Abstract
タンパク質 - タンパク質相互作用は、生物の生きている細胞および対照恒常性プロセスの大部分を媒介する。損なわれたタンパク質相互作用は、タンパク質相互作用に重要な薬剤標的を作る疾患をもたらし得る。これは、分子レベルでこれらの相互作用を理解することが非常に重要である。タンパク質相互作用は、細胞性及び生化学的アッセイから定量的な生物物理学的アッセイの範囲の様々な技術を用いて研究されており、これらは、タンパク質ドメイン、またはペプチドと、全長タンパク質のいずれかで実施することができる。ペプチドは、ペプチドを容易に合成することができるので、タンパク質相互作用を研究し、特定の相互作用部位に焦点を可能にするための優れたツールを提供。ペプチドアレイは、2つのタンパク質間の相互作用部位の同定、ならびに治療目的のために、標的タンパク質に結合するペプチドのスクリーニングを可能にする。彼らはまた、高スループットのSAR研究を可能にします。結合部位の同定のため、typi校正ペプチドアレイは、通常、部分的に、所望の標的タンパク質の1つまたは複数のパートナータンパク質の完全な配列に由来する10〜20残基の重複ペプチドが含まれています。標的タンパク質を結合するためのアレイをスクリーニングするタンパク質の少量のみを使用して簡単かつ迅速な方法では、パートナータンパク質における結合部位に対応し、結合ペプチドを明らかにする。
この記事では、標的タンパク質とそのパートナーの間の相互作用部位をマッピングするためのペプチド配列をスクリーニングするためのプロトコルを記述します。ペプチドアレイを考慮し、それらの二次構造をとるパートナータンパク質の配列に基づいて設計されている。このプロトコルで使用されるアレイは、INTAVISバイオ分析·インスツルメンツによって調製しCelluspots配列だった。アレイは、非特異的結合した後、勉強タンパク質とインキュベートを防ぐためにブロックされます。抗体を用いた検出は、タンパク質間の特定の相互作用部位に対応する結合ペプチドを明らかにする。
Introduction
タンパク質 - タンパク質相互作用は、生細胞内のプロセスの大部分を媒介する。損なわれたタンパク質相互作用は、タンパク質相互作用に重要な薬剤標的を作る疾患をもたらし得る。これは、分子レベルでこれらの相互作用を理解することが非常に重要である。タンパク質相互作用は、細胞性及び生化学的アッセイから定量的な生物物理学的アッセイの範囲の様々な技術を用いて研究されており、これらは、タンパク質ドメイン、またはペプチドと、全長タンパク質のいずれかで実施することができる。ペプチドは、タンパク質相互作用を研究するための優れたツールとして役立つ。ペプチドは容易に合成され、一方、他方の1,2-高スループット様式での複数のタンパク質標的上の特定の相互作用部位に焦点を可能にすることができるからである。ペプチドアレイスクリーニングは、短時間3に多数のパートナーと標的タンパク質との相互作用に関する大量のデータを得るための方法を実行するのは簡単、高速で。タンパク質 - タンパク質相互作用を検出し、分析するための他の生化学的または生物物理学的方法とは異なり、ペプチドアレイスクリーニングは、タンパク質の非常に低い濃度を必要とし、非常に弱い結合を検出することができる。ペプチド配列は、酵素活性6と高スループットを研究する抗体エピトープ5を特徴付ける、そのようなタンパク質-タンパク質または受容体-リガンド相互作用部位4、ホモまたはヘテロオリゴマー化インターフェースのマッピングのようなペプチド-タンパク質相互作用の多くの用途に使用することができる構造-活性関係（SAR）は7を研究。ペプチドアレイのスクリーニングについての詳細なレビューについてはカッツらを参照してください。4
ペプチドアレイのいくつかのタイプは、現在存在している。固体支持体にそれらを取り付ける前に、ペプチドの合成、または固体支持体上に直接ペプチドの合成は主に、SPOT技術の4,8を使用して、：ペプチドアレイを作製するための2つの主要な合成戦略があります。ザ·ペプチドは、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）化学8、通常、固体支持体上で合成される。一般的な合成スキームの中でC末端を介してペプチドのN末端 を介してアタッチメント（ 例えば、JPTのpepstarアレイ9）およびペプチドアタッチメントがある（ 例えば、PEPSCANのpepchipアレイ10、JPTのペプスポットアレイ9とINTAVISのcelluspotアレイ11）4。固体支持体は変わるので、それへのペプチド結合の化学を行いますことができます。システイン-末端ペプチドは、チオール基12を介してスライドガラスに付着させることができる。ペプチドのN末端 に共有結合したアミノ酸のエステル化セルロース膜上のヒドロキシル基に結合することができる8を取り付け。
