först med 5 ml av en blockeringslösning för 30 sekunder och sedan två gånger med 5 ml TBST / PBST under 5 min på en skakanordning vid rumstemperatur.
2. Inkubera tvättades matrisen med 5 ml av His-inmärkta proteinlösning innehållande 2,5% (vikt / vol) skummjölkspulver för att förhindra icke-specifik bindning. Här använder 4,5 iM av proteinlösning (STIL 500-650) löst i den beskrivna blockerande lösningen.
   OBS: Vanligtvis 5-10 uM protein används för screening, men proteinkoncentrationen kan vara så lågt som 2-3 iM, beroende på bindningsaffiniteten och de lokala koncentrationerna av de peptider som är bundna på matrisen (effektiviteten av syntes). Den buffert i vilken proteinetupplöses kan variera men är vanligt att späda ut proteinet med användning av samma blockeringslösning som beskrivits ovan.
3. Inkubera matrisen i proteinlösningen för 3-8 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.

4. Inkubation med antikropp

1. Tvätta arrayen tre gånger med 5 ml TBST / PBST. Den första tvätten är för 30 sek, följt av två 5 min tvättar på skak vid rumstemperatur.
2. Inkubera tvättades matrisen med 5 ml utspädd HRP-konjugerad antikropp (1: 1500) i en inkubationsbuffert som innehåller samma ingredienser i samma koncentrationer som blockeringslösningen, under 1 h på en skakanordning vid rumstemperatur. Antikroppen kan binda antingen målproteinet eller etiketten.
3. Utföra kontrollexperiment testa interaktionen av antikroppen med peptiderna på matrisen, speciellt om arrayen innehåller peptider från målproteinet (t.ex. för oligomerisering studier) genom upprepning av samma protokoll utan stesid 3, inkubering med proteinet.
4. Tvätta arrayen tre gånger med 5 ml TBST / PBST. Den första tvätten är för 30 sek, följt av två 5 min tvättar på skak vid rumstemperatur.

5. Läsa Array

1. Utför kemiluminiscens utveckling med en ECL western blotting substrat kit.
2. Utföra detektion med ett luminiscent bildanalysator.
3. Analysera resultaten. Kontrollera att båda dubbletter på matrisen visar samma signaler, så resultaten är tillförlitliga. Om strukturen av proteinpartner är känd, söker på en struktur för de bindande peptider och leta efter bindningsställen. Även peptider som är långt i sekvensen kan vara nära varandra i den tertiära strukturen och skapar ett bindningsställe.

Representative Results

STIL är en mycket viktig centrosomal protein. Den styr normal celldelning och celltillväxt ^{13,15 - 19.} STIL interagerar med flera proteiner ^18,20,21, och de flesta av interaktioner sker genom dess centrala del, vilket är en i sig oordnad region (IDR) ^14. Vi har utformat en matris bestående av peptider härledda från STIL-bindande protein CHFR. CHFR är en tumörsuppressor som induceras som svar på mitotisk stressen ^22. Eftersom strukturen i STIL bindande domänen i CHFR var okänd när vi delade proteindomän till 15 rester långa peptider med överlappning av 7 rester, som beskrivs i steg 1.1 i protokollet. Vi utförde en peptid array screening för att identifiera de CHFR-STIL bindningsställen, som beskrivs i ovanstående protokoll och illustreras i figur 1. Vi använde en INTAVIS Celluspot array bestående av 384-peptider i dubbletter, vilket kan ge en enorm mängd information som visas i figur 2. Med denna peptid array vi hittat bindningsställen för STIL i dess bindande protein CHFR (Figur 3). Varje svart fläck i arrayen representerar en CHFR härledd peptid som band STIL. Observera att varje peptid visas två gånger eftersom den existerar i två exemplar, vilket verifierar tillförlitligheten av resultaten. Samspelet mellan STIL och CHFR har tidigare visats på proteinnivå ^13,14. Peptiduppställningen screening avslöjade 7 CHFR-härledda peptider som band STIL IDR, resterna 500-650 (fig 3, Amartely et al., ^14). Dessa resultat tillät oss att kartbindningsstället för STIL på CHFR. Trots avståndet till dessa 7 peptider på CHFR primära sekvensen skapar en väldefinierad bindningsställe för STIL i CHFR (Figur 4) ^14.