ここでは、タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するための方法として、ペプチドアレイをスクリーニングするための詳細なプロトコールを提示する。私たちが使用する配列は、大規模なAMOを含むマイクロアレイであるCelluspots配列ですスライドガラスでサポートされている小さなセルロース膜上にスポット（最大384スポットの重複）のUNT。これは、低タンパク質のボリュームと抗体と協力し、一回の実験あたりのデータのかなりの量を得ることができます。この配列はまた、低親和性結合の検出を可能にする高いペプチド密度が含まれています。アレイは、正常な細胞増殖13を制御するために非常に重要であるSTIL、CHFRの相互作用をマッピングするために使用した。 2つのタンパク質間の制御されない相互作用が癌の発生につながる可能性がある。この相互作用をマッピングすることによって、私たちは、特定の結合部位を発見し、残基14を結合。これは、このタンパク質 - タンパク質相互作用を阻害する阻害剤の合理的設計のための道を開く。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.ペプチドアレイの設計
- 一部は10〜20残基の重複ペプチドへの標的タンパク質の配列を分割する。具体的な実験と行うラボのリソースにオーバーラップの量を変化させるが、原理的にはより長いオーバーラップがより良い。ペプチドを設計する場合の相互作用を担当することができるタンパク質の二次構造要素を知ら考慮する。
- 商業ベンダーを通じて設計されたペプチドアレイを注文。ここでは、共有結合C末端を通じてアレイに結合したペプチドを使用しています。
2.非特異的結合をブロック
- NaClで0.05％のTween 20（TBST / PBST）を含む50mMトリスまたはリン酸緩衝液を作り、（正確なイオン強度を知るために）のHClまたはNaOHの測定量で所望のpHに調整し、所望のイオン強度。ここでは、7.5のpHおよび150mMのイオン強度を使用しています。
- ブロッキング溶液を作っ2.5％（w / vの）をTBST / PBST中脱脂粉乳。
- 非特異的結合を防ぐために、ブロッキング溶液5mlにアレイを浸す。室温または一晩シェーカー上で4ºCで2〜4時間の配列をインキュベートする。
3.タンパク質とインキュベート
- 室温でシェーカー上で5分間5ミリリットルTBST / PBSTで二回、次に30秒間ブロッキング溶液と5mlで最初の配列を洗ってください。
- （w / v）の非特異的結合を防ぐために、脱脂粉乳、2.5％を含有するHisタグ化タンパク質溶液5mlで洗浄し、アレイをインキュベートする。ここでは、説明したブロッキング溶液中に溶解したタンパク質溶液の4.5μM（STIL 500〜650）を使用します。
NOTE：通常5-10μMタンパク質は（スクリーニングに使用されるが、タンパク質濃度は、結合親和性及びアレイで結合したペプチドの局所濃度に依存して、2-3μMでさえ低くすることができる効率合成）。バッファ内のタンパク質変化するが、上記と同じブロッキング溶液を用いてタンパク質を希釈することが一般的であることができ溶解する。 - 室温または一晩、4ºCで3-8時間、タンパク質溶液中の配列をインキュベートする。
4.抗体とインキュベート
- 5ミリリットルTBST / PBSTで配列を3回洗う。最初の洗浄は、室温でシェーカー上に2つの5分間の洗浄、続いて30秒間である。
- 室温でシェーカー上で1時間、ブロッキング溶液と同じ濃度で同じ成分を含有するインキュベーション緩衝液中で：希釈したHRP結合抗体（1,500 1）5mlで洗浄し、アレイをインキュベートする。抗体が標的タンパク質またはタグのいずれかを結合することができる。
- セントせずに同じプロトコルを繰り返すことにより、アレイは、標的タンパク質（ 例えば 、オリゴマー化のための研究）からのペプチドが含まれている場合は特に、アレイ上のペプチドと抗体との相互作用を試験する対照実験を行うp 3が、タンパク質と共にインキュベートする。
- 5ミリリットルTBST / PBSTで配列を3回洗う。最初の洗浄は、室温でシェーカー上に2つの5分間の洗浄、続いて30秒間である。
5.アレイを読む
- ECLウエスタンブロッティング基質キットで化学発光開発を行う。
- 発光画像解析装置で検出を行う。
- 結果を分析します。アレイ上の両方の重複が同じシグナルを示すので、結果は信頼性があることを確認してください。タンパク質パートナーの構造がわかっている場合、結合ペプチドのための構造上の検索および結合部位を探します。遠くの順序で並んでいても、ペプチドは、三次構造に一緒に近くなるとの結合部位を作成することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
STILは非常に重要な中心体タンパク質である。 19 -これは、正常な細胞分裂および細胞増殖13,15を制御する。 STILいくつかのタンパク質18,20,21と相互作用し、相互作用の大部分は、本質的に無秩序領域（IDR）14は 、その中央部を介して起こる。私たちは、STIL結合タンパク質CHFR由来のペプチドで構成される配列を設計しました。 CHFR応力22を有糸分裂に応答して誘導される腫瘍抑制因子である。 CHFRのSTIL結合ドメインの構造は時に不明であったため、プロトコルのステップ1.1で説明したように、私たちは、7残基の重複を有する15残基の長さのペプチドにタンパク質ドメインを分割。上記のプロトコルで詳述し、 図1に示すように、我々は、CHFR、STILの結合部位を同定するためのスクリーニングペプチドアレイを行った、我々は提供することができる二重に384のペプチドから成るINTAVIS Celluspotアレイを使用 図2に示されたように大量の情報。私たちはその結合タンパク質CHFR（ 図3）にSTILの結合部位を発見し、このペプチドアレイを使用する。配列内の各黒点はSTILをバインドCHFR由来のペプチドを表します。結果の信頼性を検証する、それが重複して存在するため、各ペプチドが二回表示されることに注意してください。 STILとCHFRの間の相互作用は、以前にタンパク質レベル13,14で実証された。ペプチドアレイスクリーニングはSTIL IDR、残基500〜650（ 図3、Amartely ら 14）に結合した7 CHFR由来ペプチドを明らかにした。これらの結果は、私たちはCHFR上STILの結合部位をマッピングすることができました。 CHFR一次配列上のこれらの7のペプチドの距離にもかかわらず、彼らは（ 図4）14 CHFRにおけるSTILのための明確に定義された結合部位を作成します。
7 / 52097fig1highres.jpg "/>
図1：ペプチドアレイスクリーニングのスキーム A-部分的に考慮し、その二次構造をとる、一つ以上のパートナータンパク質に由来するオーバーラッピングペプチドからなるペプチド配列を設計する;。標的タンパク質とインキュベートB-。検出用抗体とインキュベートC-。 D-検出は、（化学発光、蛍光等により行うことができる）。タンパク質結合部位を明らかにするために、結果を分析し、E-。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ペプチドアレイスクリーニングの例検出は化学発光を使用して達成スライドが重複として二つの同一の配列が含まれています。ES / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：CHFRタンパク質にSTIL IDRの結合のためのペプチド配列をスクリーニングは：4.5μMのHisタグSTIL 500から650は、配列を結合するためにスクリーニングした。各黒点はSTIL断片とCHFR由来ペプチド14との間の結合を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：CHFRのCysリッチドメインの構造に示さCHFRにおけるSTIL結合部位（残基424から661、PDB ID：2XPO）7。ペプチドアレイスクリーニングにおいてSTILを結合したペプチドは、一次配列に離れているが、1つの結合部位を作成する3D構造で一緒に閉じピンク、オレンジ、赤色に3つの領域に分割することができる。このフル領域はダイマーCHFR 14におけるSTILのための結合ポケットを形成している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ペプチドアレイスクリーニングは、そのパートナーで標的タンパク質の結合部位を同定するための優れたツールである。このアッセイは、実行するために迅速かつ容易であり、結果は、1つまたは2つの営業日で得ることができる。ペプチドアレイスクリーニングは汎用性があり、多くの目的に使用することができる。これは、リン酸化などの翻訳後の修飾を特徴付けるし、キナーゼの基質を同定するために使用することができる。例えば：骨髄性白血病急性する関連するFLT3キナーゼ、ペプチドアレイ6をスクリーニングすることにより発見さチロシン含有基質ペプチドをリン酸化する。チロシンキナーゼ阻害剤パゾパニブおよびラパチニブの阻害特性は、23のスクリーニングのペプチドアレイを用いて試験した。ペプチド配列は、タンパク質 - タンパク質相互作用を媒介する部位を同定するために使用することができる。この方法を使用して私たちの研究室で研究このようなタンパク質の例は：HIV-1 Vifタンパク質と細胞A3Gタンパク質間の相互作用は、私たちを特徴付けたペプチドアレイ24る。ペプチドアレイスクリーニングは、プロアポトーシスタンパク質ASPP2 25と抗アポトーシスBCL-2ファミリーの相互作用を研究し、ミトコンドリアタンパク質MTCH2 26と、tBIDを、BCL-2ファミリーのメンバーの結合を研究するために使用した。ミオシンIICドメイン間の分子内相互作用は、27のスクリーニングのペプチドアレイを用いて分析した。ここで我々はSTIL-CHFR相互作用、増殖および癌14における重要なタンパク質-タンパク質相互作用を媒介する部位を同定するためのスクリーニングペプチドアレイを使用する方法の例を提示する。正確な結合部位を明らかにすることに研究の相互作用の阻害剤の合理的設計のための基礎として役立つことができる。