7 / 52097fig1highres.jpg "/>
Figur 1: Ett system för peptid array screening A- Utforma en peptid array som består av delvis överlappande peptider härledda från en eller flera partnerproteiner, med hänsyn till deras sekundära strukturer;. B- inkubering med målproteinet; C- Inkubation med en antikropp för detektion; D- Detection (kan göras genom kemiluminescens, fluorescens, etc); E- Analysera resultaten att avslöja proteinbindningsställen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2:. Ett exempel på peptid array screening Detection uppnås med kemiluminiscens Bilden innehåller två identiska matriser som dubbletter..es / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Screening en peptid array för bindning av STIL IDR till CHFR protein: 4,5 iM His-märkt STIL 500-650 screenades för bindning matrisen. Varje svart fläck indikerar bindning mellan STIL fragmentet och CHFR peptid ^14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: STIL bindande site i CHFR visas på struktur CHFR Cys rika domän (rester 424-661, PDB ID: 2XPO) De sju.peptider som band STIL i peptid array screening kan delas till tre regioner färgade rosa, orange och rött, som ligger långt bort i den primära sekvensen men tätt tillsammans i 3D-strukturen skapar ett bindningsställe. Denna fullständiga region bildar en bindande ficka för STIL i dimer CHFR ^14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Peptid array screening är ett utmärkt verktyg för att identifiera bindningsställena för ett målprotein i sina partners. Denna analys är snabb och enkel att utföra och resultatet kan uppnås i en eller två arbetsdagar. Peptid array screening är mångsidiga och kan användas för många ändamål. Den kan användas för att karakterisera post modifieringar översättnings såsom fosforylering och identifiera substrat av kinaser. Till exempel: FLT3-kinas, som är relaterad till akut myeloisk leukemi, fosforylerar Tyr-innehållande substrat peptider har hittats av en peptid array screening ^6. De hämmande egenskaperna hos tyrosinkinashämmare pazopanib och lapatinib testades med peptid array screening ^23. Peptider array kan användas för att identifiera de områden som förmedlar protein-proteininteraktioner. Exempel på sådana proteiner som studerats i vårt laboratorium med användning av denna metod är: interaktionen mellan HIV-1 Vif-protein och cellulär A3G proteinet karakteriserades ossing en peptid array ^24; peptid array screening användes för att studera interaktion mellan antiapoptotiska BCL-2-familjen med den pro-apoptotiska ASPP2 protein ²⁵ och att studera bindningen av tBID, en medlem av BCL-2-familjen, med den mitokondriella proteinet MTCH2 ^26; samspelet inom molekylär mellan myosin IIC domäner analyserades med hjälp av peptid array screening ^27. Här presenterar vi ett exempel på hur vi använt peptid array screening för att identifiera de webbplatser som förmedlar STIL-CHFR interaktion, en protein-proteininteraktion viktiga i proliferation och cancer ^14. Avslöjar den exakta bindningsstället kan tjäna som grund för rationell design av inhibitorer av den studerade interaktionen.

Peptiden array screening är inte en kvantitativ analys. Det är semi-kvantitativ eftersom mängden peptid i varje fläck på matrisen varierar på grund av skillnaden i syntesutbyte och peptidrenhet. Detta i sin tur beror på Peptide sekvens, längd, etc. Variationen i utbyte och renhet kan också leda ibland falskt negativa eller falskt positiva resultat. Jämförelse mellan intensiteterna inom samma matris kan göras, vilket resulterar i semi-kvantitativ rankning. Men en sådan jämförelse mellan olika matriser eller olika experiment med samma array är inte tillförlitlig. För att kvantifiera bindningen bör peptiderna som finns i peptid array screening syntetiseras och testas för bindning målproteinet använder biofysiska metoder såsom fluorescensanisotropi, isotermisk titrering kalorimetri (ITC), ytplasmonresonans (SPR), etc. Sådana analyser är inte alltid känslig för svag bindning eftersom de kräver en hög koncentration av proteinet för att detektera sådan bindning. Peptiduppställningen screening, å andra sidan, är mycket känslig för svag bindning. Således, en del av de observerade interaktioner i arrayen screening inte kunde observeras eller kvantifieras med användning av metoder såsom fluorescens anisot ropy ^14. Det faktum att peptid array screening kräver mycket låga koncentrationer av protein i kombination med den höga känsligheten för analysen göra peptiduppställningen en användbar metod för screening av protein-peptid-interaktioner i ett brett område av affiniteter.

Falskt negativa resultat kan också bero på det faktum att linjära peptider inte ordentligt kan representera 3D-strukturen för bindningsstället i proteinet. Detta är dock inte ett problem med egen oordnade proteiner, som är väl representerade av peptider. Falskt positiva resultat kan också orsakas av bindning av antikroppen till arrayen. Dessa kan detekteras genom att utföra ett kontrollexperiment som beskrivs i protokollet avsnitt 4,3. Falskt negativa resultat kan också erhållas om proteinet epitop som känns igen av antikroppen blir oexponerad vid bindning till peptiduppställningen. Detta problem är inte vanligt, men kan lösas genom användning av en polyklonal antikropp mot proteinet.

jove_content "> Peptiden array screening kan även användas för att förbättra ledningen peptider, däribland alanin skanna och SAR-studier ^7. När bindningsstället för målet är känd, kan en matris baserad på dess sekvens utformas med flera modifieringar inklusive utbyte av varje återstoden för alanin (Ala scan) för att identifiera de viktiga rester för växelverkan. På ett liknande sätt kan SAR-studier utförs genom att ändra olika egenskaper hos de bindande peptider. Dessa inkluderar att variera längden hos den peptid, som ersätter rester av motsvarande D -aminosyror och andra modifieringar, såsom metylering, glykosylering och ersättning med icke-naturliga aminosyror. Sådana modifierade peptider, alla baserade på en målsekvens, kan syntetiseras på en matris och screenas för bindning till målproteinet i en snabb och enkel experiment , tillhandahåller en stor mängd information för att förbättra en potentiell inhibitor och förståelse av den molekylära mekanismen för interaktionen.

4. Peptid array beskrivs häri är endast för engångsbruk och kan inte återanvändas.

Protokollet som presenteras här visar den breda användbarheten av peptid arrayer. Med hjälp av en korrekt utformad array, kan bindningsställen mellan två proteiner identifieras i detalj. När bindningsstället är väl karakteriserad den kan användas som ett läkemedel målställe för inhibering av relevant interaktion protein-protein. Baserat på de bindande peptider som finns i arrayen screening kan hämmande småmolekyler utformas och screenas som läkemedels leder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptide array	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Antibody (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Biological industries	20-500-120
Skim Milk	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	FUJI film