ペプチドアレイスクリーニングは、定量アッセイはない。アレイ上の各スポット中のペプチドの量は、合成収率およびペプチドの純度の違いにより変化するので、それは半定量的である。これは、次にPEPTに依存IDEシーケンス、長さなど収率および純度のばらつきも偽陰性または偽陽性の結果を時々つながることができます。同じアレイ内の強度の比較は、半定量的順位付けをもたらすことができる。しかし、同じ配列を持つ異なるアレイまたは異なる実験間のこのような比較は信頼できません。結合を定量するために、ペプチド配列のスクリーニングにおいて見出さペプチドが等のようなアッセイである蛍光異方性、等温滴定熱量測定（ITC）、表面プラズモン共鳴（SPR）などの生物物理学的方法を用いて、標的タンパク質の結合のために合成し、試験されるべきである彼らはそのような結合を検出するために、タンパク質の高濃度を必要とするので弱い結合に常に敏感ではない。ペプチドアレイスクリーニングは、一方で、弱い結合に非常に敏感である。したがって、アレイのスクリーニングにおいて観察相互作用のいくつかは、蛍光anisotなどの方法を用いて観察または定量化することができなかった 14粘着性。ペプチドアレイのスクリーニングアッセイの高い感度と組み合わせたタンパク質の非常に低い濃度を必要とするという事実は、ペプチド配列の類似性の広い範囲のタンパク質 - ペプチド相互作用をスクリーニングするための有用な方法を作る。
偽陰性結果はまた、線状ペプチドが適切タンパク質における結合部位の三次元構造を表していない可能性があるという事実によるものであることができる。しかし、これはうまくペプチドによって表され本質的に無秩序タンパク質、の問題ではありません。偽陽性の結果は、アレイへの抗体の結合によって引き起こされ得る。これらのプロトコルセクション4.3で説明したように対照実験を行うことによって検出することができる。抗体によって認識されるタンパク質エピトープは、ペプチド配列に結合した際、未露光になった場合に偽陰性結果を得ることもできる。この問題は一般的ではないが、タンパク質に対するポリクローナル抗体を使用することによって解決することができる。
jove_contentは">ペプチドアレイスクリーニングはまた、アラニンスキャンとSAR 7を研究するなど、リードペプチドを向上させるために使用することができる。標的の結合部位が既知であるならば、その配列に基づいて配列がそれぞれの交換を含む複数の修飾を設計することができるアラニン（Alaのスキャン）に残留物が相互作用のための重要な残基を同定することができる。同様に、SAR試験は結合ペプチドの異なる特性を変更することによって行うことができる。これらは、ペプチドの長さを変化させることに対応するDにより残基を置換することが含まれる - アミノ酸などの非天然アミノ酸によるメチル化、グリコシル化、交換などの他の修飾を含む。このような修飾されたペプチドは、全ての標的配列に基づいて、一つの配列に基づいて合成することができ、1つ高速かつ簡単実験において、標的タンパク質の結合についてスクリーニング、潜在的な阻害剤を改善し、相互作用の分子機構を理解するための豊富な情報を提供する。4などの異なる抗体のために使用することができる。本明細書中に記載されるペプチド配列は、単一の使用のためのものであり、再利用することができない。
ここで紹介するプロトコルは、ペプチドアレイの広い有用性を実証する。正しく設計された配列を使用して、2つのタンパク質間の結合部位を詳細に特定することができる。結合部位が十分に特徴付けされたら、それは、関連するタンパク質 - タンパク質相互作用を阻害するための薬物の標的部位として使用することができる。アレイスクリーニングで発見結合ペプチドに基づいて、阻害小分子は、薬物リードとして設計され、スクリーニングされ得る。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
AFは欧州共同体の第7次フレームワーク·プログラムの下での欧州研究評議会から始まる助成金によってサポートされていました（FP7 / 2007年から2013年）/ ERCグラント契約がn 203413を°、複雑なsystems.HAバイオハイブリッドとAIのためのミネルヴァセンターがサポートされていますダリアとダン·メイダンフェローシップによるエルサレムのヘブライ大学で高度な学位学生のため。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Innovative Peptide Solutions. , http://www.jpt.com (2014).
- PEPSCAN shaping peptides to perfection. , http://www.pepscan.com (2014).
- Intavis Bioanalytical Instruments. , http://www.intavis.com (2014).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, Cambridge, England. 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a, Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
